本發(fā)明涉及一種含沸石止血凝膠敷料的制備方法，屬于醫(yī)用止血材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

沸石是呈架狀結(jié)構(gòu)的多孔性含水鋁硅酸鹽晶體的總稱。沸石具有堅(jiān)固的骨架構(gòu)造，內(nèi)部存在空穴，孔道等大體積的空隙，同時(shí)在其晶格內(nèi)部還有許多大小均一的微孔和通道，體積可占沸石體積的50%以上。微孔和通道彼此相聯(lián)，使沸石具有巨大的表面積。因此沸石具有較高的吸水率和吸水量，當(dāng)沸石用于止血材料中時(shí)，可以吸收血液中的水分，使血小板和凝血因子濃縮，達(dá)到止血的目的。利用沸石止血敷料目前已被廣泛接受，然而在制備中既能降低沸石吸水時(shí)放熱溫度又能提高其止血效果，是一項(xiàng)亟待解決的難題。

目前市場(chǎng)上所用的外用止血用品多為沸石止血粉，在使用時(shí)可直接將沸石止血粉撒在創(chuàng)傷處，但其存在以下缺點(diǎn)：第一，直接將沸石撒在患者傷口，因?yàn)榉惺瘯?huì)吸水放熱，使傷口溫度瞬間升高，容易造成傷口燒傷引起患者疼痛；第二，沸石直接撒在傷口處，完成止血后需要將其清理干凈，這不但增加了醫(yī)生清理創(chuàng)傷的難度，同時(shí)傷口殘留的沸石顆?？赡軙?huì)引起血管堵塞。因此，臨床上迫切的需要一種產(chǎn)熱少，止血速度快，安全性高的沸石止血材料，以滿足不同程度的緊急外傷的止血需求。

類人膠原蛋白（lhc）是通過發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。它是具有良好的細(xì)胞黏附性、促新細(xì)胞形成、加工性能好、無病毒隱患、水溶性好（避免了酸堿溶劑殘留帶來的細(xì)胞毒性）、排異反應(yīng)低等特性的一種良好的植入性醫(yī)療器械用生物材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種以類人膠原蛋白（lhc）和沸石作為主要原料，制備出了一種具有透氣保濕良好，止血快速且防滲透防粘連的醫(yī)用止血凝膠敷料。該方法工藝簡(jiǎn)單，制備的材料生物相容性良好，有望廣泛用于戰(zhàn)時(shí)急救包、臨床手術(shù)止血等。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種含沸石止血凝膠敷料的制備方法：在水溶性類人膠原蛋白（lhc）和沸石的混合溶液中，加入質(zhì)量比為1:3-3:1的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷水溶液以及無機(jī)鹽水溶液混合均勻，并調(diào)節(jié)溶液ph值為2-5.5，置其于水浴環(huán)境中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)得含鹽水凝膠；對(duì)交聯(lián)后的含鹽水凝膠進(jìn)行兩次高壓蒸汽處理和蒸餾水浸泡洗滌，除去無機(jī)鹽和殘留的單體交聯(lián)劑，并進(jìn)行干燥和co-60滅菌處理，獲得一種含沸石止血凝膠敷料。

上述類人膠原蛋白溶液的濃度為50-400mg/ml，沸石與類人膠原蛋白的質(zhì)量比為1：10-1：20。

所述無機(jī)鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸氫鈉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鉀、氯化鉀，無機(jī)鹽的濃度為10-350mg/ml，無機(jī)鹽水溶液的加入體積與類人膠原蛋白溶液的體積比為1:2-1:20。

上述交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物溶液和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷溶液的質(zhì)量百分比濃度均為0.1-5.0%，優(yōu)選0.5-2.0%，體積均為蛋白溶液體積的1-20%，優(yōu)選5-10%。

上述反應(yīng)液酸堿度用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)控其ph值為2-5.5；交聯(lián)反應(yīng)的溫度可為40-80℃，保持時(shí)間0.5-5h，優(yōu)選1-3h。

上述兩次高壓蒸汽處理和蒸餾水浸泡洗滌中，第一次將樣品在110-121℃下保持時(shí)間5-30min，優(yōu)選保持時(shí)間10-20min，然后超純水浸泡洗滌2-5天；第二次將樣品在110-121℃保持1-3h，優(yōu)選保持時(shí)間1.5-2.5h，然后超純水浸泡洗滌1-3天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g。

