本發(fā)明屬于聯(lián)合藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種協(xié)同抗前列腺癌的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是常見(jiàn)的致死率極高的消化道惡性腫瘤，全世界每年約有22萬(wàn)人死于此病，其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)明顯上升。在我國(guó)，胰腺癌的年發(fā)病率約為5.1例/10萬(wàn)人，每年新增約5-6萬(wàn)例。其死亡率亦迅速升高，占惡性腫瘤死因的第7-8位。為進(jìn)一步提高吉西他濱治療晚期胰腺癌的效果，許多藥物與吉西他濱聯(lián)合治療晚期胰腺癌，包括順鉑、卡培他濱、多西紫杉醇等。雖然聯(lián)合化療的有效率得到一定提高，腫瘤相關(guān)癥狀也有一定的改善，但上述藥物與吉西他濱聯(lián)合的大規(guī)模隨機(jī)臨床研究都未能顯示出比吉西他濱單藥具有更好的生存獲益，胰腺癌的化療走到了一個(gè)平臺(tái)期，如何實(shí)現(xiàn)治療效果上的突破是國(guó)內(nèi)外腫瘤界面臨的一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。吉西他濱是美國(guó)fda批準(zhǔn)的治療胰腺癌的一線藥物，它能明顯改善胰腺癌患者的生活質(zhì)量并延長(zhǎng)生存期，被譽(yù)為胰腺癌治療的金標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)吉西他濱也越來(lái)越多地被用作手術(shù)切除患者的輔助治療藥物。吉西他濱是一種脫氧核苷類似物類的前體藥，需要細(xì)胞吸收后經(jīng)過(guò)相關(guān)酶的代謝產(chǎn)生其活性代謝產(chǎn)物來(lái)發(fā)揮抗腫瘤活性。吉西他濱的活性代謝產(chǎn)物主要通過(guò)干擾dna復(fù)制，造成dna損傷并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。但是，在臨床治療中，很多的胰腺癌患者對(duì)吉西他濱有先天的或者后天獲得的化療抗性，限制了吉西他濱在臨床上的應(yīng)用效果。因此，患者對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性也是胰腺癌難以治愈的一個(gè)重要原因?；谏鲜鲈颍业礁行У囊认侔┲委熅哂兄匾院推惹行?。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物。該藥物組合物通過(guò)將簕菜中兩個(gè)三萜化合物分別和吉西他濱進(jìn)行聯(lián)合用藥，以胰腺癌中的pcan-1細(xì)胞作為研究對(duì)象，該藥物組合物對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增值遷移，侵襲等具有顯著的抑制作用，有望獲得較為安全可靠的新型治療治療胰腺癌的候選藥物。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，該藥物包含活性成分和藥物學(xué)上可接受的輔料，所述的活性成分包含吉西他濱和三萜化合物，所述三萜化合物為3α，11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(e12-1)或3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23，28-二酸(e13-1)。優(yōu)選地，所述的三萜化合物和吉西他濱的摩爾比為(100～4550)∶(1～10)。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的三萜化合物和吉西他濱的摩爾比為(300～1500)∶(1.5～8)。更為優(yōu)選地，所述的三萜化合物和吉西他濱的摩爾比為170∶1。優(yōu)選地，所述的胰腺癌的藥物組合物為口服制劑。更為優(yōu)選地，所述的口服制劑為膠囊劑、片劑、顆粒劑或液劑。上所述藥物組合物在制備抗癌細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述癌細(xì)胞為胰腺癌細(xì)胞。本發(fā)明的藥物組合物依靠所述的三萜化合物和吉西他濱作為活性成分發(fā)揮抗胰腺癌的協(xié)同作用，發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)對(duì)這三種組分的用量比進(jìn)行了篩選，結(jié)果是所述三萜化合物和吉西他濱的摩爾比在(100～4550)∶(1～10)的范圍內(nèi)時(shí)，其抗胰腺癌的增值效果較好：為了降低吉西他濱的毒副作用以及耐藥性，本發(fā)明減少了該藥物的用量，因此在本發(fā)明最優(yōu)選的體外實(shí)施例中，3α，11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(e12-1)與吉西他濱的摩爾比為170∶1。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述抗胰腺癌的藥物組合物中含有的三萜化合物和吉西他濱均可以通過(guò)腸道以較快的速度吸收并發(fā)揮生物活性，因此本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為口服制劑。