本發(fā)明屬于粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素在制藥中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及菌種保藏編號(hào)為cctccno:m2011054的粒毛盤菌的胞內(nèi)黑色素(簡(jiǎn)稱lim30)作為治療急性肝損傷藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性肝損傷是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，可在短時(shí)間內(nèi)損害肝功能并導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。細(xì)菌脂多糖(lps)與d-氨基半乳糖(d-galn)引起的急性肝損傷通常伴隨大量的炎癥反應(yīng)，臨床上使用的治療藥物如地塞米松是一類糖皮質(zhì)激素，可以快速有效的起到抗炎功效，但是長(zhǎng)時(shí)間使用易引起不良反應(yīng)，如類腎上腺皮質(zhì)亢進(jìn)綜合征，還可能會(huì)進(jìn)一步加重病情。因此，從天然產(chǎn)物中尋找急性肝損傷的治療藥物具有重要的意義。
黑色素廣泛分布在生物界。據(jù)《色素細(xì)胞研究》(pigmentcellresearch，2005,18(2):130–135.)介紹，黑色素是由多羥基酚、多羥基吲哚與吡咯氧化而成的構(gòu)造不規(guī)則的化合物。本發(fā)明人課題組于2011年3月2日已將一種粒毛盤菌菌株保藏于武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:m2011054，已收到保藏菌株成活的證明通知；并公開(kāi)了名稱為“一種水溶性粒毛盤菌黑色素及其作為促排鉛藥物的用途”、專利申請(qǐng)?zhí)枮閦l201410306301.7的發(fā)明專利，該粒毛盤菌黑色素具有促排鉛功效?！秶?guó)際生物大分子》(internationaljournalofbiologicalmacromolecules,2014,63:170-176.)報(bào)道了一種粒毛盤菌黑色素lem404的提取方法，并發(fā)現(xiàn)其具有抗輻射活性。但至今未見(jiàn)有文獻(xiàn)公開(kāi)提及將粒毛盤菌黑色素作為對(duì)lps/d-galn誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)劑方面的應(yīng)用報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素作為急性肝損傷的抗炎保肝藥物的用途，以滿足人們對(duì)抗炎保肝藥物的需求。
本發(fā)明粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素作為急性肝損傷藥物的用途，其特征在于：所述粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素，是將菌種保藏編號(hào)為cctccno:m2011054的粒毛盤菌的菌株子實(shí)體接種于發(fā)酵罐，培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/l，酵母膏5.0g/l，蛋白胨5.0g/l，ph自然，裝料系數(shù)體積比為0.7，接種量體積比為5％，培養(yǎng)溫度為28℃，通氣量為1.0l/min，攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵時(shí)間為12d；將發(fā)酵液抽濾，收集菌絲體，60℃烘干，按菌絲體的質(zhì)量(g)與濃度為1mol/l的氫氧化鈉水溶液的體積(ml)比為1:50(g/ml)混勻，室溫靜置24h，抽濾得浸提液；向上述浸提液加入濃度1mol/l的hcl調(diào)節(jié)ph為1～2，靜置12h后將上述懸浮液離心，所得到的沉淀經(jīng)去離子水洗滌至ph為7后，真空冷凍干燥，即得黑色素粗品；再將該黑色素粗品加入6mol/lhcl后于100℃酸解6h。酸解后，抽濾得沉淀，沉淀經(jīng)雙蒸水洗滌至上清液ph值為7時(shí)重新溶于0.5mol/lnh3·h2o溶液，水浴蒸去nh3至溶液ph為中性后，依次經(jīng)氯仿、乙酸乙酯萃取，加入無(wú)水乙醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，使用200da透析袋流水透析48h，去離子水透析24h，真空冷凍干燥，所得到的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30(本發(fā)明人課題組自己的命名代碼)，通過(guò)將該粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30對(duì)lps/d-glan誘導(dǎo)的急性肝損傷治療作用的藥理實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)其具有抗炎保肝活性，并確定其有效劑量，從而將其用于治療急性肝損傷的抗炎保肝藥物----可按藥劑學(xué)的常規(guī)制備方法，將有效量的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30與藥用輔料混合，加工制備成片劑或膠囊。
