本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及兩色金雞菊提取物在制備治療血栓形成性疾病藥物中的應用。

背景技術：

金雞菊（coreopsistinctorianuff.）又名雪菊，系菊科（compositae）金雞菊屬（coreopsis）的干燥頭狀花序，單瓣、重瓣或半重瓣，舌狀花黃色或金黃色，花期6～9月。大花金雞菊屬于北溫帶植物，原產(chǎn)于北美，弗羅里達州及墨西哥州，我國1936年作為觀賞植物引種子至廬山、南岳等地栽培，目前各地除供觀賞外，還用全草入藥，而且從花中提取的食用色素，具有清熱解毒和降壓之功效。新疆金雞菊廣泛分布于和田地區(qū)海拔高3000米左右的昆侖山區(qū)，有較豐富的野生資源，在民間經(jīng)常將其干花用來泡茶。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種兩色金雞菊提取物在制備治療血栓形成性疾病藥物中的應用。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了如下的技術方案：

兩色金雞菊提取物在制備治療血栓形成性疾病藥物中的應用，所述兩色金雞菊提取物為兩色金雞菊的乙醇提取物。所述治療血栓形成性疾病藥物為抗凝血藥物。所述兩色金雞菊提取物可通過抑制血栓素b2（txb2）生成、促進6酮-前列腺素f1α（6-keto-pg）生成、抑制二磷酸腺苷（adp）誘導的血小板聚集達到抗凝血功能。

優(yōu)選地，所述的乙醇提取物通過包括如下步驟的方法得到：兩色金雞菊先用濃度為50～80vt%的乙醇溶液浸漬5～15h，再于50～80℃回流提取，提取液濃縮、干燥。

優(yōu)選地，回流提取的料液比為1:10～20。

兩色金雞菊提取物在制備治療血栓形成性疾病藥物中的應用，所述治療血栓形成性疾病藥物為抗凝血藥物，通過抑制血栓素b2生成、促進6酮-前列腺素f1α生成、抑制由二磷酸腺苷誘導的血小板聚集、抑制由膠原蛋白（col）誘導的血小板聚集達到抗凝血功能，所述兩色金雞菊提取物通過如下方法得到：

（1）兩色金雞菊的乙醇提取物過大孔樹脂柱，依次用水、乙醇溶液洗脫，收到乙醇洗脫液；

（2）步驟（1）的乙醇洗脫液過聚酰胺柱，用乙醇溶液洗脫，得到的洗脫液濃縮、干燥。

優(yōu)選地，步驟（1）洗脫所用的乙醇溶液濃度為50～80vt%，步驟（2）洗脫所用的乙醇溶液濃度為10～70vt%。

本文中，以ete表示兩色金雞菊的乙醇提取物，以etep表示ete進一步經(jīng)過上述大孔樹脂和聚酰胺處理后得到的部位。

藥效學實驗

兩色金雞菊乙醇提取物（ete）對大鼠急性血栓模型的影響

材料與儀器

分組及給藥

將72只spraguedawley大鼠按體重隨機分成6組，每組12只雌雄各半，即空白組、急性血栓模型組、阿司匹林組（拜阿司匹林10mg/kg）、高劑量組（ete1.2g/kg）、中劑量組（ete0.6g/kg）、低劑量組（ete0.3g/kg），灌胃給藥，空白組和模型組大鼠灌胃給予等體積的空白溶劑。給藥21天，每天一次，灌胃量10ml/kg。

急性血栓模型的建立

末次給藥1h后，腹腔注射4%戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉，分離左側(cè)頸總動脈。將吸有20%三氯化鐵的1cm×1cm的濾包裹分離出的頸總動脈，計時20min后取下?？瞻捉M用生理鹽水浸泡濾紙，結扎紙小片兩側(cè)血管取下血栓稱重并做病理切片；腹主動脈取血，edta抗凝血測定血漿txb2及血漿6-keto-pg；3.8%枸櫞酸鈉抗凝血（枸櫞酸鈉：全血為1:9，v/v）用于aptt、pt、tt和fib含量的測定。

統(tǒng)計學方法

采用spss17.0軟件包對數(shù)據(jù)進行處理。結果以表示，數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