藥物單位制劑可以是常規(guī)的制劑工藝制成的藥物學(xué)上可接受的任意常規(guī)口服制劑，如膠囊劑、片劑、顆粒劑或液劑，為使上述制劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備的過(guò)程中加入藥學(xué)上可接受的輔料，所述藥物學(xué)上可接受的輔料為填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助懸劑、粘合劑或甜味劑。在本發(fā)明的實(shí)施例中用到填充劑為淀粉、乳糖、微晶纖維素或蔗糖中的一種，也可以使用上述填充劑的任意混合物；使用的崩解劑為淀粉、羧甲基淀粉鈉或預(yù)膠化淀粉中的一種，也可使用其他已知的崩解劑如低取代羥丙纖維素或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，還可以使用上述崩解劑的任意混合物，使用的潤(rùn)滑劑為硬脂酸鎂或二氧化硅，也可使用其他已知的中的潤(rùn)滑劑如十二烷基硫酸鈉，還可以使用上述潤(rùn)滑劑的任意混合物；所述助懸劑為聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或羥丙基甲基纖維素中的一種以上；所述粘合劑為羥丙基甲基纖維素、淀粉漿或聚乙烯吡咯烷酮中的一種以上；所述甜味劑為糖精鈉、甘草次酸、蔗糖、阿斯帕坦或甜蜜素中的一種以上。本發(fā)明以胰腺癌中的pcan-1細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)將三萜化合物e12-1和e13-1分別與吉西他濱進(jìn)行聯(lián)合用藥，對(duì)pcan-1細(xì)胞進(jìn)行體外抗癌活性測(cè)試。結(jié)果表明，簕菜中三萜化合物e12-1和e13-1分別與吉西他濱的聯(lián)合使用對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率、細(xì)胞周期和凋亡的影響。本發(fā)明因吉西他濱是療胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)一線化療藥物，但易發(fā)生耐藥現(xiàn)象，凋亡抑制是吉西他濱產(chǎn)生耐藥的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)bcl家族相關(guān)蛋白在調(diào)控胰腺癌細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用，抑制bcl-2可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性。因而，發(fā)明以體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞從整體水平上探討吉西他濱和簕菜中三萜類化合物的抑制作用及可能機(jī)制，旨在為吉西他濱聯(lián)合3α,11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(e12-1)和3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸(e13-1)臨床治療胰腺癌提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明三萜化合物e12-1和e13-1是簕菜的分離提取物。簕菜，學(xué)名為白簕(acanthopanaxtrifoliatus(linn.)merr.)，又稱鵝掌簕、三葉五加、三加皮、苦刺、刺三加，為五加科(araliaceae)五加屬(acanthopanax)的一種攀援狀灌木。簕菜是藥食同源植物，我國(guó)資料對(duì)其早有記載，李時(shí)珍曰：“五加治風(fēng)濕瘓庫(kù)，壯筋骨，其功良深”；明代《食物本草》中記載“五加，葉作蔬食，去皮膚風(fēng)濕”；《廣東藥用植物簡(jiǎn)編》記載“其根、莖葉均可入藥，根，祛風(fēng)除濕、消瘀止痛；葉，疏風(fēng)，消腫，止癢，有舒筋活血、消腫解毒之功效”。簕菜全株均可入藥,味苦、辛、涼，具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕、舒筋活、止咳平喘之功效。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，簕菜中含有白簕中含有黃酮、皂苷、香豆素、多糖、強(qiáng)心苷等藥用成分。發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，對(duì)簕菜進(jìn)行了很多基礎(chǔ)研究，從簕菜中分離出多種活性較強(qiáng)的化合物，研究其抗氧化能力，抗癌活性，抗炎活性等等。本研究從簕菜中分離到兩個(gè)三萜類化合物3α,11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸和3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸(如圖1所示)，并且對(duì)其進(jìn)行了基礎(chǔ)活性的測(cè)試，結(jié)果表明，此類化合物具有抗腫瘤，抗炎，抑制α-葡萄糖苷酶(專利cn104922173a)等作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1.