本發(fā)明屬于淫羊藿苷技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種淫羊藿苷在制備治療心律失常藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心律失常是由于竇房結(jié)激動(dòng)異?；蚣?dòng)產(chǎn)生于竇房結(jié)以外、激動(dòng)的傳導(dǎo)緩慢、阻滯或經(jīng)異常通道傳導(dǎo)，即心臟活動(dòng)的起源和(或)傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致心臟搏動(dòng)的頻率和(或)節(jié)律異常。心律失常是心血管疾病中重要的一組疾病，它可單獨(dú)發(fā)病，亦可與其他心血管疾病伴發(fā)。其預(yù)后與心律失常的病因、誘因、演變趨勢(shì)、是否導(dǎo)致嚴(yán)重血流動(dòng)力障礙有關(guān)。心律失常可由各種器質(zhì)性心血管病(如高血壓、心肌缺血和心肌梗死、心肌損傷等)、藥物中毒、電解質(zhì)和酸堿平衡失調(diào)等因素引起，部分心律失常也可因植物神經(jīng)功能紊亂所致。近年來(lái)，盡管在心律失常的藥物治療上已取得很大的進(jìn)展，但心律失常病人的死亡率仍然較高。因此，抗心律失常藥物的研發(fā)已成為當(dāng)前治療心臟疾患領(lǐng)域中最為重要的研究?jī)?nèi)容之一。

心律失常的發(fā)病機(jī)制與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極化過(guò)程的異常有關(guān)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞動(dòng)作電位異常。其中，鈉通道、鈣通道和鉀通道在心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的形成中有著重要作用，抗心律失常藥物也多與之相關(guān)?？剐穆墒СＫ幙芍苯优c離子通道結(jié)合，或通過(guò)受體等的間接作用，使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化，從而抑制心肌細(xì)胞的電活動(dòng)，糾正心律失常。然而，抗心律失常藥不僅影響異常電活動(dòng)，對(duì)正常的電活動(dòng)也有影響。另外，由于電活動(dòng)的過(guò)度抑制也會(huì)產(chǎn)生新的心律失常(致心律失常作用)，通過(guò)抑制離子流也會(huì)影響心肌收縮力，不少藥物在心功能低下或心功能不全時(shí)禁用。因此，抗心律失常藥在某種意義上是難以正確使用的藥物，但其效用顯著，在臨床上處于重要的地位。

目前所用抗心律失常藥物的分類(lèi)及作用機(jī)制：

抗心律失常藥物現(xiàn)在廣泛使用的是改良的Vaughan Williams分類(lèi)，根據(jù)藥物作用的電生理學(xué)特點(diǎn)，可將抗心律失常藥分為四類(lèi)，其中I類(lèi)藥又分為A、B、C三個(gè)亞類(lèi)。

(一)I類(lèi)——鈉通道阻滯藥

1.IA類(lèi)適度阻滯鈉通道，屬此類(lèi)的有奎尼丁等藥。

2.IB類(lèi)輕度阻滯鈉通道，屬此類(lèi)的有利多卡因等藥。

3.IC類(lèi)明顯阻滯鈉通道，屬此類(lèi)的有氟卡尼等藥。

(二)II類(lèi)——β腎上腺素受體阻斷藥

β腎上腺素受體阻斷藥因阻斷β受體而有效，代表性藥物為普萘洛爾。

(三)III類(lèi)——抑制多種鉀電流，選擇地延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程(APD)及有效不應(yīng)期的藥

除胺碘酮外，Ⅲ類(lèi)藥物目前臨床使用已十分謹(jǐn)慎，尤其是抑制I_Kr的藥物。由于I_Kr是動(dòng)作電位復(fù)極主要的外向電流，I_Kr減小，能延長(zhǎng)APD，導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng)。許多非心血管類(lèi)的藥物由于能有效抑制I_Kr，因而存在著引發(fā)LQT綜合癥和尖端扭轉(zhuǎn)型室速等惡性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)，許多此類(lèi)藥物已經(jīng)撤離了美國(guó)藥品市場(chǎng)。因此，I_Kr被抑制的程度已被作為評(píng)估一種新藥是否致心律失常作用的指標(biāo)。