實驗結果

凝血四項及平均栓重結果

凝血四項及平均栓重結果見表1。

表1各組凝血四項及平均栓重的結果（n=12）

注：*與空白組比較p＜0.05，**與空白組比較p＜0.01

#與模型組比較p＜0.05，##與模型組比較p＜0.01

pt結果顯示：與空白組相比，模型組的pt明顯縮短，且差異具有統(tǒng)計學意義；與空白組相比，高、中劑量組的明顯pt延長，且差異具有統(tǒng)計學意義；與空白組相比，低劑量組和阿司匹林組的pt沒有明顯延長；與模型組相比，高、中、低劑量組及阿司匹林組的pt均明顯延長，且差異具有統(tǒng)計學意義，給予ete干預后，對pt的延長程度顯示出劑量依賴性，低劑量延長pt的作用與阿司匹林相當，中劑量和高劑量延長pt的作用優(yōu)于阿司匹林。

tt結果顯示：與空白組相比，模型組的tt縮短，且差異具有統(tǒng)計學意義；與空白組相比，高、中、低劑量組tt均有不同程度的縮短，且差異具有統(tǒng)計學意義；與空白組相比，阿司匹林組的tt沒有明顯縮短；與模型組相比，阿司匹林組的tt明顯延長，且差異具有統(tǒng)計學意義。

aptt結果顯示：與空白組相比，模型組和低劑量組的aptt縮短，且差異具有統(tǒng)計學意義；與空白組相比，高劑量組的aptt延長，且差異具有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，高、中劑量組和阿司匹林組的aptt均明顯延長，且差異具有統(tǒng)計學意義，給予ete干預后，對aptt延長程度顯示出劑量依賴性，高劑量延長aptt的作用優(yōu)于阿司匹林。

fib結果顯示：本實驗的干預對fib的含量沒有明顯影響。

平均栓重結果顯示：與空白組相比，模型組的平均栓重明顯增加，且差異具有統(tǒng)計學意義；與空白組相比，高、中、低劑量組和阿司匹林組的平均栓重均有不同程度增加，且差異具有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，高、中、低劑量組和阿司匹林組的平均栓重均明顯減輕，差異且具有統(tǒng)計學意義，給予ete干預后，對平均栓重減輕程度顯示出劑量依賴性，中劑量減輕平均栓重的作用與阿司匹林相當，高劑量減輕平均栓重的作用優(yōu)于阿司匹林。

血漿txb2含量及血漿6-keto-pg含量結果

血漿txb2含量及血漿6-keto-pg含量結果見表2。

表2各組血漿txb2及血漿6-keto-pg結果（n=12）

注：*與空白組比較p＜0.05，**與空白組比較p＜0.01

#與模型組比較p＜0.05，##與模型組比較p＜0.01

6-keto-pg含量結果顯示：與空白組相比，模型組、低劑量組和阿司匹林組血漿中6-keto-pg的含量均下降，且差異具有統(tǒng)計學意義；與空白組相比，高、中劑量組血漿中6-keto-pg的含量均上升，差異且具有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，高、中、低劑量組和阿司匹林組血漿中6-keto-pg的含量均上升，且差異具有統(tǒng)計學意義，給予ete干預后，血漿中6-keto-pg的含量增加程度顯示出劑量依賴性，低劑量增加血漿中6-keto-pg的含量的作用與阿司匹林相當，高劑量、中劑量增加血漿中6-keto-pg的含量的作用優(yōu)于阿司匹林。

txb2含量結果顯示：與空白組相比，模型組血漿txb2含量增加，且差異具有統(tǒng)計學意義；與空白組相比，高、中、低劑量組和阿司匹林組血漿txb2含量均減少，差異且具有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，高、中、低劑量組和阿司匹林組血漿txb2含量均減少，且差異具有統(tǒng)計學意義，給予ete干預后，血漿中的txb2含量減少程度顯示出劑量依賴性。

血管組織的病理形態(tài)學改變的分析報告

一、各組血管改變的常規(guī)病理變化如圖1-6所示

二、結果：

光鏡下（100×、400×）觀察血管組織形態(tài)，結果顯示：

生理鹽水組（圖1共9例）：血管管壁結構完整，層次清晰。內(nèi)膜內(nèi)皮細胞完好，均無增生、腫脹等病理形態(tài)，彈力纖維排列整齊，環(huán)層平滑肌細胞排列完好，外膜為較薄的纖維結締組織。