本發(fā)明通過(guò)將從簕菜中分離出的兩個(gè)活性較強(qiáng)的三萜類化合物e12-1和e13-1分別與抗胰腺癌一線臨床藥物吉西他濱進(jìn)行聯(lián)合用藥，對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率、細(xì)胞周期和凋亡的影響等各方面判斷聯(lián)合用藥對(duì)胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的協(xié)同作用。本發(fā)明中e12-1，e13-1和吉西他濱細(xì)胞的生存率分別為80.3％，75.5％和77.9％。而當(dāng)e12-1和e13-1分別與吉西他濱藥物聯(lián)用后，pcan-1細(xì)胞的生存率分別僅為49.7％和44.2％。細(xì)胞生存率通過(guò)藥物聯(lián)合后下降了31％-36％左右。由此說(shuō)明在同等濃度下聯(lián)合用藥可以更有效的抑制pcan-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)生了協(xié)同增效的作用。2.本發(fā)明中三萜化合物e12-1，e13-1分別與吉西他濱聯(lián)用誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因bcl-2、il-6、nf-κb和p-state3等蛋白表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)三萜化合物e12-1和e13-1可增強(qiáng)吉西他濱殺傷胰腺癌細(xì)胞。3.本發(fā)明三萜化合物e12-1，e13-1分別與吉西他濱聯(lián)用的藥物組合物，不僅提供更多用藥安全性，而且降低了吉西他濱的臨床使用劑量，減少大劑量使用吉西他濱所產(chǎn)生的毒副作用，提高臨床治療安全指數(shù)，降低吉西他濱的耐藥性。為吉西他濱臨床應(yīng)用提供了更多的可能性。4.本發(fā)明三萜化合物e12-1，e13-1分別與吉西他濱聯(lián)用的藥物組合物與傳統(tǒng)的單藥治療相比，細(xì)胞凋亡率大幅度提高，分別為44.3％和48.2％。說(shuō)明藥物聯(lián)用促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用比單藥給藥的效果提高，使細(xì)胞凋亡增加了21％-26％。進(jìn)一步說(shuō)明，藥物聯(lián)用的效果強(qiáng)于單藥給藥?？赏瑫r(shí)靶向多種重要信號(hào)通路、克服腫瘤耐藥、降低毒副作用等。附圖說(shuō)明圖1是3α,11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(e12-1)(a)，3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸(e13-1)(b)和吉西他濱(c)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖2是三萜化合物e12-1、e13-1和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。圖3是三萜化合物e12-1、e13-1和吉西他濱被pi染色代表性的顯微照片。圖4是三萜化合物e12-1、e13-1和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)比率。圖5是三萜化合物e12-1和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后0h，5h和24h細(xì)胞劃痕愈合細(xì)胞形態(tài)顯微照片。圖6是三萜化合物e13-1和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后0h，5h和24h細(xì)胞劃痕愈合細(xì)胞形態(tài)顯微照片。圖7是三萜化合物e12-1和e13-1分別與吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后三萜化合物和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后遷移結(jié)果。圖8是三萜化合物e12-1和e13-1分別與吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路和凋亡蛋白表達(dá)的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。在下面實(shí)施例中所采用的實(shí)驗(yàn)儀器有thermoscientificseries8000co2培養(yǎng)箱(美國(guó)thermo公司)；classiia/b3水平流凈化工作臺(tái)(美國(guó)thermo公司)；mdf-382e超低溫冰箱(日本sanyo公司)；cpkr高速離心機(jī)(美國(guó)beckmancoulter公司)；allegrax-22r冷凍離心機(jī)(美國(guó)beckmancoulter公司)；locator4型液氮罐(美國(guó)thermo公司)；hotpack型高溫消毒柜(美國(guó)thermo公司)；移液槍(德國(guó)eppendorf公司)；nikonoptiphot光學(xué)顯微鏡(日本nikon公司)；nikoneclipsete200熒光顯微鏡(日本nikon公司)；nikonefd-3顯微鏡(日本nikon公司)；infinitem200pro多功能酶標(biāo)儀(奧地利tecan公司)；sirius單管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(德國(guó)bertholddetectionsystems公司)；chemidoctmxrsimager成像系統(tǒng)(美國(guó)bio-rad公司)。