本發(fā)明通過(guò)藥理學(xué)試驗(yàn)，首次證實(shí)粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30可以通過(guò)降低炎性因子水平、提高抗炎因子水平、降低炎性介質(zhì)水平達(dá)到抗炎保肝的作用，并且無(wú)毒，該種藥物可以通過(guò)膠囊、片劑形式給藥，是一種優(yōu)良的抗炎保肝藥物。同時(shí)，使用粒毛盤菌發(fā)酵生產(chǎn)，為大規(guī)模生產(chǎn)該黑色素及相關(guān)產(chǎn)品提供可能，不產(chǎn)生污染，能產(chǎn)生較好的規(guī)模效益。
附圖說(shuō)明
圖1給出了作比較的小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查放大400倍的光學(xué)顯微鏡照片(400×)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
(一)粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30的制備
將本發(fā)明人課題組2011年3月2日保藏于武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號(hào)為cctccno:m2011054的粒毛盤菌的菌株子實(shí)體接種于發(fā)酵罐，培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/l，酵母膏5.0g/l，蛋白胨5.0g/l，ph自然，裝料系數(shù)體積比為0.7，接種量體積比為5％，培養(yǎng)溫度為28℃，通氣量為1.0l/min，攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵時(shí)間為12d；將發(fā)酵液抽濾，收集菌絲體，60℃烘干，按菌絲體的質(zhì)量與濃度為1mol/l的氫氧化鈉水溶液體積比為1:50混勻，室溫靜置24h，抽濾得浸提液；向上述浸提液加入1mol/lhcl調(diào)節(jié)ph為1～2，靜置12h后將上述懸浮液離心，所得到的沉淀經(jīng)去離子水洗滌至ph為7后，真空冷凍干燥，即得黑色素粗品；再將該黑色素粗品加入6mol/lhcl后于100℃酸解6h。酸解后，抽濾得沉淀，沉淀經(jīng)雙蒸水洗滌至上清液ph值為7時(shí)重新溶于0.5mol/lnh3·h2o溶液，水浴蒸去nh3至溶液ph為中性后，依次經(jīng)氯仿、乙酸乙酯萃取，加入無(wú)水乙醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)相，使用200da透析袋流水透析48h，去離子水透析24h，真空冷凍干燥，即得到粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30(本發(fā)明人課題組自己命名的名稱代碼)。
(二)藥理實(shí)驗(yàn)
(1)實(shí)驗(yàn)小鼠選用雄性昆明小鼠(20±2g)在室溫25±1℃下在12h光照/黑暗循環(huán)下飼養(yǎng)在動(dòng)物護(hù)理設(shè)施中，并給予自由飲食和飲水。在治療之前，將小鼠放置7d以適應(yīng)新的環(huán)境。
(2)模型藥物為脂多糖(lps)，d-氨基半乳糖(d-galn)；陽(yáng)性藥物為地塞米松注射液(購(gòu)自江西博萊大藥廠)。
(3)將小鼠隨機(jī)分為以下7組：
正常組：生理鹽水，灌胃；
模型組：500mg/kgd-galn+25μg/kglps，腹腔注射；
陽(yáng)性組：lps+galn+地塞米松1mg/kg，腹腔注射；
lim30低劑量實(shí)驗(yàn)組：(50mg/kglim30，灌胃)+(lps+d-galn，腹腔注射)；
lim30高劑量實(shí)驗(yàn)組：(100mg/kglim30，灌胃)+(lps+d-galn，腹腔注射)；
lim30低劑量對(duì)照組：50mg/kglim30，灌胃；
lim30高劑量對(duì)照組：100mg/kglim30，灌胃。
所有組每天灌胃一次，連續(xù)7d。在第7d灌胃后1h腹腔內(nèi)注射溶解在生理鹽水中的lps、d-galn，注射陽(yáng)性藥物。5h后，眼球取血，收集血清和肝組織用于隨后的分析。
(4)檢測(cè)指標(biāo)有：
小鼠體重和器官指數(shù)測(cè)定：
稱量小鼠體重；小鼠取血后處死，取其肝臟、脾臟及胸腺并稱重，分別計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100。
小鼠生化指標(biāo)測(cè)定：