(四)IV類(lèi)——鈣拮抗藥

鈣拮抗藥阻滯鈣通道而抑制Ca²⁺內(nèi)流，代表性藥物有維拉帕米。

淫羊藿苷(C₃₃H₄₀O₁₅，分子量為676.66)是從中藥淫羊藿中提取的一種黃酮類(lèi)有機(jī)物。淫羊藿苷具有廣泛的藥理作用，如具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)等作用?！耙蜣杰赵谥苽渲委熗L(fēng)藥物中的應(yīng)用”(CN201310149856.0)專(zhuān)利技術(shù)，報(bào)道了淫羊藿苷具有治療痛風(fēng)的作用；“淫羊藿苷類(lèi)化合物及其應(yīng)用”(CN201410586824.1)專(zhuān)利技術(shù)，發(fā)現(xiàn)對(duì)脫水淫羊藿苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，可預(yù)防或者治療骨質(zhì)疏松。然而，淫羊藿苷對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、各種離子通道電流以及整體(活體)水平心律失常的影響未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，提供一種能制備抗心律失常的藥物。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：淫羊藿苷在制備治療心律失常藥物方面的應(yīng)用；所述藥物為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒體、注射液、片劑或口服液。

為敘述簡(jiǎn)便起見(jiàn)，先將本發(fā)明涉及到的技術(shù)術(shù)語(yǔ)的中文名稱(chēng)及其括號(hào)內(nèi)的英文縮寫(xiě)統(tǒng)一描述如下，以后將用括號(hào)內(nèi)的英文縮寫(xiě)進(jìn)行描述：左心室肌細(xì)胞(LVM)；左心房肌細(xì)胞(LAM)；瞬時(shí)鈉電流(I_NaT)；晚鈉電流(I_NaL)；L-型鈣電流(I_CaL)；內(nèi)向整流鉀電流(I_K1)；快速延遲整流鉀電流(I_Kr)；瞬時(shí)外向鉀電流(I_to)；超快速激活的延遲整流鉀電流(I_Kur)；乙酰膽堿敏感型鉀電流(I_KAch)；緩慢延遲整流鉀電流(I_Ks)；動(dòng)作電位(AP)；動(dòng)作電位時(shí)程(APD)；異丙腎上腺素(ISO)；延遲后除極(DAD)；觸發(fā)激動(dòng)(TA)；早期后除極(EAD)；海葵毒素(ATX-II)；AP的最大去極化速率(V_max)；AP復(fù)極50％的時(shí)程(APD₅₀)；AP復(fù)極90％的時(shí)程(APD₉₀)；動(dòng)作電位幅值(APA)；靜息電位(RMP)；半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)；刺激周長(zhǎng)(CL)。

本發(fā)明采用新西蘭大耳兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定淫羊藿苷對(duì)LAM的AP、LAM的離子通道電流、LVM的AP、LVM的離子通道電流、由ISO和高鈣引起的LVM的DAD、由ISO和高鈣引起的TA、ATX-II引起的LVM的EAD和烏頭堿誘發(fā)的整體(活體)水平心律失常的作用，證實(shí)了淫羊藿苷的抗心律失常作用。具體如下：

淫羊藿苷(5μmol/L和10μmol/L)不僅能夠濃度依賴(lài)性地減小LAM的V_max、APD₅₀和APD₉₀，而且能濃度依賴(lài)性地減小LVM的V_max、APD₅₀、APD₉₀和動(dòng)作電位復(fù)極的頻率依賴(lài)性，而對(duì)LAM的APA和RMP沒(méi)有影響，亦對(duì)LVM的APA和RMP沒(méi)有影響。

ISO(1μmol/L)和高鈣(3.6mmol/L)能引起LVM的DAD和TA。淫羊藿苷不僅能有效地抑制DAD和TA，而且能有效地消除ATX-II(10nmol/L)引起的EAD。

淫羊藿苷能夠濃度依賴(lài)性地抑制LAM和LVM的I_NaT，IC₅₀分別為12.28±0.29μmol/L(n＝8)和11.83±0.92μmol/L(n＝10)。淫羊藿苷(1μmol/L，10μmol/L，20μmol/L和40μmol/L)還能抑制10nmol/L ATX-II增大的I_NaL。

淫羊藿苷濃度依賴(lài)性地抑制LAM和LVM的I_CaL，IC₅₀分別為13.43±2.73μmol/L(n＝9)和4.78±0.89μmol/L(n＝13)。并且對(duì)LVM的I_CaL的抑制效果是LAMs的2.8倍，即對(duì)LVM的I_CaL的抑制具有一定的心室依賴(lài)性。

淫羊藿苷(40μmol/L)不僅對(duì)LVM的I_K1和I_Kr無(wú)作用，且對(duì)LAM的I_to和I_Kur亦無(wú)作用。

在整體(活體)條件下，淫羊藿苷(3mg/kg)可以延長(zhǎng)和增加烏頭堿誘發(fā)心律失常(烏頭堿作為一個(gè)特殊的Na⁺通道激動(dòng)劑可延長(zhǎng)該通道的開(kāi)放時(shí)間，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)Na⁺積累和Ca²⁺超載，最終引起各種心律失常)的發(fā)生時(shí)間(時(shí)間閾值)和用量(劑量閾值)，同時(shí)有效降低其誘發(fā)室性心動(dòng)過(guò)速和室顫的發(fā)生率以及新西蘭大耳兔的死亡率。