所采用的實(shí)驗(yàn)試劑有dmem培養(yǎng)基(美國(guó)gibco公司)：將dmem干粉(1l用)溶于約800ml蒸餾水中，攪拌至完全溶解，加入青霉素和鏈霉素混合液(終濃度：青霉素100units/ml，鏈霉素100μg/ml)，加入2g碳酸鈉，定容至1000ml。然后加入10％胎牛血清，過(guò)濾除菌后分裝到無(wú)菌血清瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩ＬヅＱ?fbs)(美國(guó)serumsourceinternational公司)；胰蛋白酶-edta溶液(1×)(美國(guó)sigma-aldrich公司)；0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液(美國(guó)cambrexbioscience公司)；蛋白測(cè)定試劑盒(美國(guó)bio-rad公司)；熒光素酶檢測(cè)試劑盒(美國(guó)promega公司)；supersignalwestfemto最高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物(美國(guó)thermo公司)；mtt、pi、dmso(美國(guó)sigma-aldrich公司)；一抗：β-actin，p-stat3，il-6，bcl-2，cox-2(美國(guó)cellsignaling公司)；hrp標(biāo)記的抗igg二抗(美國(guó)santacruz公司)；其他試劑均為美國(guó)sigma公司分析純以上等級(jí)。實(shí)施例1一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-1200份，吉西他濱1份，微晶纖維素600份，充分混勻后，灌裝1號(hào)膠囊100粒。實(shí)施例2一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-11000份，吉西他濱10份，微晶纖維素300份，充分混勻后，灌裝1號(hào)膠囊100粒。實(shí)施例3一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-1600份，吉西他濱1份，乳糖650份，混合均勻后，加入300份淀粉制成的10％的淀粉漿，進(jìn)行噴霧制粒。再加入硬脂酸鎂100份和pvp130份，混合均勻后，壓片制成500片。實(shí)施例4一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-1100份，吉西他濱1份，乳糖350份，混合均勻后，加入800份淀粉制成的10％的淀粉漿，進(jìn)行噴霧制粒。再加入硬脂酸鎂60份和pvp80份，混合均勻后，壓片制成500片。實(shí)施例5一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-1300份，吉西他濱1份，淀粉300份，羧甲基纖維素250份，真空干燥，混合均勻，過(guò)100目篩，制成顆粒劑。實(shí)施例6一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-1340份，吉西他濱2份，淀粉350份，羧甲基纖維素250份，真空干燥，混合均勻，過(guò)80目篩，制成顆粒劑。實(shí)施例7一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-14550份，吉西他濱1份，二氧化硅700份，淀粉漿280份，蔗糖460份，混勻，直至均勻的液體，過(guò)濾滅菌，分裝，制成口服液。實(shí)施例8一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-1455份，吉西他濱1份，二氧化硅450份，淀粉漿90份，蔗糖500份，混勻，直至均勻的液體，過(guò)濾滅菌，分裝，制成口服液。實(shí)施例9一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-1300份，吉西他濱1.5份，羧甲基淀粉鈉500份，預(yù)膠化淀粉750份，混勻，過(guò)120目篩，制粒，干燥，整粒，加入300份硬脂酸鎂混合，壓片制成200粒。實(shí)施例10一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e12-1300份，吉西他濱8份，羧甲基淀粉鈉300份，預(yù)膠化淀粉500份，混勻，過(guò)60目篩，制粒，干燥，整粒，加入200份硬脂酸鎂混合，壓片制成200粒。實(shí)施例11一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-11500份，吉西他濱1.5份，預(yù)膠化淀粉250份，乳糖650份，混合均勻，制粒，干燥，加入二氧化硅320份作為潤(rùn)滑劑，再次混勻，過(guò)120目篩，填充，制成50粒膠囊。實(shí)施例12一種協(xié)同抗胰腺癌的藥物組合物，按摩爾計(jì)量包含從簕菜醇提物中分離出的三萜化合物e13-1750份，吉西他濱4份，預(yù)膠化淀粉250份，乳糖130份，混合均勻，制粒，干燥，加入二氧化硅250份作為潤(rùn)滑劑，再次混勻，過(guò)60目篩，填充，制成50粒膠囊。