血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)、inos合酶(試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、白介素-8(il-8)、白介素-1β(il-1β)、白介素-4(il-4)、白介素-10(il-10)、no含量和肝臟核轉(zhuǎn)錄因子kappab(nf-κb)含量(試劑盒購(gòu)自上海研生生物技術(shù)有限公司)。no的含量通過(guò)格瑞斯(griess)比色反應(yīng)檢測(cè)和定量。
肝臟病理學(xué)觀察：
將肝組織在10％多聚甲醛中固定48h，并包埋在石蠟中并切成5μm切片。然后切片進(jìn)行h&e染色，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察
(5)采用spss17軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。多組之間進(jìn)行鄧肯多重范圍檢驗(yàn)(duncan'smultiple-rangetests)，p<0.05即為差異顯著，相同字母間差異不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用
(三)藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
(1)lim30對(duì)小鼠體重和器官指數(shù)的影響
如表1所示，小鼠的體重范圍在45.77±3.33與41.66±3.67之間，實(shí)驗(yàn)組與模型組小鼠體重整體小于正常組體重，但各組小鼠體重之間并無(wú)顯著性差異。小鼠肝臟指數(shù)范圍在4.65±0.22到5.74±0.10之間，由表1可以看出模型組肝臟指數(shù)顯著高于正常組小鼠(p<0.05)，lim30實(shí)驗(yàn)組肝臟指數(shù)高于正常組小鼠，但并不具備顯著性差異。各組脾臟、胸腺指數(shù)均有不同程度升高。
表1lim30預(yù)處理對(duì)小鼠體重及器官指數(shù)的影響
(2)lim30對(duì)小鼠血清alt和ast含量的影響
如表2所示，建模后小鼠血清中alt和ast的含量顯著升高(p<0.05)，表明本研究中l(wèi)ps/d-galn聯(lián)合誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型建立成功。通過(guò)表2我們可以看出，lim30實(shí)驗(yàn)組可以有效降低血清中alt和ast的含量，且呈劑量依賴性。lim30對(duì)照組與正常組相比alt和ast略有升高但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
表2lim30對(duì)小鼠血清中alt和ast的含量的影響
(3)lim30對(duì)小鼠血清炎性因子的影響
如表3所示，與正常組相比模型組中tnf-α、il-1β和il-8水平均顯著升高(p<0.05)，lim30實(shí)驗(yàn)組顯著降低了小鼠血清中炎性因子的含量(p<0.05)并呈劑量依賴性。
表3lim30對(duì)小鼠血清炎性因子的影響
(4)lim30對(duì)小鼠血清抗炎因子的影響
如表4所示，各組il-4水平均高于正常組，模型組小鼠血清中il-4含量高于正常組，lim30對(duì)照組小鼠血清中含量高于正常組，但并不具有顯著性。lim30實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中il-4含量顯著高于模型組(p<0.05)。如圖所示，模型組小鼠血清中il-10的含量高于正常組小鼠。各治療組小鼠血清中il-10含量略高于模型組小鼠。
表4lim30對(duì)小鼠血清抗炎因子的影響
(5)lim30對(duì)小鼠血清inos和no的影響
結(jié)果如表5所示，炎癥肝損傷模型組血清中no、inos含量與正常對(duì)照組相比，有顯著性增加(p<0.05)；lim30實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的no、inos含量與模型組相比，有顯著性減少(p<0.05)，其中高劑量組效果優(yōu)于低劑量組。
表5lim30對(duì)小鼠血清inos和no的影響
(6)lim30對(duì)小鼠肝臟nf-κb的影響
結(jié)果如表6所示，肝損傷模型小鼠肝臟nf-κb含量較正常組相比有顯著增加，lim30實(shí)驗(yàn)組對(duì)比于模型組小鼠肝臟nf-κb含量均有顯著降低(p<0.05)。lim30對(duì)照組nf-κb的含量與正常組相比有略微降低但并不具有顯著性。
表6lim30對(duì)小鼠肝臟nf-κb的影響
(7)小鼠肝臟組織病理學(xué)觀察
