本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種乏氧改善的順鉑前藥脂質(zhì)體制劑及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤(tumour)是指機(jī)體在各種致瘤因子作用下，局部組織細(xì)胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因?yàn)檫@種新生物多呈占位性塊狀突起，也稱贅生物(neoplasm)。根據(jù)新生物的細(xì)胞特性及對機(jī)體的危害性程度，又將腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類，而癌癥即為惡性腫瘤的總稱。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤生長速度快，呈浸潤性生長，易發(fā)生出血、壞死、潰瘍等，并常有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，造成人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等，最終造成患者死亡。由于人口老齡化等原因，當(dāng)前我國癌癥發(fā)病率、死亡率呈持續(xù)增長趨勢。世界癌癥報(bào)告估計(jì)，2012年中國癌癥發(fā)病人數(shù)為306.5萬，約占全球發(fā)病人數(shù)的五分之一；癌癥死亡人數(shù)為220.5萬，約占全球癌癥死亡人數(shù)的四分之一。今后20年，我國癌癥的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)還將持續(xù)上升：根據(jù)國際癌癥研究署預(yù)測，如不采取有效措施，我國癌癥發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)到2020年將上升至400萬人和300萬人；2030年將上升至500萬人和350萬人。

放療和化療是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的兩種癌癥治療方法，由于放療和化療各有其優(yōu)勢和不足，比如放療具有局部限制性和耐受性，化療具有較大的副作用和藥物耐受性，所以為了進(jìn)一步提高治療的效果，放療和化療相結(jié)合的治療方案在臨床被廣泛地推廣應(yīng)用開來。然而，放化療的治療效果仍然被復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境所限制。

由于惡性腫瘤生長迅速，內(nèi)部血管生長、分布不均勻，容易造成腫瘤組織內(nèi)氧氣、養(yǎng)料供應(yīng)不足，進(jìn)而導(dǎo)致部分區(qū)域的癌細(xì)胞嚴(yán)重乏氧甚至癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。有大量研究表明，腫瘤內(nèi)乏氧區(qū)域?qū)εR床上常用的癌癥治療方法(如：化療、放療)的效果會產(chǎn)生重要的影響，是癌細(xì)胞對常規(guī)的化療、放療產(chǎn)生耐受性以及癌癥治療失敗的重要原因之一。目前大量的科學(xué)家致力于開發(fā)改善腫瘤乏氧的藥物，用以改善放化療治療效果，以實(shí)現(xiàn)對腫瘤的高效殺滅。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本申請?zhí)峁┮环N乏氧改善的順鉑前藥脂質(zhì)體制劑及其制備方法與應(yīng)用，本申請?zhí)峁┑捻樸K前藥脂質(zhì)體制劑具有良好的提高腫瘤區(qū)域氧氣含量增敏放療的效果，同時(shí)結(jié)合化療藥物順鉑產(chǎn)生良好的腫瘤協(xié)同治療效果。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種順鉑前藥脂質(zhì)體制劑，包括脂質(zhì)體、順鉑前藥和過氧化氫酶；所述脂質(zhì)體中心為親水區(qū)，所述過氧化氫酶包裹于脂質(zhì)體中心的親水區(qū)，順鉑前藥裝載在脂質(zhì)體的疏水區(qū)域。

本發(fā)明這種脂質(zhì)體制劑即脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑，主要由脂質(zhì)體、順鉑前藥和過氧化氫酶組成。

其中，過氧化氫酶(CAT)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的過氧化物酶，在動物的各個(gè)組織中都有存在，尤其在肝臟中的濃度最高。過氧化氫酶能夠催化H₂O₂產(chǎn)生O₂和H₂O，以免H₂O₂與O₂在Fe螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的-OH，從而達(dá)到調(diào)控和清除動物體內(nèi)有害H₂O₂的作用；反應(yīng)式如下：

本發(fā)明所述順鉑前藥為四價(jià)順鉑前藥；在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，所述順鉑前藥由順鉑和過氧化氫以及丁二酸酐反應(yīng)生成。

