本發(fā)明涉及一種基于類人膠原蛋白（lhc）和殼聚糖（cs）的多孔止血凝膠敷料的制備方法，屬于醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

因戰(zhàn)爭、交通意外、運動或疾病等因素而引起機體出現(xiàn)各種表皮或組織創(chuàng)傷而出血。近年很多研究表明，臨床上死于失血過多的病人占很大的比例，因此制備一種能快速止血而又不與組織粘連的止血材料，為了后期的搶救和治療贏得時間，是一項亟待解決的問題。

目前用于創(chuàng)傷的理想敷料的主要特性一般為：無毒、不敏感、不過敏；與傷口處貼合緊密，并具有良好的吸濕特性，能維持傷口與敷料接合面環(huán)境潮濕；不要求經(jīng)常進行更換；微生物不能透過；性價比高；提供良好的機械防護能力且與傷口不易粘附等。水凝膠是一種富含水分的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，廣泛應(yīng)用于組織工程及藥物緩釋等領(lǐng)域。相比于其他材料，水凝膠作為止血材料有著貼合性好、抗感染等優(yōu)點。然而，傳統(tǒng)水凝膠由于缺乏孔道結(jié)構(gòu)而使其止血效果差、透氣性不佳等缺點。

類人膠原蛋白（lhc）是通過發(fā)酵生產(chǎn)的人源型膠原蛋白。它是具有良好的細胞黏附性、促新細胞形成、加工性能好、無病毒隱患、水溶性好（避免了酸堿溶劑殘留帶來的細胞毒性）、排異反應(yīng)低等特性的一種良好的植入性醫(yī)療器械用生物材料。

殼聚糖具有更高的生物降解性，能抑制細菌活性，其溶解后的溶液中含有氨基（nh2⁺），這些氨基通過結(jié)合負(fù)電子來抑制細菌。cs及其衍生物不僅具有止血效果，還能夠促進上皮細胞的生長和傷口愈合。因此，止血凝膠中引入cs，可以加強止血凝膠的止血效果和促進創(chuàng)面愈合能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明以類人膠原蛋白（lhc）和殼聚糖（cs）作為主要原料，制備出了一種具有透氣保濕良好，抗菌性佳、止血快速且防滲透防粘連的醫(yī)用止血凝膠敷料。該方法工藝簡單，制備的材料生物相容性良好，有望廣泛用于戰(zhàn)時急救包、臨床手術(shù)止血等。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種防滲防粘連多孔型醫(yī)用止血凝膠敷料的制備方法：在水溶性類人膠原蛋白（lhc）和殼聚糖（cs）的混合溶液中，加入質(zhì)量比為1:3-3:1的復(fù)合交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的水溶液以及無機鹽水溶液混合均勻，并調(diào)節(jié)溶液ph值為2-5.5，置其于水浴環(huán)境中進行交聯(lián)反應(yīng)得含鹽水凝膠；對交聯(lián)后的含鹽水凝膠進行兩次高壓蒸汽處理和蒸餾水浸泡洗滌，除去無機鹽和殘留的單體交聯(lián)劑，并進行干燥和co-60滅菌處理，獲得一種防滲防粘連多孔型醫(yī)用止血凝膠敷料。

所述水溶性類人膠原蛋白（lhc）和殼聚糖（cs）按質(zhì)量比為9:1~3:1配置成質(zhì)量濃度為50-400mg/ml的混合溶液。

上述使用的無機鹽選自氯化鈉、磷酸鈉、磷酸氫鈉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硫酸鉀、氯化鉀，無機鹽的濃度為10-350mg/ml，加入體積與蛋白溶液體積的比為1:2~1:20。

上述交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物溶液和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷溶液的質(zhì)量百分比濃度均為0.1-5.0%，優(yōu)選0.5-2.0%，體積均為蛋白溶液體積的1-20%，優(yōu)選5-10%。

上述反應(yīng)液酸堿度用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)控其ph值為2-5.5；交聯(lián)反應(yīng)的溫度可為40-80℃，保持時間0.5-5h，優(yōu)選1-3h。

上述兩次高壓蒸汽處理和蒸餾水浸泡洗滌中，第一次將樣品在110-121℃下保持時間5-30min，優(yōu)選保持時間10-20min，然后超純水浸泡洗滌2-5天；第二次將樣品在110-121℃保持1-3h，優(yōu)選保持時間1.5-2.5h，然后超純水浸泡洗滌1-3天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g。