模型組（圖2共12例）：血管內(nèi)膜完整性缺失，內(nèi)皮細胞破壞，彈力纖維斷裂。管壁擴張、變薄、纖維化改變。內(nèi)見混合性血栓形成。

ete高劑量組（圖3共11例）：血管內(nèi)膜完整性缺失，內(nèi)皮細胞破壞，彈力纖維斷裂。管壁擴張、變薄、纖維化改變。內(nèi)見血栓溶解。與m組比較改善明顯。

ete中劑量組（圖4共12例）：血管內(nèi)膜完整性缺失，內(nèi)皮細胞破壞，彈力纖維斷裂。管壁擴張、變薄、纖維化改變。內(nèi)見血栓溶解。與m組比較改善明顯。

ete低劑量組（圖5共10例）：血管內(nèi)膜完整性缺失，內(nèi)皮細胞破壞，彈力纖維斷裂。管壁擴張、變薄、纖維化改變。內(nèi)見血栓部分溶解。與m組比較有改善。

阿司匹林組（圖6共12例）：血管內(nèi)膜完整性缺失，內(nèi)皮細胞破壞，彈力纖維斷裂。管壁擴張、變薄、纖維化改變。內(nèi)見血栓溶解。與m組比較改善明顯。

三、結論

1、模型組與生理鹽水組比較，其病理變化符合血栓形成病理改變，模型造模成功；

2、各組血栓病理變化改善情況比較：ete高劑量組＞ete中劑量組≈阿司匹林組＞ete低劑量組，各組與模型組比較病理變化都有改善，其中ete高劑量組、中劑量組、阿司匹林組與模型組比較病理變化改善明顯。

兩色金雞菊提取物抗凝血作用研究

1.1兩色金雞菊醇提物對小鼠出、凝血時間的影響

將km小鼠按體重隨機分組，每組10只雌雄各半。分組及給藥情況：蒸餾水組，阿司匹林組（asp0.05g/kg），醇提物組（ete1.28g/kg），灌胃給藥，連續(xù)7天。末次給藥30min后，用斷尾法測定出血時間，玻璃片法測定凝血時間。

1.2兩色金雞菊提取物（ete、etep）對健康志愿者血小板聚集的影響

1.2.1血漿樣品的制備

采集健康志愿者靜脈血，血液以3.8%枸櫞酸鈉抗凝（9：1）。血漿先以1200r/min離心10min，吸取上層富血小板血漿（prp），剩余血液3000r/min，離心15min，吸取上清液為貧血小板血漿（ppp）。用ppp調(diào)整prp中的血小板個數(shù)為2～3×10¹¹個/l。

1.2.2體外對adp誘導的健康志愿者血小板聚集的影響

用490-4d血小板凝聚儀測定血小板聚集率。按照born比濁法，在比色杯中分別加入ppp和250μl調(diào)整好血小板數(shù)的prp，在比色杯中同時加入30μl供試液，在37℃下孵育5min，用ppp調(diào)零，在加入10μladp測定血小板聚集率，記錄5min內(nèi)最大聚集率。血小板抑制率=（對照組最大抑制率-藥物組最大抑制率）/對照組最大抑制率×100%。

1.2.3體外對col誘導的健康志愿者血小板聚集的影響

用490-4d血小板凝聚儀測定血小板聚集率。按照born比濁法，在比色杯中分別加入ppp和250μl調(diào)整好血小板數(shù)的prp，在比色杯中同時加入30μl供試液，在37℃下孵育5min，用ppp調(diào)零，在加入30μlcol測定血小板聚集率，記錄5min內(nèi)最大聚集率。血小板抑制率=（對照組最大抑制率-藥物組最大抑制率）/對照組最大抑制率×100%。

1.3統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以表示，采用spss17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用單因素方差分析（one-wayanova）。

2.結果

2.1兩色金雞菊醇提物對小鼠出、凝血時間的影響

與對照組相比，兩色金雞菊醇提物組能顯著延長小鼠出、凝血時間（p＜0.01），且與阿司匹林組相比，兩色金雞菊醇提物組出血時間顯著延長（p＜0.01）（表3）。

表3兩色金雞菊醇提物對小鼠出、凝血時間的影響（n=10）

與對照組比較：*p＜0.01

與阿司匹林組比較：#p＜0.01

2.2兩色金雞菊提取物體外對adp誘導的健康志愿者血小板聚集的影響

與對照組相比，ete組：300μg/ml能明顯抑制adp誘導的健康志愿者血小板聚集（p＜0.05），900μg/ml抑制作用顯著（p＜0.01）；etep組：450μg/ml對adp誘導的健康志愿者血小板聚集抑制作用顯著（p＜0.01）（表4）。