淫羊藿苷在制備治療心律失常藥物中的應(yīng)用；所述藥物為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒體、注射液、片劑或口服液。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

1.淫羊藿苷兼有I和IV類(lèi)抗心律失常的藥理作用，同時(shí)還能抑制I_NaL。通過(guò)阻滯I_CaL、I_NaL和I_NaT，淫羊藿苷不僅抑制ISO和高鈣引起的DAD和TA，而且還抑制由ATX-II誘發(fā)的EAD；故對(duì)細(xì)胞性心律失常(EAD、DAD和TA)具有顯著的抑制效應(yīng)。

2.淫羊藿苷還能明顯抑制心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極的頻率依賴(lài)性，即隨著心率或刺激頻率的增加APD逐漸縮短，反之則延長(zhǎng)。

3.淫羊藿苷不僅對(duì)LVM的I_K1和I_Kr無(wú)明顯作用，且對(duì)LAM的I_to和I_Kur亦無(wú)明顯作用，尤其是對(duì)I_Kr和I_K1沒(méi)有影響，增加了使用安全性。

4.在整體(活體)條件下，淫羊藿苷可以延長(zhǎng)和增加烏頭堿誘發(fā)心律失常的發(fā)生時(shí)間(時(shí)間閾值)和用量(劑量閾值)，同時(shí)有效降低其誘發(fā)室性心動(dòng)過(guò)速和室顫的發(fā)生率以及新西蘭大耳兔的死亡率。

因此，淫羊藿苷可成為一種新的和有效的抗心律失常藥物。

附圖說(shuō)明

圖1.為淫羊藿苷對(duì)烏頭堿誘發(fā)的心律失常的試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖2.為淫羊藿苷對(duì)LVM的頻率依賴(lài)性的濃度依賴(lài)性減弱試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖3.為淫羊藿苷對(duì)LVM的EAD的抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖4.為淫羊藿苷對(duì)LVM的DAD及TA的抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖5.為淫羊藿苷對(duì)LVM和LAM的I_NaT濃度依賴(lài)性抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖6.為淫羊藿苷對(duì)ATX-II增大的LVM的I_NaL的濃度依賴(lài)性抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖7.為淫羊藿苷對(duì)LVM和LAM的I_CaL濃度依賴(lài)性抑制試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，本具體實(shí)施方式通過(guò)從細(xì)胞水平和整體水平的研究，說(shuō)明淫羊藿苷在制藥領(lǐng)域的新用途。

1材料

1.1動(dòng)物

健康成年的新西蘭大耳兔，體重1.7～2kg，不論雌雄，由武漢科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主要儀器

EPC9膜片鉗放大器(德國(guó)Heka Electronic公司)；三維微操縱儀(美國(guó)Sutter公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；兩步玻璃微電極拉制儀(日本Narishige公司)；恒速泵(保定申辰泵業(yè)有限公司)。

1.3藥品與試劑

I型膠原酶和CsCl購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，?；撬?、血清白蛋白和HEPES購(gòu)自瑞士Roche公司，谷氨酸和?；撬豳?gòu)自武漢中南生物制品研究所，其它藥品均購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司。

1.4實(shí)驗(yàn)溶液配制

(1)無(wú)鈣臺(tái)式液(mmol/L)：NaCl為135，NaH₂PO₄為0.33，KCl為5.4，MgCl₂為1.0，HEPES為10，葡萄糖為10，用NaOH調(diào)PH至7.4。

(2)KB液(mmol/L)：KOH為70，KCl為40，KH₂PO₄為20，谷氨酸為50，?；撬釣?0，EGTA為0.5，葡萄糖為10，HEPES為10，MgSO₄為3，用KOH調(diào)PH至7.4。

(3)記錄AP的電極內(nèi)液(mmol/L)：天門(mén)冬氨酸鉀為110，KCl為30，NaCl為5.0，HEPES為10，EGTA為0.1，MgATP為5.0，磷酸肌酸為5.0，CAMP為0.05，用KOH調(diào)PH至7.2。

(4)記錄AP和I_K1的灌流液為臺(tái)式液(mmol/L)：NaCl為135，NaH₂PO₄為0.33，KCl為5.4，MgCl₂為1.0，1.8為CaCl₂，HEPES為10，葡萄糖為10，用NaOH調(diào)PH至7.4。