上述含沸石止血凝膠敷料的干燥方法可為真空冷凍干燥法或超臨界二氧化碳干燥法。

上述交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物依據(jù)文獻(xiàn)（catalyticreactionsinvolvingc1feedstocks:newhigh-activityzn(ii)-basedcatalystsforthealternatingcopolymerizationofcarbondioxideandepoxides,j.am.chem.soc.1998,120,11018-11019.）的方法合成獲得，其分子式如圖1所示。

本發(fā)明無菌沸石止血凝膠敷料的形成機(jī)理：蛋白質(zhì)分子含有豐富的羧基和氨基，為分子間交聯(lián)提供了兩種好的功能基團(tuán)。β-二亞胺鋅配合物分子內(nèi)螯合鋅的空軌道可與蛋白分子中的氨基形成配位鍵，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分子間交聯(lián)。β-二亞胺鋅配合物對(duì)環(huán)氧烷基具有不對(duì)稱開環(huán)催化功能，可加速1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的分子兩端環(huán)氧烷基開環(huán)并與蛋白分子中的羧基形成共價(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分子間交聯(lián)。故通過β-二亞胺鋅配合物對(duì)1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的開環(huán)催化，及兩種交聯(lián)劑對(duì)蛋白質(zhì)的分子間不同基團(tuán)間的雙交聯(lián)作用，有效實(shí)現(xiàn)和強(qiáng)化了水溶性蛋白分子間的交聯(lián)。沸石被包裹于能夠?qū)崿F(xiàn)交聯(lián)劑輔助交聯(lián)，也可以通過大量的氫鍵等實(shí)現(xiàn)分子間或分子內(nèi)的有效交聯(lián)。無機(jī)鹽的加入，有效地破壞了水溶性蛋白質(zhì)的分子外水化膜，促進(jìn)了交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)反應(yīng)，此外適量無機(jī)鹽還兼扮演了成孔劑作用，進(jìn)一步優(yōu)化了水凝膠的成孔效果。

本發(fā)明以大分子蛋白類人體膠原蛋白和沸石作為主要原料，通過摻雜無機(jī)鹽和雙功能交聯(lián)劑的協(xié)同作用，制備了一種新型的多孔水凝膠敷料。該水凝膠止血敷料止血時(shí)間進(jìn)一步縮短，平均為15-25s，可望用于戰(zhàn)時(shí)急救包、臨床手術(shù)止血等領(lǐng)域。本發(fā)明還具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明制備的沸石止血凝膠不僅可以進(jìn)一步縮短止血時(shí)間（相對(duì)于未引入沸石凝膠），其平均止血時(shí)間可達(dá)15-25s；而且徹底解決了沸石在止血過程中嚴(yán)重的放熱問題以及殘留問題。

附圖說明

圖1為合成的β-二亞胺鋅配合物的分子結(jié)構(gòu)圖；

圖2為實(shí)施例1所制備的含沸石止血凝膠敷料的外觀圖；

圖3為實(shí)施例1所制備的含沸石止血凝膠敷料的sem圖；

圖4為實(shí)施例4所制備的含沸石止血凝膠敷料對(duì)兔肝臟止血效果圖；

圖5為實(shí)施例4所使用的兩種商業(yè)化品牌的止血海綿對(duì)兔肝臟的止血效果圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1含沸石止血凝膠敷料的制備

步驟一：取10ml質(zhì)量濃度為100mg/ml的水溶性類人膠原蛋白溶液，按沸石和水溶性類人膠原蛋白質(zhì)量比為1:10加入沸石，再加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各1ml，再加入10mg/ml的kcl2ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液ph為4.5；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在50℃環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于121℃保持20min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持2h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品；