(8)圖1給出了作比較的小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查放大400倍的光學(xué)顯微鏡照片(400×)，按從左至右、從上到下的排列順序，依次分別為正常組、模型組、lim30低劑量實(shí)驗(yàn)組、lim30高劑量實(shí)驗(yàn)組、lim30低劑量對(duì)照組、lim30高劑量對(duì)照組的小鼠肝臟組織的圖片。由圖1中的照片作相互比較可見(jiàn)，正常組小鼠肝臟組織形態(tài)均一，結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞核，無(wú)變性及壞死，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)壞死及淤血等現(xiàn)象；從模型組的照片中可見(jiàn)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞索成條狀或者片狀排列，部分肝細(xì)胞水樣性變，肝竇擴(kuò)張，可見(jiàn)嗜酸性變，可見(jiàn)明顯小灶性壞死，可見(jiàn)細(xì)胞核濃縮，可見(jiàn)明顯充血淤血現(xiàn)象；從實(shí)驗(yàn)組的照片可見(jiàn)癥狀有明顯減輕，但與正常組相比仍有明顯變化；對(duì)照組的照片與正常組對(duì)比無(wú)差異。
(9)藥理學(xué)總結(jié)：
lps/d-galn誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是一種廣泛使用的用于研究保肝護(hù)肝藥物的模型。lps是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的組成部分，是一種用于免疫炎癥研究的物質(zhì)。d-galn是一種肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，在肝臟中通過(guò)半乳糖途徑代謝消耗尿苷二磷酸從而影響尿嘧啶核苷的代謝，并干擾rna和蛋白質(zhì)的合成，使肝細(xì)胞的功能出現(xiàn)損傷。
血清中alt、ast含量是常用的檢測(cè)肝臟損傷程度的指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，建模后小鼠血清alt、ast含量遠(yuǎn)高于正常組小鼠，而lim30實(shí)驗(yàn)組可顯著降低該值水平并呈劑量依賴效應(yīng)，從肝臟病理學(xué)觀察中也可看出lim30實(shí)驗(yàn)組改善了炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和小造性壞死，說(shuō)明lim30可以改善模型藥物對(duì)小鼠造成的肝損傷。
lps/d-galn已被證明可以誘導(dǎo)炎性細(xì)胞釋放各種炎性因子并引起肝細(xì)胞損傷。本研究對(duì)模型下小鼠體內(nèi)nf-κb、炎性因子tnf-α、il-1β、il-8，抗炎因子il-4、il-10，炎癥相關(guān)因子no、inos水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)lim30可以顯著降低模型藥物引起nf-κb、炎性因子及炎癥相關(guān)因子的升高，一定程度提升抗炎因子il-4、il-10的含量，減輕肝臟損傷。說(shuō)明lim30對(duì)lps/d-galn誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有一定治療作用。
(四)粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30制劑的加工
1.片劑加工：
將450-550g粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30與藥用輔料稀釋劑428-451g、助流劑45-65g混勻后280-580ml乙醇混合均勻制得軟材，軟材過(guò)篩得到濕顆粒，干燥后整粒最后加入潤(rùn)滑劑4-7g混勻后壓片，制成1000片片劑。所述藥用輔料稀釋劑選用糊精或干淀粉；所述助流劑采用滑石粉或微粉硅膠或微晶纖維素；所述潤(rùn)滑劑采用硬脂酸鎂或硬脂酸鋅
本發(fā)明推薦的片劑加工的優(yōu)選例為：取過(guò)80～100目篩的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素520g、稀釋劑糊精238g、助流劑滑石粉36g，混合均勻后加700ml乙醇混合均勻制得軟材，軟材過(guò)篩后干燥整粒，加入潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂6g混勻后壓片，制成1000片，片重0.8g，黑色素含量0.5g/片。
2.膠囊劑加工：
將藥用輔料稀釋劑200-270g、助流劑30-60g、潤(rùn)濕劑10-15g混勻后分別與300-600g的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素lim30混合均勻，裝入空心膠囊，制得膠囊劑1000粒。所述藥用輔料稀釋劑選用糊精或干淀粉；所述助流劑采用滑石粉或微粉硅膠或微晶纖維素；所述潤(rùn)濕劑采用十二烷基硫酸鈉或者磺基丁二酸二辛酯。
本發(fā)明推薦的膠囊劑加工優(yōu)選例為：取稀釋劑干淀粉250g，助流劑滑石粉37g，潤(rùn)濕劑十二烷基硫酸鈉13g混合均勻再分別與500g粒胞內(nèi)黑色素lim30混合均勻后裝空心膠囊1000粒，黑色素含量0.5g/粒。