(5)記錄I_NaT的灌流液(mmol/L)：NaCl為30，CaCl₂為1.0，CsCl為105，MgCl₂為1.0，CdCl₂為0.05，HEPES為5.0，葡萄糖為5.0，用CsOH調(diào)PH至7.4。

(6)記錄I_NaT和I_NaL的電極內(nèi)液為(mmol/L)：CsCl為120，CaCl₂為1.0，MgCl₂為5.0，Na₂ATP為5.0，四乙基氯化銨為10，EGTA為11，HEPES為10，用CsOH為調(diào)PH至7.3。

(7)記錄I_NaL和I_CaL的灌流液(mmol/L)：NaCl為135，CsCl為5.4，MgCl₂為1.0，葡萄糖10，NaH₂PO₄為0.33，BaCl₂為0.3，HEPES為10，CaCl₂為1.8，用NaOH調(diào)PH至7.4。

(8)記錄I_CaL的電極內(nèi)液(mmol/L)：CsCl為80，CsOH為60，天門(mén)冬氨酸為40，CaCl₂為0.65，HEPES為5.0，EGTA為10，MgATP為5.0，磷酸肌酸鈉為5.0，用CsOH調(diào)PH至7.2。

(9)記錄I_Kr的灌流液(mmol/L)：NaCl為135，KCl為5.4，MgCl₂為1.0，葡萄糖為5.0，CdCl₂為0.2，NaH₂PO₄為0.33，HEPES為5.0，CaCl₂為1.0，用NaOH調(diào)PH至7.4。灌流液中加入30μmol/L的293B，用于阻斷I_Ks。

(10)記錄I_Kr的電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl為140，MgCl₂為1.0，Na₂ATP為2.0，EGTA為10，HEPES為5.0，用KOH調(diào)PH至7.25。

(11)記錄I_K1的電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl為140，MgCl₂為1.0，K₂ATP為5.0，EGTA為10，HEPES為5.0，用KOH調(diào)PH至7.3。

(12)記錄I_Kur與I_to的灌流液(mmol/L)：NaCl為140，KCl為5.4，MgCl₂為1.0，葡萄糖為10，NaH₂PO₄為0.33，HEPES為5.0，CaCl₂為1.8，用NaOH調(diào)PH至7.4。向灌流液中加入200μmol/L的BaCl₂、200μmol/L的CdCl₂和1.0μmol/L的阿托品，依次阻斷I_K1、I_CaL和I_KAch。

(13)記錄I_Kur與I_to的電極內(nèi)液(mmol/L)：天門(mén)冬氨酸鉀為110，KCl為20，GTP為0.1，MgCl₂為1.0，HEPES為10，EGTA為5.0，MgATP為5.0，磷酸肌酸為5.0，用KOH調(diào)PH至7.2。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1、整體實(shí)驗(yàn)。取健康成年的新西蘭大耳兔20只，雌雄不限，隨機(jī)分成兩組：烏頭堿組和淫羊藿苷+烏頭堿組。烏頭堿組在實(shí)驗(yàn)前半小時(shí)腹腔注射生理鹽水，淫羊藿苷+烏頭堿組在實(shí)驗(yàn)前半小時(shí)腹腔注射3mg/kg淫羊藿苷。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，兩組兔子均經(jīng)耳緣靜脈注射甲苯噻嗪(7.5mg/kg，i.m.)和氯胺酮(30mg/kg，i.v.)進(jìn)行麻醉，記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖，然后通過(guò)恒速泵經(jīng)耳緣靜脈給予2ug/kg/min的烏頭堿以誘發(fā)心律失常。求出烏頭堿誘發(fā)室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速和室顫的時(shí)間，同時(shí)求出烏頭堿誘發(fā)室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速和室顫的烏頭堿用量。