上述實(shí)施例1-12中添加的藥物學(xué)上可接受的輔料可有效防潮，同時(shí)也利于藥物成型。實(shí)施例13mtt比色法mtt是一種能接收h+的黃色染料。在活細(xì)胞線粒體呼吸鏈中，琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素c可使mtt的四氮唑環(huán)開(kāi)裂，生成藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶，而死細(xì)胞中不含這種脫氫酶。甲瓚結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，可通過(guò)檢測(cè)甲瓚結(jié)晶的量來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。pcan-1細(xì)胞以接種濃度1×105個(gè)/ml的濃度接種于96孔板(100μl/孔)，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔(培養(yǎng)基鋪板孔)和對(duì)照孔二甲基亞砜(dmso)處理孔，5％co2，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，加入濃度梯度的化合物以及吉西他濱進(jìn)行處理，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔，5％co2，37℃孵育72h后小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入100μl培養(yǎng)基配制的mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)；繼續(xù)培養(yǎng)1h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100μldmso，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；用酶標(biāo)儀測(cè)量570nm處各孔的吸光值，用式(1)計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，結(jié)果如表1所示。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)＝(1-a樣品組/a對(duì)照組)×100％式(1)表1三萜化合物和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞的增值抑制作用(mtt法)e12-1e13-1吉西他濱gemcitabineic5066.13±5.65μm98.38±6.40μm2.78±3.39μm采用mtt法測(cè)定了三萜類化合物3α,11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸(e12-1)和3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸(e13-1)對(duì)pcan-1細(xì)胞增殖的抑制活性。結(jié)果表明，所有的化合物具有較強(qiáng)的抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，ic50分別為：66.13，98.38和2.78μm。實(shí)施例14臺(tái)盼藍(lán)拒染法臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)原理：正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，使之不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡，這與中性紅作用相反。因此，借助臺(tái)盼藍(lán)染色可以非常簡(jiǎn)便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。pcan-1細(xì)胞以接種濃度0.2×105個(gè)/ml的濃度接種于直徑35mm培養(yǎng)皿(2ml/培養(yǎng)皿)(6孔板，2ml/孔)，5％co2，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。加入溶解于二甲基亞砜(dmso)中的高、中、低濃度的化合物以及吉西他濱，并且將其進(jìn)行聯(lián)合給藥，對(duì)pcan-1細(xì)胞進(jìn)行處理72h后，使用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法測(cè)定化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡的影響。具體方法為：使用胰酶消化貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，將80μl細(xì)胞懸液與20μl0.4％的臺(tái)盼藍(lán)溶液均勻混合，靜置2min后，使用顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)。視野下，光亮透明細(xì)胞計(jì)為活細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染為藍(lán)色細(xì)胞計(jì)為死細(xì)胞。