表4兩色金雞菊提取物體外對adp誘導的健康志愿者血小板聚集的影響（n=6）

與對照組比較：*p＜0.05,**p＜0.01

2.3兩色金雞菊提取物體外對col誘導的健康志愿者血小板聚集的影響

與對照組相比，ete各濃度對col誘導的健康志愿者血小板聚集無明顯抑制作用；etep150μg/ml抑制作用顯著（p＜0.05）（表5）。

表5兩色金雞菊提取物體外對col誘導的健康志愿者血小板聚集的影響（n=6）

3.討論

本實驗研究結果表明，兩色金雞菊醇提物可顯著延長小鼠出血時間和凝血時間，且延長小鼠出血時間效果要優(yōu)于阿司匹林，因此可初步說明兩色金雞菊醇提物具有一定的抗凝血活性。

與空白對照組相比，ete中劑量（300μg/ml）組能明顯抑制adp引起健康志愿者血小板聚集（p＜0.05），高劑量（900μg/ml）組抑制作用顯著（p＜0.01）；etep高劑量（450μg/ml）組也同樣表現(xiàn)出顯著的抑制作用（p＜0.01），呈現(xiàn)劑量依賴關系。對col引起的健康志愿者血小板聚集，ete各濃度組均不能起到抑制作用，etep中劑量組（150μg/ml）能明顯抑制血小板聚集（p＜0.05）。本研究通過在體和體外兩部分實驗證明兩色金雞菊提取物可以不同程度的抑制adp、col引起的健康志愿者血小板聚集，具有抗凝血的藥理作用。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是生理鹽水組的血管組織形態(tài)；

圖2是模型組的血管組織形態(tài)；

圖3是ete高劑量組的血管組織形態(tài)；

圖4是ete中劑量組的血管組織形態(tài)；

圖5是ete低劑量組的血管組織形態(tài)；

圖6是阿司匹林組的血管組織形態(tài)。

具體實施方式

以下結合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1

取兩色金雞菊(1000g)置多功能提取罐中，于濃度為50vt%的乙醇溶液中浸漬5h（料液比1:10g:ml），回流提取2.5h（溫度50℃），所得提取液濾過。藥渣再用濃度為50vt%的乙醇溶液回流提取2.5h（料液比1:10g:ml，溫度50℃），濾過。合并濾液，至濃縮罐中減壓濃縮（物料溫度49℃，真空度0.08mpa），得濃縮液4l。濃縮液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)置1000ml。得到的濃縮液置于真空干燥箱中干燥（50～80℃，真空度0.09mpa），得棕黃色粉末（ete）。

實施例2

取兩色金雞菊(1000g)置多功能提取罐中，于濃度為80vt%的乙醇溶液中浸漬15h（料液比1:20g:ml），回流提取2.5h（溫度80℃），所得提取液濾過。藥渣再用濃度為80vt%的乙醇溶液回流提取2.5h（料液比1:20g:ml，溫度80℃），濾過。合并濾液，至濃縮罐中減壓濃縮（物料溫度49℃，真空度0.08mpa），得濃縮液4l。濃縮液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)置1000ml。得到的濃縮液置于真空干燥箱中干燥（50～80℃，真空度0.09mpa），得棕黃色粉末（ete）。

實施例3

hpd-100大孔樹脂，濕法裝柱，將濃度為10mg/ml的兩色金雞菊提取物（將實施例1的ete用乙醇溶解得到）上樣，吸附12h后，以5bv的蒸餾水淋洗脫至流出液無色澄清，無醇味為止，再用5bv濃度為50vt%的乙醇溶液使進行洗脫，收集醇洗脫液。將收集的醇洗脫液上聚酰胺柱，以聚酰胺填料吸附0.5h后，用1bv濃度為10vt%的乙醇溶液洗脫，得到的洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于50～80℃旋蒸至浸膏狀，將浸膏移至真空干燥箱內(nèi)，于50～80℃減壓干燥得到棕黃色粉末（etep）。

實施例4

hpd-100大孔樹脂，濕法裝柱，將濃度為30mg/ml的兩色金雞菊提取物（將實施例2的ete用乙醇溶解得到）上樣，吸附12h后，以10bv的蒸餾水淋洗脫至流出液無色澄清，無醇味為止，再用10bv濃度為80vt%的乙醇溶液使進行洗脫，收集醇洗脫液。將收集的醇洗脫液上聚酰胺柱，以聚酰胺填料吸附3h后，用10bv濃度為70vt%的乙醇溶液洗脫，得到的洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中于50～80℃旋蒸至浸膏狀，將浸膏移至真空干燥箱內(nèi)，于50～80℃減壓干燥得到棕黃色粉末（etep）。

本發(fā)明所述的乙醇溶液為乙醇的水溶液。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。