2.2、采用酶解法分離單個(gè)心肌細(xì)胞。選用健康成年的新西蘭大耳兔，體重1.7～2kg，不論雌雄，經(jīng)耳緣靜脈注射2000單位肝素鈉充分抗凝后，再注射甲苯噻嗪(7.5mg/kg，i.m.)和氯胺酮(30mg/kg，i.v.)以安眠和麻醉。然后將新西蘭大耳兔仰臥捆綁固定在兔臺(tái)上，迅速開(kāi)胸暴露并分離出心臟，將心臟置于裝有37℃的無(wú)鈣臺(tái)式液的培養(yǎng)皿中使心臟停止跳動(dòng)，適當(dāng)修剪(去除脂肪和結(jié)締組織)后經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管，將心臟懸掛固定于Langendoff灌流裝置上，用氧飽和(體積分?jǐn)?shù)為95％的O₂和5％的CO₂)且恒溫(37℃)的無(wú)鈣臺(tái)式液灌流5min，將心腔內(nèi)殘留的血液沖洗干凈。再換用含有I型膠原酶(1g/l)和牛血清白蛋白(1g/l)的無(wú)鈣臺(tái)式液行逆行灌流，整個(gè)過(guò)程在恒溫(37℃)和100％氧氣持續(xù)通入的條件下進(jìn)行，消化酶解30min后終止消化，換用預(yù)先加熱至37℃和100％氧飽和的KB液反復(fù)沖洗5min，從而將心臟中殘留的膠原酶液置換出來(lái)，以免繼續(xù)消化。置換完成之后分別將左心房和左心室剪下來(lái)放于KB液中，在KB液中將心房和心室剪碎反復(fù)吹打，然后經(jīng)尼絨膜過(guò)濾后將細(xì)胞懸液保存于含有牛血清白蛋白(1g/l)的KB液中。靜置至少1小時(shí)后進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)中所有灌流液都用體積分?jǐn)?shù)為95％的O₂和5％的CO₂飽和且溫度為37℃。

2.3、全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄LVM的AP、I_NaT、I_NaL、I_CaL、I_K1和I_Kr，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄LAM的AP、I_NaT、I_CaL、I_Kur和I_to。將細(xì)胞懸液滴入特制的細(xì)胞池中并置于熒光倒置顯微鏡的工作臺(tái)上，待細(xì)胞沉降貼壁后用灌流液灌流，而后進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。電極由兩步玻璃微電極拉制儀拉制，并經(jīng)熱拋光，充入電極內(nèi)液后電極電阻為1.5-2.5MΩ。電信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗放大器放大和濾波后儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)硬盤(pán)中。

2.4、數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Fitmaster進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Origin8.0進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用Mean±SD表示。I_NaT和I_CaL的穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活的曲線用Boltzman方程擬合：Y＝1/[1+exp(V_m-V_1/2)/k]，其中V_m表示膜電壓，V_1/2表示半數(shù)激活或半數(shù)失活電壓，k表示斜率，Y表示相對(duì)比值(擬合穩(wěn)態(tài)激活曲線時(shí)Y表示G/G_max，擬合穩(wěn)態(tài)失活曲線時(shí)Y表示I/I_max)。電流密度由電流幅度/細(xì)胞電容計(jì)算得到。兩組均數(shù)間比較采用T檢驗(yàn)(T檢驗(yàn)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)上進(jìn)行兩組均數(shù)比較的假設(shè)檢驗(yàn)方法)，多組均數(shù)間比較采用方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3、結(jié)果

3.1、淫羊藿苷對(duì)烏頭堿誘發(fā)的心律失常的作用

圖1為淫羊藿苷對(duì)烏頭堿誘發(fā)的心律失常試驗(yàn)結(jié)果圖；其中：A為烏頭堿組，B為淫羊藿苷+烏頭堿組。從圖1可以看出：烏頭堿組中烏頭堿誘發(fā)室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速和室顫的時(shí)間閾值(min)依次為19、24和56，而淫羊藿苷+烏頭堿組烏頭堿誘發(fā)的心律失常的時(shí)間閾值顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。說(shuō)明淫羊藿苷對(duì)烏頭堿誘發(fā)的心律失常有抑制作用。在烏頭堿組中，新西蘭大耳兔室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速和室顫的發(fā)生率均為100％；在淫羊藿苷+烏頭堿組中，新西蘭大耳兔室性早搏的發(fā)生率為90％，室性心動(dòng)過(guò)速的發(fā)生率為40％，室顫的發(fā)生率為10％。與烏頭堿組相比，淫羊藿苷+烏頭堿組中烏頭堿誘發(fā)新西蘭大耳兔室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速和室顫的用量和時(shí)間顯著增加(P<0.01)，新西蘭大耳兔的存活率顯著提高(P<0.01)。結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。

表1淫羊藿苷對(duì)烏頭堿誘發(fā)的心律失常的劑量閾值

與對(duì)照組相比^##p<0.01。

表2烏頭堿誘發(fā)心律失常的時(shí)間閾值

與對(duì)照組相比^##p<0.01。

3.2、淫羊藿苷對(duì)動(dòng)作電位及其頻率依賴(lài)性的作用

1.5倍閾強(qiáng)度、持續(xù)5ms和1Hz的刺激頻率連續(xù)記錄動(dòng)作電位，待穩(wěn)定后，依次加入5μmol/L和10μmol/L淫羊藿苷。淫羊藿苷不僅濃度依賴(lài)性的減小LVM的V_max、APD₅₀和APD₉₀，亦能減小LAM的V_max、APD₅₀和APD₉₀，但對(duì)LAM的APA和RMP沒(méi)有影響，亦對(duì)LVM的APA和RMP沒(méi)有影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3淫羊藿苷對(duì)左心室和左心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位各參數(shù)的影響