每次實(shí)驗(yàn)二甲基亞砜濃度不超過(guò)0.1％。結(jié)果如表2所示。表2三萜化合物和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞存活率的影響用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)試了化合物e12-1，e13-1與吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞的致死率，選擇藥物聯(lián)用所需的濃度根據(jù)其ic50，選擇細(xì)胞致死率約為20％時(shí)藥物的濃度值，確定e12-1，e13-1所需濃度為10um，35um，吉西他濱濃度為0.2um。確定給藥濃度之后，對(duì)其進(jìn)行藥物聯(lián)用。圖2是三萜化合物和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。從圖2可知，聯(lián)合用藥對(duì)pcan-1細(xì)胞的致死率比單藥給藥的致死率效果好。單藥時(shí)，e12-1，e13-1，吉西他濱細(xì)胞的生存率分別是80.3％，75.5％和77.9％。而藥物聯(lián)用后，pcan-1細(xì)胞的生存率分別僅為49.7％和44.2％。細(xì)胞生存率通過(guò)藥物聯(lián)合后下降了31％-36％左右。由此證明，在同等濃度下聯(lián)合用藥可以更有效的抑制pcan-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)生了協(xié)同增效的作用。實(shí)施例15細(xì)胞凋亡檢測(cè)將臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)中聯(lián)用化合物處理72h后的pcan-1細(xì)胞懸浮液，用細(xì)胞離心涂片器制成細(xì)胞涂片，經(jīng)丙酮/甲醇(1:1)溶液固定10min后，用碘化丙啶(pi)pbs溶液(10μg/ml)染色，使用熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察和形態(tài)分析，dna呈紅色熒光。細(xì)胞凋亡是由經(jīng)典的形態(tài)特征確定，包括核固縮，細(xì)胞收縮，和凋亡小體的形成。觀察時(shí)細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。每個(gè)樣品于顯微鏡下隨機(jī)觀察數(shù)個(gè)視野，總共不少于200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)視野(×200)中包含的凋亡細(xì)胞的百分比。實(shí)驗(yàn)通過(guò)單藥和藥物聯(lián)用進(jìn)行對(duì)比，對(duì)pcan-1細(xì)胞進(jìn)行72h處理后，經(jīng)固定并通過(guò)pi染色后，使用熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。圖3是三萜化合物和吉西他濱被pi染色代表性的顯微照片。其中，(a)為以dmso為陽(yáng)性對(duì)照，作用于細(xì)胞后被pi染色后的顯微照片，(b)、(c)、(d)、(e)和(f)分別為e12-1、e13-1和吉西他濱單藥給藥和聯(lián)合用藥后，細(xì)胞被pi染色后的顯微照片。從圖3可知，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈紅色(圖3中灰色部分)致密濃染，或呈紅色碎塊狀致密濃染，細(xì)胞核部分發(fā)生異變。聯(lián)合藥物的細(xì)胞凋亡情況較單藥較為嚴(yán)重。圖4是三萜化合物和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)比率。從圖4可知，單藥時(shí)，e12-1、e13-1和吉西他濱細(xì)胞的凋亡率分別是25.4％，22.4％和24.3％。藥物聯(lián)合時(shí)，細(xì)胞凋亡率大幅度提高，e12-1，e13-1分別與吉西他濱聯(lián)用，結(jié)果分別提高到44.3％和48.2％。結(jié)果說(shuō)明，e12-1和e13-1分別與吉西他濱藥物聯(lián)用促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用比單藥給藥的效果提高，使細(xì)胞凋亡增加了21％-26％。進(jìn)一步說(shuō)明，e12-1和e13-1分別與吉西他濱藥物聯(lián)用的效果強(qiáng)于單藥給藥。實(shí)施例16細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)pcan-1細(xì)胞以接種濃度4×106個(gè)/ml的濃度接種于直徑35mm培養(yǎng)皿(2ml/培養(yǎng)皿)(6孔板，2ml/孔)，5％co2，37℃培養(yǎng)36-48h。觀察培養(yǎng)皿的細(xì)胞融合度達(dá)到90％-100％時(shí)，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，加入溶解于dmso中的化合物以及吉西他濱，并且將其進(jìn)行聯(lián)合給藥，對(duì)pcan-1細(xì)胞進(jìn)行處理后，觀察0h，5h和24h時(shí)，細(xì)胞的愈合情況。