順鉑是一種臨床常用的化療藥物，能夠殺傷多種癌癥細(xì)胞，具有一定的臨床普適性。順鉑的化學(xué)名是順式二氨基二氯絡(luò)鉑，分子式為Cl₂(NH₃)₂Pt，英文縮寫為DDP或PDD。前體藥物也稱前藥、藥物前體、前驅(qū)藥物等，是指藥物經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后得到的在體外無活性或活性較小、在體內(nèi)經(jīng)酶或非酶的轉(zhuǎn)化釋放出活性藥物而發(fā)揮藥效的化合物。在本發(fā)明的實(shí)施例中，順鉑前藥是在順鉑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入了另外兩條基團(tuán)鏈，以減低順鉑的副作用(神經(jīng)毒性和腎毒性)。

脂質(zhì)體(liposome)是一種人工膜；在水中磷脂分子親水頭部插入水中，脂質(zhì)體疏水尾部伸向空氣，攪動后形成雙層脂分子的球形脂質(zhì)體。其生物學(xué)定義：當(dāng)兩性分子如磷脂和鞘脂分散于水相時(shí)，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，稱為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的藥劑學(xué)定義：系指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體。

本發(fā)明所述脂質(zhì)體制劑中，過氧化氫酶包裹于脂質(zhì)體中心的親水區(qū)，順鉑前藥裝載在脂質(zhì)體的疏水區(qū)域。

本發(fā)明所述脂質(zhì)體制劑可以有效的在腫瘤部位富集，同時(shí)由于過氧化氫酶的存在，使得所述脂質(zhì)體制劑可以有效地氧化腫瘤區(qū)域的過氧化氫產(chǎn)生氧氣，以改善腫瘤乏氧。由于外放療使用X射線可以利用過氧化氫酶產(chǎn)生的O₂提高對癌細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)結(jié)合順鉑前藥的化療作用，最終實(shí)現(xiàn)對腫瘤的高效、協(xié)同殺滅。

傳統(tǒng)的順鉑脂質(zhì)體合成方法是將順鉑包埋在脂質(zhì)體的內(nèi)腔親水部分，而本發(fā)明第一次將順鉑前藥裝載在脂質(zhì)體的表面。該結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是提高了順鉑前藥的裝載效率，大概為50％，而傳統(tǒng)的裝載方法一般不超過20％。并且，本發(fā)明該脂質(zhì)體有了更多的親水內(nèi)腔來裝載過氧化氫酶。本發(fā)明第一次將順鉑前藥和過氧化氫酶設(shè)計(jì)進(jìn)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，通過改善腫瘤的乏氧，用以提高腫瘤的放化療效果。

按照本發(fā)明，在一些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑中，疏水區(qū)域裝載順鉑前藥的脂質(zhì)體由二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、膽固醇(CH)和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)及磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)-順鉑前藥組成。

其中，所述磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)-順鉑前藥、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的摩爾比可為(2～8):(0.1～8):(2～4):(0.5～1)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)-順鉑前藥、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的摩爾比優(yōu)選為8:8:4:1；其他比例如6：0.1：4：0.5和2：6：2：0.5亦可獲得。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)-順鉑前藥包括但不限于磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DSPE-Pt(IV))，二油酰磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DOPE-Pt(IV))，二棕櫚?；字Ｒ掖及?順鉑前藥(DPPE-Pt(IV))。

本發(fā)明一些實(shí)施例提供了磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DSPE-Pt(IV))的合成方法，順鉑和過氧化氫以及丁二酸酐先后反應(yīng)生成四價(jià)順鉑前藥，然后通過共價(jià)鍵和磷脂酰乙醇胺反應(yīng)，生成磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DSPE-Pt(IV))。

在本申請的實(shí)施例中，凡是帶有氨基結(jié)構(gòu)的諸如DOPE、DPPE都能與順鉑前藥通過共價(jià)鍵連接，合成上述類似的結(jié)構(gòu)。其中，所述磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)-順鉑前藥由四價(jià)順鉑前藥與磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)可按照(1～3):1的摩爾比例反應(yīng)生成，兩者的摩爾比優(yōu)選為2:1，產(chǎn)物質(zhì)量最佳。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的脂質(zhì)體制劑，其粒徑為90～140nm。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述脂質(zhì)體制劑可同時(shí)裝載光敏分子以及過氧化氫酶。其中，所述光敏分子如DiD(1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸鹽)、DiR(1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁碘化物)等熒光染料分子。