與對(duì)照組相比：^#p<0.05，^##p<0.01；與5μmol/L淫羊藿苷相比：^*p<0.05，^**p<0.01。

圖2為淫羊藿苷對(duì)LVM的頻率依賴(lài)性的濃度依賴(lài)性減弱試驗(yàn)結(jié)果圖；其中：A為對(duì)照組，B為5μmol/L淫羊藿苷干預(yù)組，C為10μmol/L淫羊藿苷干預(yù)組，D為上述三組APD₉₀數(shù)據(jù)匯總。從圖2可以看出：在A圖中，隨著頻率增大動(dòng)作電位時(shí)程越短，即頻率依賴(lài)性；在B圖和C圖中，淫羊藿苷能濃度依賴(lài)性地減弱頻率依賴(lài)性；在D圖中，在0.5Hz刺激頻率下，5μmol/L和10μmol/L淫羊藿苷能使LVM的APD₉₀依次減小16.5±4.8％和34.5±6.4％(n＝9，其中n表示試驗(yàn)中細(xì)胞的例數(shù)，下同)。刺激頻率為1Hz時(shí)，淫羊藿苷能使APD₉₀依次減小13±4.9％和32.2±7.4％。刺激頻率為2Hz時(shí)，淫羊藿苷能使APD₉₀依次減小10.5±4.3％和28.5±7.2％。說(shuō)明淫羊藿苷能濃度依賴(lài)性地減弱頻率依賴(lài)性。

3.3、淫羊藿苷消除細(xì)胞性心律失常

在CL＝4000ms的刺激下，待LVM的AP穩(wěn)定后，用含10nmol/L的ATX-II(一種晚鈉電流開(kāi)放劑)的灌流液沖灌細(xì)胞，10例細(xì)胞中有7例出現(xiàn)EAD。20μmol/L淫羊藿苷可使7例細(xì)胞的EAD全部消失。結(jié)果如圖3所示，圖3為淫羊藿苷對(duì)LVM早發(fā)后除極的抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；其中：A為對(duì)照組，B為10nmol/L的ATX-II干預(yù)組，C為10nmol/L的ATX-II+20μmol/L淫羊藿苷干預(yù)組。從圖3可以看出：10nmol/L的ATX-II能顯著延長(zhǎng)APD(P<0.01)并誘發(fā)EAD，而20μmol/L淫羊藿苷能縮短ATX-II引起的APD延長(zhǎng)并消除ATX-II誘發(fā)的EAD。

另1組試驗(yàn)中，CL＝300ms，串刺激(每個(gè)串刺激15個(gè)脈沖)間隔為9s的條件下記錄，待LVM的動(dòng)作電位穩(wěn)定后，用含1μmol/L的ISO和3.6mmol/L的CaCl₂的灌流液沖灌細(xì)胞，可以使9例LVM中的6例產(chǎn)生DAD，其中的3例同時(shí)出現(xiàn)TA。結(jié)果如圖4，圖4為淫羊藿苷對(duì)LVM的DAD及TA的抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；其中：A為對(duì)照組，B為1μmol/L的ISO+3.6mmol/L高鈣干預(yù)組，C為1μmol/L的ISO+3.6mmol/L的高鈣+10μmol/L的淫羊藿苷干預(yù)組。從圖4可以看出：10μmol/L的淫羊藿苷能完全抑制1μmol/L的ISO和3.6mmol/L的高鈣誘發(fā)的TA并使DAD明顯減弱。

說(shuō)明淫羊藿苷能有效消除細(xì)胞性心律失常。

3.4、淫羊藿苷對(duì)I_NaT和I_NaL的作用

在研究淫羊藿苷對(duì)I_NaT濃度依賴(lài)性作用時(shí)，待藥物作用穩(wěn)定后(2.5min)，才能加入下一個(gè)濃度藥物。圖5為淫羊藿苷對(duì)LVM和LAM的I_NaT濃度依賴(lài)性抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；其中：A為對(duì)照組電流圖，B為10μmol/L淫羊藿苷干預(yù)組電流圖，C為不同濃度的淫羊藿苷對(duì)LVM和LAM的I_NaT的影響的I-V曲線。從圖5可以看出：淫羊藿苷(1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L和20μmol/L)濃度依賴(lài)性地抑制LVM和LAM的I_NaT。淫羊藿苷抑制LVM和LAM的I_NaT，IC₅₀依次為11.83±0.92μmol/L(n＝10)和12.28±0.29μmol/L(n＝13)。結(jié)果表明：淫羊藿苷對(duì)LVM的I_NaT的抑制效果與對(duì)LAM的I_NaT的抑制效果相似(p>0.05)。