具體方法為：用微量槍頭在培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，確保劃線部位粗細(xì)均勻，用pbs洗兩遍細(xì)胞，去除中央部分的細(xì)胞和部分漂浮細(xì)胞，換成無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)設(shè)定好的藥物濃度加入培養(yǎng)基中。在藥物加入后，分別于0h，5h和24h時(shí)，觀察并拍照，記錄下細(xì)胞形態(tài)和其遷移情況。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，可以測(cè)定e12-1和e13-1分別與吉西他濱藥物對(duì)pcan-1細(xì)胞的愈合能力以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的形態(tài)，實(shí)驗(yàn)通過(guò)單藥和藥物聯(lián)用進(jìn)行對(duì)比，使pcan-1細(xì)胞生長(zhǎng)融合到90％-100％后，對(duì)其進(jìn)行劃痕處理。圖5和6分別是三萜化合物e12-1和e13-1分別與吉西他濱聯(lián)合后對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后0h，5h和24h細(xì)胞劃痕愈合細(xì)胞形態(tài)顯微照片。由圖5和圖6通過(guò)不同時(shí)間段的跟蹤觀察，細(xì)胞的形態(tài)與其愈合程度，分析藥物對(duì)細(xì)胞的愈合能力。結(jié)果表明，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的增加，被劃傷的細(xì)胞逐漸恢復(fù)原來(lái)的形態(tài)，一些不能恢復(fù)的細(xì)胞不斷死去，細(xì)胞的愈合程度不斷增強(qiáng)，劃痕面積逐漸變小。但是聯(lián)合用藥組的細(xì)胞，愈合能力明顯比單藥給藥的愈合能力弱。圖7是三萜化合物e12-1和e13-1分別與吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后三萜化合物和吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞處理后遷移結(jié)果。從圖7可知，e12-1和e13-1分別與吉西他濱藥物聯(lián)合后對(duì)pcan-1細(xì)胞的愈合能力明顯低于單藥給藥，其愈合能力較單藥給藥降低了20％-35％左右。即藥物聯(lián)用的效果更能使細(xì)胞無(wú)法正常生長(zhǎng)。實(shí)施例17免疫印跡法蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡法)，是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物nc膜或pvdf膜上，然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)方面。1.細(xì)胞全蛋白提?。簆can-1細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種在100mm培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h。然后加入溶解于dmso中的化合物以及吉西他濱，并且將其進(jìn)行聯(lián)合給藥處理24h，dmso為對(duì)照處理組。然后吸棄所有溶液，使用冰浴的pbs清洗細(xì)胞后，然后加入200μlripa裂解緩沖液，完全裂解細(xì)胞，使用細(xì)胞刮棒將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)皿中刮取下來(lái)，收集細(xì)胞懸液，使用注射器針頭反復(fù)吹打使細(xì)胞完全裂解，在4℃離心，取上清液待用。2.蛋白濃度測(cè)定：在1ml反應(yīng)液a中加入20μl反應(yīng)液s配制反應(yīng)液a’；以pbs配制牛血清白蛋白bsa16mg/ml，并依次用水稀釋成0.1，0.2，0.4，0.8，1.6mg/ml系列bsa標(biāo)準(zhǔn)溶液；各取5μl蛋白樣品(如果蛋白濃度過(guò)高，進(jìn)行適當(dāng)稀釋)和bsa標(biāo)準(zhǔn)溶液于96孔板中，依次加入25μl反應(yīng)液a’，200μl反應(yīng)液b，混勻，室溫振搖反應(yīng)15min；于波長(zhǎng)650nm處讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)蛋白質(zhì)樣品濃度。取上清液5μl與25μl的底物混合后立即用sirius單管式化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。每個(gè)樣品設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每孔測(cè)定5次，取平均值。熒光素酶活性用發(fā)光強(qiáng)度與蛋白濃度的比值表示，并且換算為空白對(duì)照組(dmso處理)的百分比表示。3.sds-page電泳：取上述蛋白樣品30μg，加入2×蛋白電泳樣品緩沖液，沸水浴5min，然后離心30s，置冰上備用；按說(shuō)明書安裝電泳裝置；取出minin-proteantgt預(yù)制膠梳子，清洗加樣孔，放入電泳槽中，加入tris-甘氨酸電泳緩沖液；在上樣孔中小心加入樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量marker；接通電源，100v，110min；電泳至上樣緩沖液染料到達(dá)凝膠前沿約1cm處，停止電泳。