步驟四：將驟三中的濕凝膠在-80℃預(yù)凍3h后進(jìn)行真空冷凍干燥并進(jìn)行co-60輻照滅菌后即得到無菌沸石止血凝膠敷料。

圖2為本實(shí)施例所制備的含沸石止血凝膠敷料凍干樣品的外觀照片，可以看出其外觀上呈不透明乳白色，表面質(zhì)地較為光滑，呈多孔結(jié)構(gòu).本實(shí)施例制備的含沸石止血敷料的內(nèi)部掃描電鏡圖（sem圖）如圖3所示，從sem掃描電鏡圖可以看到，含沸石止血敷料的內(nèi)部呈為多孔結(jié)構(gòu)，孔壁為球形顆粒相互粘連而成，孔徑一般在幾十納米到幾個(gè)微米不等，孔結(jié)構(gòu)較為均勻且致密貫通。

通過進(jìn)一步檢測(cè)知，本實(shí)例中制備的含沸石止血凝膠敷料彈性好，抗壓縮能力強(qiáng)（最大壓縮應(yīng)變和壓縮應(yīng)力分別約為69.4%和5.9mpa），溶脹速率高(9s基本達(dá)到溶脹平衡)，孔隙率約為81.5%；細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示本實(shí)例中所制備的醫(yī)用含沸石止血凝膠敷料具有良好的生物相容性，無細(xì)胞毒副性。

實(shí)施例2含沸石止血凝膠敷料的制備

步驟一：取10ml質(zhì)量濃度為200mg/ml的水溶性類人膠原蛋白溶液，按沸石和水溶性類人膠原蛋白質(zhì)量比為1:15加入沸石，再加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各2ml，再加入10mg/ml的na2so42ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液ph為4；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在60℃水浴環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于110℃保持30min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)110℃保持3h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品。

步驟四：將驟三中的濕凝膠在-80℃預(yù)凍3h后進(jìn)行真空冷凍干燥并進(jìn)行co-60輻照滅菌后即得到無菌沸石止血凝膠敷料。

該實(shí)施例中所得的多孔水溶膠與實(shí)施例1中所得的含沸石止血凝膠敷料理化性質(zhì)和生物學(xué)性能相似。

實(shí)施例3含沸石止血凝膠敷料的制備

步驟一：取10ml質(zhì)量濃度為400mg/ml的水溶性類人膠原蛋白溶液，按沸石和水溶性類人膠原蛋白質(zhì)量比為1:20加入沸石，再加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各4ml，再加入10mg/ml的nacl2ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液ph為5；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在70℃水浴環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于121℃保持15min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持1.5h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，除去殘留交聯(lián)劑，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品；

步驟四：利用二氧化碳超臨界干燥法干燥步驟三所得的濕凝膠樣品，并進(jìn)行co-60輻照滅菌，即可得到無菌沸石止血凝膠敷料。

該實(shí)施例中所得的多孔水溶膠與實(shí)施例1中所得的含沸石止血凝膠敷料理化性質(zhì)和生物學(xué)性能相似。

實(shí)施例4沸石止血凝膠敷料的止血實(shí)驗(yàn)

選取新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立兔耳創(chuàng)傷出血和肝臟創(chuàng)傷出血模型，并選用本發(fā)明實(shí)例1中所得的沸石止血凝膠敷料與市場(chǎng)上a、b兩種品牌的止血海綿進(jìn)行止血對(duì)比試驗(yàn)。

實(shí)施例1制得的止血凝膠敷料的兔耳止血和肝臟止血性能測(cè)試可知，制備的沸石止血凝膠敷料對(duì)兔耳動(dòng)脈的平均止血時(shí)間大約為16.3s，對(duì)兔子肝臟的平均止血時(shí)間為21s，結(jié)果見表1。圖4展示了對(duì)本發(fā)明實(shí)例1中制得的沸石止血凝膠敷料對(duì)兔肝臟止血(a-c)的實(shí)驗(yàn)圖，可以明顯的看到材料止血后不僅未滲透，且未與組織未發(fā)生粘連。圖5為市場(chǎng)上主流的a、b兩種品牌的止血海綿對(duì)肝臟止血圖，其止血時(shí)間平均約為80-90s，且創(chuàng)面上的止血海綿已基本被完全滲透。

與未加入沸石的止血材料相比，實(shí)施例1制得的沸石止血凝膠敷料又進(jìn)一步的提高了止血材料的止血效率，而且止血完成后，樣品未滲血且無粘連，可直接從傷口拿下，不會(huì)因與傷口粘連而引起痛感。