另有試驗(yàn)證明：加入20μmol/L淫羊藿苷前和加入20μmol/L淫羊藿苷后，LVM半數(shù)失活電壓V_1/2依次為-85.47±1.36mV和-91.45±1.48mV(n＝8，與對(duì)照組相比p＜0.01)，斜率k依次為8.48±1.05和8.28±0.76(n＝8，與對(duì)照組相比p＞0.05)；LAM的半數(shù)失活電壓V_1/2依次為-76.1±1.52mV和-82.28±0.96mV(n＝6，與對(duì)照組相比p＜0.01)，k依次為8.29±1.64和8.72±0.81(n＝6，與對(duì)照組相比p＞0.05)。結(jié)果表明：淫羊藿苷能使LVM和LAM的I_NaT穩(wěn)態(tài)失活曲線左移，說(shuō)明淫羊藿苷能加速I(mǎi)_NaT的失活過(guò)程，且不影響斜率k，但是對(duì)LVM和LAM的穩(wěn)態(tài)激活曲線都沒(méi)有作用。

給LVM施加一個(gè)從-80mV以5mV階躍去極化至+60mV的電壓脈沖，持續(xù)300ms，頻率為0.5Hz，鉗制在-90mV，可以記錄到I_NaL，在200ms時(shí)測(cè)量其大小。為了鑒別所記錄電流是否為I_NaL，向細(xì)胞外液中加入4μmol/L河豚毒素可將I_NaL從-0.39±0.004pA/pF減小到-0.13±0.023pA/pF(n＝6，與對(duì)照組相比p＜0.01)，但不改變I_NaT，這種河豚毒素敏感的電流即為I_NaL。圖6為淫羊藿苷對(duì)ATX-II增大的LVM的I_NaL的濃度依賴(lài)性抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；其中：A為對(duì)照組電流圖，B為10nmol/L的ATX-II干預(yù)組電流圖，C為10nmol/L的ATX-II+40μmol/L淫羊藿苷干預(yù)組電流圖，D為不同濃度的淫羊藿苷對(duì)ATX-II增大的LVM的I_NaL的影響的I-V曲線。從圖6可以看出：10nmol/L的ATX-II可使I_NaL明顯增大，淫羊藿苷(1μmol/L，10μmol/L，20μmol/L和40μmol/L)能濃度依賴(lài)性的抑制ATX-II增大的I_NaL(n＝6)。

3.5、淫羊藿苷對(duì)I_CaL的作用

將LVM細(xì)胞鉗制在-40mV，去極化至+5mV，持續(xù)300ms，頻率為0.2Hz，連續(xù)記錄I_CaL。在對(duì)照條件下I_CaL有run down現(xiàn)象(隨機(jī)記錄時(shí)間的延續(xù)，通道電流逐漸減小的現(xiàn)象)，持續(xù)5min，下降8.5％，然后趨向穩(wěn)定，基本穩(wěn)定時(shí)間為15min，并且在這段穩(wěn)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)：第一根電流曲線為對(duì)照并開(kāi)始用含10μmol/L的淫羊藿苷的灌流液沖灌細(xì)胞，第10根(用藥后第45秒)至第13根(用藥后第60秒)之間可見(jiàn)I_CaL迅速減小，之后隨著時(shí)間的延續(xù)I_CaL逐漸變小，第27根(用藥后130秒)時(shí)藥物作用穩(wěn)定后開(kāi)始復(fù)灌(無(wú)淫羊藿苷)，第55根(用藥后270秒)時(shí)，I_CaL恢復(fù)82％,達(dá)到最大值。以上結(jié)果表明，淫羊藿苷對(duì)I_CaL不僅有抑制作用，且藥效作用快也容易洗脫，是一種可逆性抑制。

在研究淫羊藿苷對(duì)I_CaL濃度依賴(lài)性作用時(shí)，待藥物作用穩(wěn)定后(2.5min)，才能加入下一個(gè)濃度藥物。圖7為淫羊藿苷對(duì)LVM和LAM的I_CaL濃度依賴(lài)性抑制試驗(yàn)結(jié)果圖；其中：A為對(duì)照組電流圖，B為10μmol/L淫羊藿苷干預(yù)組電流圖，C為不同濃度的淫羊藿苷對(duì)LVM和LAM的I_CaL影響的I-V曲線。從圖7可以看出：淫羊藿苷能濃度依賴(lài)性的抑制LVM和LAM的I_CaL；淫羊藿苷抑制LVM和LAM的I_CaL，IC₅₀依次為4.78±0.89μmol/L(n＝8)和13.43±2.73μmol/L(n＝9)。

