本發(fā)明涉及長梗冬青苷的制藥新用途，具體涉及長梗冬青苷在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

流行性感冒病毒(簡稱流感病毒)是一種造成人及豬、禽類等動物患流行性感冒的rna病毒。其中，甲型流感病毒由于抗原性易發(fā)生變異，由其引發(fā)的甲型h1n1流感具有流行面廣、傳染性強、發(fā)病率高等特點。目前，臨床上用于預(yù)防和治療流感病毒的抗病毒藥物主要有m2離子通道抑制劑金剛烷胺類，包括金剛烷胺和金剛乙胺；以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑，包括奧司他韋和扎那米韋。它們雖然能有效控制病情，但是這兩類藥物長期服用易致病毒變異、易耐藥和存在各種副作用。

長梗冬青苷(分子式為c36h58o10)又名具棲冬青苷，可提取自冬青科冬青屬植物鐵冬青ilexrotundathunb.的干燥樹皮。屬于五環(huán)三萜類化合物，具有五環(huán)三萜母核。五環(huán)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)通式為：

式中，r為cooh、coo―β―d―葡萄糖基或其他藥學(xué)上可接受的基團。

如上結(jié)構(gòu)式，當(dāng)式中r為coo―β―d―葡萄糖基時，化合物名為長梗冬青(pedunculoside)。

目前，專利文獻cn105125567a公開了長梗冬青苷具有抗炎效果。中國專利cn101961340a公開了長梗冬青苷具有顯著的抗心律失常、心肌缺血和腦缺血作用。但尚未見關(guān)于長梗冬青苷抗流感病毒作用的研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供長梗冬青苷在制備抗流感病毒藥物中的用途，尤其是在制備抗h1n1流感病毒中的用途。

并進一步公開長梗冬青苷在制備治療由流感病毒引起的肺炎藥物中的應(yīng)用。所述流感病毒涉及甲型h1n1流感病毒。

所述的抗流感病毒藥物可制成片劑、顆粒劑、膠囊劑或滴丸劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益結(jié)果在于本發(fā)明首次公開長梗冬青苷在制備抗流感病毒藥物中的用途。經(jīng)體外細胞實驗證明，長梗冬青苷抗h1n1流感病毒的ic50值為7.6μg/ml，與陽性藥利巴韋林作用相當(dāng)。小鼠流感模型藥理實驗證實，長梗冬青苷能夠顯著降低流感感染小鼠的肺指數(shù)，并且對h1n1呈現(xiàn)一定的量效特征，表明所述化合物對流感病毒具有防治作用，可作為活性成分用于制備抗流感病毒的藥物。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面用實施例的形式提供長梗冬青苷抗流感病毒的藥理實驗結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域的新用途。同時必須說明這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1救必應(yīng)藥材提取物的制備

取救必應(yīng)藥材適量，粉碎，過1號篩，藥材加8倍量70％(體積分?jǐn)?shù))乙醇，加熱回流提取2次，每次1h，過濾，合并提取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在80℃下減壓濃縮至稠膏狀。將濃縮液轉(zhuǎn)移置減壓干燥箱中，在80℃下繼續(xù)進行干燥、粉碎，即得救必應(yīng)藥材提取物(經(jīng)液相色譜法檢測，該提取物中長梗冬青苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200mg/g)。

實施例2體外流感病毒抑制實驗

1.實驗材料

1.1受試藥物：長梗冬青苷(從救必應(yīng)中提取得到，純度＞98％)。

1.2對照藥物：利巴韋林，齊墩果酸，救必應(yīng)藥材提取物(見實施例1)

1.3病毒株：甲型h1n1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(fm/1/47株)。雞胚傳代，bsl-3(生物安全實驗室三級)實驗室內(nèi)檢測，分裝，-80℃保存。

1.4細胞模型：狗腎細胞mdck細胞

上述藥物均經(jīng)二甲基亞砜(dmso)充分溶解后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.實驗方法

2.1病毒毒力的測定

將100μl10倍系列稀釋得到的10個濃度的病毒液，每濃度設(shè)8個復(fù)孔，依次接種到長滿單層mdck細胞層的96孔板中，同時設(shè)細胞對照。37℃、5％co2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日用倒置顯微鏡觀察細胞病變(cpe)，連續(xù)觀察3天，用mtt法進行檢測,在酶標(biāo)儀570nm波長測定吸光度od值，用reed-muench法計算病毒半數(shù)感染劑量(tcid50)。

測定結(jié)果：病毒毒力tcid50為10^-5。

2.2長梗冬青苷細胞毒性測定

取mdck細胞已長成單層的96孔細胞培養(yǎng)板，傾去培養(yǎng)液，用pbs洗滌2次，加入不含血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)2倍系列稀釋(650μg/ml-5.07μg/ml)的長梗冬青苷藥液，100μl/孔，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，設(shè)正常細胞對照4孔。37℃、5％co2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，用mtt法進行檢測，在570nm波長下測出各實驗組與細胞對照組的吸收度。以對照孔為參照，計算各實驗孔細胞的活力比值。根據(jù)reed-muench法計算細胞毒性濃度cc50，整個實驗重復(fù)3次，取平均值。