所述新型醫(yī)用止血凝膠敷料的干燥方法可為真空冷凍干燥法或超臨界二氧化碳干燥法。

上述交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物依據(jù)文獻（catalyticreactionsinvolvingc1feedstocks:newhigh-activityzn(ii)-basedcatalystsforthealternatingcopolymerizationofcarbondioxideandepoxides,j.am.chem.soc.1998,120,11018-11019.）的方法合成獲得，其分子式如圖1所示。

本發(fā)明醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的形成機理：蛋白質(zhì)分子含有豐富的羧基和氨基，為分子間交聯(lián)提供了兩種好的功能基團。β-二亞胺鋅配合物分子內(nèi)螯合鋅的空軌道可與蛋白分子中的氨基形成配位鍵，實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分子間交聯(lián)。β-二亞胺鋅配合物對環(huán)氧烷基具有不對稱開環(huán)催化功能，可加速1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的分子兩端環(huán)氧烷基開環(huán)并與蛋白分子中的羧基形成共價鍵，實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的分子間交聯(lián)。故通過β-二亞胺鋅配合物對1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷的開環(huán)催化，及兩種交聯(lián)劑對蛋白質(zhì)的分子間不同基團間的雙交聯(lián)作用，有效實現(xiàn)和強化了水溶性蛋白分子間的交聯(lián)。cs分子上有大量的羥基和氨基等活性基團，能夠?qū)崿F(xiàn)交聯(lián)劑輔助交聯(lián)，也可以通過大量的氫鍵等實現(xiàn)分子間或分子內(nèi)的有效交聯(lián)。無機鹽的加入，有效地破壞了水溶性蛋白質(zhì)的分子外水化膜，促進了交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)反應(yīng)，此外適量無機鹽還兼扮演了成孔劑作用，進一步優(yōu)化了水凝膠的成孔效果。

本發(fā)明制備了一種以大分子蛋白類人體膠原蛋白和殼聚糖作為主要原料的新型超多孔水凝膠敷料。該水凝膠敷料具有超多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率高、貫通性好且孔徑尺寸合理，能夠快速吸收血液中的水分而促進血細胞凝集實現(xiàn)快速止血。水凝膠材料表面相比于傳統(tǒng)的紗布或止血海綿，粗糙度較小，不易粘連；孔道良好的貫通性使得給藥非常方便；而材料較小的孔徑還能夠防止傷口感染。相比于未引入cs多孔凝膠，該水凝膠止血敷料止血時間進一步縮短，平均為15-25s，可望用于戰(zhàn)時急救包、臨床手術(shù)止血等領(lǐng)域。

本發(fā)明還具有以下優(yōu)點：本發(fā)明制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料具有超多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率高、貫通性好且孔徑尺寸合理，能夠快速吸收血液中的水分而促進血細胞凝集實現(xiàn)快速止血，其平均止血時間可達15-25s；敷料較小的孔徑透氣性良好且具有抗菌性能，不會引起傷口感染；孔道良好的貫通性使得給藥非常方便，有助于創(chuàng)傷修復(fù)。

附圖說明

圖1為合成的β-二亞胺鋅配合物的分子結(jié)構(gòu)圖；

圖2為實施例1所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料凍干樣品的外觀圖；

圖3為實施例1所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料凍干樣品的sem圖；

圖4為實施例1所制備的干燥的普通凝膠（左列）同本發(fā)明制備的多孔凝膠（右列）的吸水溶脹速率對比；

圖5為實施例1所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料對兔耳動脈和肝臟止血效果圖；

圖6為實施例1所使用的兩種商業(yè)化品牌的止血海綿對兔肝臟的止血效果圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的制備

步驟一：水溶性類人膠原蛋白（lhc）和殼聚糖（cs）按質(zhì)量比為9:1配置成質(zhì)量濃度為100mg/ml的混合溶液10ml。加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各1ml，再加入10mg/ml的kcl2ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液ph為4.5；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在50℃環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于121℃保持20min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持2h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品；

步驟四：將驟三中的濕凝膠在-80℃預(yù)凍3h后進行真空冷凍干燥并進行co-60輻照滅菌后即得到無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料。

對本實例中制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料進行物化性質(zhì)表征，圖2為實施例1所制備的止血凝膠敷料凍干樣品的外觀照片，其中圖a為在培養(yǎng)皿中凍干的敷料，圖b為樣品裁剪后的照片，可以看出其外觀上呈不透明乳白色，表面質(zhì)地較為光滑，呈多孔結(jié)構(gòu)。圖3為制備的多孔水凝膠止血敷料的掃描電鏡（sem）圖。sem圖顯示止血敷料內(nèi)部呈為多孔結(jié)構(gòu)，孔壁為球形顆粒相互粘連而成，孔徑一般在幾十納米到幾個微米不等，孔結(jié)構(gòu)較為均勻且致密貫通。