另有試驗(yàn)證明：10μmol/L淫羊藿苷可以使LVM的穩(wěn)態(tài)失活曲線的V_1/2從-25.7±1.01mV偏移到-28.87±2.18mV(n＝10，與對(duì)照組相比p＜0.01)，k從7.16±1.08變成7.52±2.31(與對(duì)照組相比p>0.05)；10μmol/L淫羊藿苷可以使LAM的穩(wěn)態(tài)失活曲線的V_1/2從-29.96±0.85mV偏移到-33.94±1.33mV(n＝10，與對(duì)照組相比p＜0.01)，k從5.86±0.82變成7.4±1.14(與對(duì)照組相比p<0.01)。結(jié)果表明淫羊藿苷能使LVM和LAM的I_CaL失活曲線向左偏移，失活加快。

3.6淫羊藿苷對(duì)鉀電流的作用

在研究淫羊藿苷對(duì)I_K1、I_Kr、I_to和I_Kur的作用時(shí)，待藥物作用穩(wěn)定(8min)后，才能繼續(xù)加入下一個(gè)濃度。

從-120mV開(kāi)始以5mV階躍去極化至+50mV，持續(xù)400ms，頻率為0.5Hz，將LVM鉗制在-40mV(為了使鈉通道失活)，可以引出I_K1。依次加入10μmol/L和40μmol/L淫羊藿苷，I_K1大小無(wú)明顯變化(n＝18)。

將LVM鉗制在-40mV，以10mV的階躍去極化至+50mV，持續(xù)3s，然后復(fù)極化至-40mV，持續(xù)5s，記錄I_Kr，只測(cè)量其尾電流。依次加入10和40μmol/L的淫羊藿苷，I_Kr的尾電流大小無(wú)明顯變化(n＝12)。

記錄LAM的I_to的脈沖為鉗制在-80mV，直接去極化至-40mV，持續(xù)100ms(阻斷鈉電流)，然后以10mV階躍去極化至+50mV，持續(xù)400ms。加入40μmol/L的淫羊藿苷，I_to大小無(wú)明顯變化(n＝15)。

將細(xì)胞鉗制在-50mV，直接去極化至+30mV，持續(xù)80ms，這段預(yù)脈沖是為了阻斷I_to，復(fù)極化到-50mV，持續(xù)50ms，從-40mV開(kāi)始以10mV的階躍去極化至+60mV，持續(xù)140ms，復(fù)極化至-30mV，可以引出I_Kur。依次加入20mol/L和40μmol/L的淫羊藿苷，I_Kur大小無(wú)明顯變化(n＝15)。

綜上所述，淫羊藿苷能在制備治療心律失常藥物中應(yīng)用；所述藥物為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒體、注射液、片劑或口服液。

本具體實(shí)施方式具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

1.淫羊藿苷兼有I和IV類(lèi)抗心律失常的藥理作用，同時(shí)還能抑制I_NaL。通過(guò)阻滯I_CaL、I_NaL和I_NaT，淫羊藿苷不僅抑制ISO和高鈣引起的DAD和TA，而且還抑制由ATX-II誘發(fā)的EAD；故對(duì)細(xì)胞性心律失常(EAD、DAD和TA)具有顯著的抑制效應(yīng)。

2.淫羊藿苷還能明顯抑制心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極的頻率依賴(lài)性，即隨著心率或刺激頻率的增加APD逐漸縮短，反之則延長(zhǎng)。

3.淫羊藿苷不僅對(duì)LVM的I_K1和I_Kr無(wú)明顯作用，且對(duì)LAM的I_to和I_Kur亦無(wú)明顯作用，尤其是對(duì)I_Kr和I_K1沒(méi)有影響，增加了使用安全性。

4.在整體(活體)條件下，淫羊藿苷可以延長(zhǎng)和增加烏頭堿誘發(fā)心律失常的發(fā)生時(shí)間(時(shí)間閾值)和用量(劑量閾值)，同時(shí)有效降低其誘發(fā)室性心動(dòng)過(guò)速和室顫的發(fā)生率以及新西蘭大耳兔的死亡率。

因此，淫羊藿苷可成為一種新的和有效的治療心律失常藥物。

應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。