測定結(jié)果：長梗冬青苷的細胞半數(shù)毒性濃度cc50>650μg/ml。

2.3長梗冬青苷抗h1n1活性測試

取mdck細胞已長成單層的96孔細胞培養(yǎng)板，傾去培養(yǎng)液，用pbs洗滌2次，加入100tcid50病毒液，100μl/孔，37℃、5％co2吸附2h。加入不含血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)2倍系列稀釋(325μg/ml-5.07μg/ml)的長梗冬青苷藥液,同時設(shè)病毒對照組、細胞對照組、陽性藥組、救必應(yīng)藥材提取物組和齊墩果酸組。在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，用mtt法進行檢測，用酶標(biāo)儀測570nm波長處的吸光度od值。按下述公式計算藥物對病毒的抑制率：病毒抑制率(％)＝(藥物處理組od均值-病毒對照組od均值)/(細胞對照組od均值-病毒對照組od均值)×100％，根據(jù)reed-muench法計算藥物對流感病毒致cpe產(chǎn)生50％抑制的濃度，即半數(shù)抑制濃度ic50，整個實驗重復(fù)3次，取平均值。

實驗結(jié)果：根據(jù)mtt結(jié)果，采用reed-muench法計算長梗冬青苷的半數(shù)抑制濃度ic50為7.6μg/ml，齊墩果酸的半數(shù)抑制濃度ic50為38.6μg/ml，救必應(yīng)藥材提取物的半數(shù)抑制濃度ic50>325μg/ml。陽性藥物利巴韋林的半數(shù)抑制濃度ic50為6.9μg/ml。

結(jié)論：長梗冬青苷在對h1n1流感病毒具有較強的抑制作用，其ic50值與利巴韋林ic50值大小接近，且比齊墩果酸以及救必應(yīng)藥材提取物ic50值都要小，證明長梗冬青苷對h1n1流感病毒的抑制作用與陽性對照藥物利巴韋林相當(dāng)，且強于齊墩果酸和救必應(yīng)藥材提取物。

實施例3體內(nèi)流感抑制實驗

1.實驗材料

1.1受試藥物：長梗冬青苷(從救必應(yīng)中提取得到，純度＞98％)。

1.2對照藥物：達菲，齊墩果酸，救必應(yīng)藥材提取物(實施例1)

1.3病毒：甲型h1n1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(fm/1/47株)。雞胚傳代，bsl-3(生物安全實驗室三級)實驗室內(nèi)檢測，分裝，-80℃保存。

2.實驗動物

balb/c小鼠體重18g-22g，80只，購自廣東省實驗動物中心。

3.實驗方法

將balb/c小鼠隨機分為8組，分別為空白對照組、模型對照組、達菲對照組、齊墩果酸組、救必應(yīng)藥材提取物組、長梗冬青苷高、中、低3個劑量組，每組10只。除空白對照組外，各實驗組動物用乙醚輕度麻醉，以15個ld50的fm1流感病毒液滴鼻感染，每只35μl。感染前一天開始灌胃給藥，每次按0.2ml/10g體重灌胃，每天1次，連續(xù)給藥5天?？瞻捉M和模型對照組在同等條件下灌胃給予等體積蒸餾水。第6天稱重后解剖，取肺，稱重量，計算肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率。

計算公式：肺指數(shù)＝肺質(zhì)量(g)/體重(g)×100％；肺指數(shù)抑制率＝(模型對照組平均肺指數(shù)－實驗組平均肺指數(shù))/模型對照組平均肺指數(shù)×100％數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法：肺指數(shù)用平均值±sd值表示，組間比較采用單因素方差分析；采用spss19.0軟件處理數(shù)據(jù)。

4.實驗結(jié)論

肺指數(shù)值越大，表示肺炎越嚴(yán)重。由表1的實驗結(jié)果顯示，本發(fā)明的長梗冬青苷能夠顯著降低流感感染小鼠的肺指數(shù)，且對h1n1呈現(xiàn)一定的量效特征，表明長梗冬青苷對流感病毒具有防治作用。此外，長梗冬青苷對于流感病毒的防治效果明顯強于齊墩果酸與救必應(yīng)藥材提取物。本發(fā)明所述的長梗冬青苷可制備用于抗流感病毒的藥物。

表1藥物對流感病毒fm/1/47株感染小鼠肺炎模型肺指數(shù)的影響(n＝10)

注：##與空白對照組比較，p<0.05，**與模型對照組比較，p<0.01。