圖4展示的多孔凝膠與普通凝膠的吸水溶脹速率對比。其中左列為普通凝膠，右列為多孔凝膠。從圖上可以看出，普通凝膠在200s內(nèi)對接觸的水滴幾乎無吸收，而本實例制備的多孔凝膠可以在6s內(nèi)將水完全吸收。這種快速的吸水溶脹能力可以保證該多孔凝膠在止血時可以快速吸收血液水分而促使血細胞富集，進而促進止血效果。

本實例中制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料彈性好，抗壓縮能力強（最大壓縮應(yīng)變和壓縮應(yīng)力分別約為67.8%和5.4mpa），溶脹速率高(9s基本達到溶脹平衡)，孔隙率約為84.2%；細胞毒性試驗結(jié)果顯示本實例中所制備的醫(yī)用止血多孔凝膠敷料具有良好的生物相容性，無細胞毒性。

實施例2醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的制備

步驟一：水溶性類人膠原蛋白（lhc）和殼聚糖（cs）按質(zhì)量比為5:1配置成質(zhì)量濃度為200mg/ml的混合溶液10ml，加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各2ml，再加入10mg/ml的na2so42ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液ph為4；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在60℃水浴環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于110℃保持30min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)110℃保持3h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品；

步驟四：將驟三中的濕凝膠在-80℃預(yù)凍3h后進行真空冷凍干燥并進行co-60輻照滅菌后即得到無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料。

該實施例中所得的多孔水溶膠與實施例1中所得的醫(yī)用止血凝膠敷料理化性質(zhì)和生物學(xué)性能相似。

實施例3醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的制備

步驟一：水溶性類人膠原蛋白（lhc）和殼聚糖（cs）按質(zhì)量比為3:1配置成質(zhì)量濃度為400mg/ml的混合溶液10ml，加入濃度均為1%的交聯(lián)劑β-二亞胺鋅配合物和1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷各4ml，再加入10mg/ml的nacl2ml，混合均勻，并用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液ph為5；

步驟二：將步驟一中的混合溶液分裝于模具中，在70℃水浴環(huán)境下保持2h后轉(zhuǎn)入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于121℃保持15min獲得凝膠初品；

步驟三：步驟二中的初品凝膠用蒸餾水浸泡洗滌5天，每6h換一次洗滌水，除去鹽分和殘留交聯(lián)劑；將洗滌后的初品凝膠轉(zhuǎn)移至高壓蒸汽滅菌鍋中繼續(xù)121℃保持1.5h，然后再次用蒸餾水浸泡洗滌2天，除去殘留交聯(lián)劑，控制交聯(lián)劑的殘留總量低于2μg/g，獲得多孔濕凝膠樣品。

步驟四：利用二氧化碳超臨界干燥法干燥步驟三所得的濕凝膠樣品，并進行co-60輻照滅菌，即可得到無菌醫(yī)用止血多孔凝膠敷料。

該實施例中所得的多孔水溶膠與實施例1中所得的醫(yī)用止血凝膠敷料理化性質(zhì)和生物學(xué)性能相似。

實施例4醫(yī)用止血多孔凝膠敷料的止血實驗

選取新西蘭白兔為實驗動物，建立兔耳創(chuàng)傷出血和肝臟創(chuàng)傷出血模型，并選用本發(fā)明實例1中所得的止血凝膠敷料與市場上a、b兩種品牌的止血海綿進行止血對比試驗。

圖5展示了對本發(fā)明制得的止血凝膠對兔耳止血（a1~a4）和肝臟止血(b1~b4)的效果，由圖可以明顯的看到材料止血后未發(fā)生滲透且未與組織未發(fā)生粘連，本止血材料對兔耳和肝臟的止血時間分別為10-20s和15-25s。作為對肝臟止血的對比，市場上主流的a、b兩種品牌的止血海綿（圖6）基本已經(jīng)完全滲透且需要的止血時間更長，止血時間平均約為80-90s。實驗的過程與止血效果充分體現(xiàn)了該凝膠止血材料在止血方面的優(yōu)勢。

本發(fā)明制備的止血凝膠具有優(yōu)異的止血功能，主要歸因于該材料的孔隙率高，孔徑均一且貫通性好，能夠快速吸收血液中的水分，使血液中的血細胞凝結(jié)在材料表面，堵住破裂血管，實現(xiàn)快速止血，促進傷口愈合，特別適用于手術(shù)過程中造成的滲透性出血及動脈破裂造成的大量出血，同時由于材料本身孔徑小，因而還具有抑菌抗菌的特性，防止傷口感染。

本發(fā)明的內(nèi)容不限于上述實施案例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，不改變基本原理的調(diào)整均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。