4.免疫印跡試驗(yàn)：(1)轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，截取適當(dāng)大小的pvdf膜和2張濾紙，將pvdf膜先在甲醇中浸潤(rùn)10s，然后于去離子水中浸潤(rùn)2min，再同濾紙一同浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡10-15min，同時(shí)將凝膠浸于適量的轉(zhuǎn)移緩沖液中，按照裝置說(shuō)明書裝好夾子，按順序：海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡，形成三明治結(jié)構(gòu)。將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治結(jié)構(gòu)，加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，恒流90v轉(zhuǎn)膜90min。(2)封閉：將轉(zhuǎn)有蛋白的膜浸于5％bsa封閉液中封閉1h。用含0.05％tween-20的tris緩沖鹽溶液(tbst)洗膜3次，每次5mim。(3)雜交：取出已封閉的膜，然后置于相應(yīng)的一抗溶液中，4℃過(guò)夜。actin作為加樣對(duì)照蛋白。用tbst洗膜4次，每次15mim。再置于hrp標(biāo)記的通用抗igg二抗(1：5000)稀釋)溶液中，室溫避光振搖lh。用tbst洗膜4次，每次15min。使用的supersignalwestfemto試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，quantityone系統(tǒng)進(jìn)行掃描。運(yùn)用imagestudiolitever4.0軟件進(jìn)行分析。已有研究表明stat3和nf-κb兩條信號(hào)通路互相連通，它們可以共同調(diào)節(jié)一些與腫瘤及炎癥相關(guān)的基因表達(dá)，如nf-κb，il-6，p-state3和bcl-2。因此，本發(fā)明通過(guò)westernblot方法對(duì)3α,11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸和吉西他濱以及分別藥物聯(lián)用作用后pcan-1細(xì)胞中相關(guān)凋亡蛋白的水平進(jìn)行了檢測(cè)。圖8是三萜化合物e12-1和e13-1分別與吉西他濱對(duì)pcan-1細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路和凋亡蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，對(duì)于bcl-2抗體，藥物聯(lián)用效果較強(qiáng)于單藥給藥，尤其是3α,11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，色帶顏色明顯較淺，即bcl-2表達(dá)明顯降低。il-6抗體，單藥表達(dá)較高，而吉西他濱相對(duì)于三萜類化合物表達(dá)較低，而e12-1和e13-1分別與吉西他濱聯(lián)用后il-6表達(dá)較單藥更低。nf-κb抗體，e12-1和e13-1分別與吉西他濱藥物聯(lián)用效果較強(qiáng)于單藥給藥，尤其是3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸，即nf-κb表達(dá)明顯降低。p-state3抗體，色帶的變化非常明顯，藥物聯(lián)用效果明顯強(qiáng)于單藥給藥，說(shuō)明藥物聯(lián)用后，p-state3抗體表達(dá)降低很多。3α,11α-二羥基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，3α-羥基-羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸分別和吉西他濱藥物聯(lián)用抑制作用越強(qiáng)，il-6表達(dá)降低，p-tate3表達(dá)亦降低。說(shuō)明e12-1和e13-1分別與吉西他濱的藥物聯(lián)用抑制pcan-1細(xì)胞的生長(zhǎng)可能的信號(hào)通路。間接說(shuō)明nf-κb和p-state3之間存在相互影響，這兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路之間存在交互關(guān)系，藥物聯(lián)用可以影響這兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路。實(shí)施例18統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果用means±sd的形式表示。樣品處理組與對(duì)照組間數(shù)據(jù)差異性分析均采用student'st檢驗(yàn)進(jìn)行。p<0.05(*)和p<0.001(**)分別代表差異顯著和差異極顯著。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合和簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12