相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種順鉑前藥脂質(zhì)體制劑的制備方法，包括以下步驟：

提供可裝載的順鉑前藥；

將磷脂類物質(zhì)及附加劑與可裝載的順鉑前藥溶解于有機(jī)溶劑中，先吹干再水化，然后與過氧化氫酶溶液混合，進(jìn)行脂質(zhì)體擠膜，得到順鉑前藥脂質(zhì)體制劑。

所述制備方法具體可為：將二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)-順鉑前藥溶解于三氯甲烷溶液中，氮?dú)獯蹈?，水化攪拌后加入過氧化氫酶溶液，進(jìn)行脂質(zhì)體擠膜，得到順鉑前藥脂質(zhì)體制劑。

本發(fā)明實(shí)施例提供的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的制備方法中，將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、膽固醇(CH)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)和磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DSPE-Pt(IV))溶解于三氯甲烷溶液中，氮?dú)獯蹈?，水化攪拌后加入過氧化氫酶溶液進(jìn)行脂質(zhì)體擠膜。

其中，磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)-順鉑前藥如磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DSPE-Pt(IV))，即為可裝載的順鉑前藥，可由四價(jià)順鉑前藥與磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)優(yōu)選按照2:1的摩爾比例反應(yīng)生成。

本發(fā)明一些實(shí)施例提供了磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DSPE-Pt(IV))的合成方法，順鉑和過氧化氫以及丁二酸酐先后反應(yīng)生成四價(jià)順鉑前藥，然后通過共價(jià)鍵和磷脂酰乙醇胺反應(yīng)，生成磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DSPE-Pt(IV))。其中，理論上磷脂酰乙醇胺類物質(zhì)(如DOPE，DPPE)都可以和順鉑前藥以相同比例如2:1的摩爾比例反應(yīng)生成類似結(jié)構(gòu)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述脂質(zhì)體制劑的制備方法中所述二磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥、棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、膽固醇的摩爾比優(yōu)選為8:8:4:1。

本發(fā)明實(shí)施例所述的磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)采用市售產(chǎn)品即可，如Laysan bio、Avanti lipids等公司的產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述脂質(zhì)體制劑的制備方法中，所述攪拌優(yōu)選于40～70℃、更優(yōu)選于65℃攪拌。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述過氧化氫酶溶液中酶濃度可為5～10mg/mL，優(yōu)選為7.5mg/mL。

按照本發(fā)明，在一些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑的制備方法中制得的所述脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的粒徑為90～140nm。

利用本發(fā)明制備的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑，對小鼠通過尾靜脈注射，并由熒光成像技術(shù)對其體內(nèi)藥代動力學(xué)行為進(jìn)行監(jiān)測。實(shí)驗(yàn)表明，脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑能夠在腫瘤的部位具有很高的富集。通過免疫熒光染色的方法發(fā)現(xiàn)，腫瘤部位的乏氧狀況在注射本發(fā)明脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑后被大大改善。還發(fā)現(xiàn)，腫瘤乏氧改善后的放化療治療效果有了很大的改善，能夠更加有效地抑制腫瘤的生長。

因此，本發(fā)明還提供了所述脂質(zhì)體制劑(脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑)在制備改善腫瘤乏氧的治療腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用，包括：在制備改善腫瘤區(qū)域局部乏氧狀況、提高外放療治療效果的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，還提供了所述脂質(zhì)體制劑(脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑)在制備克服腫瘤乏氧、增強(qiáng)放化療的藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體制劑及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑(脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑)主要由脂質(zhì)體、順鉑前藥和過氧化氫酶組成，粒徑均一，在水中分散良好，在水中粒徑主要集中在100nm左右，可以同時(shí)裝載光敏分子(如DiD、DiR等)以及過氧化氫酶，是理想的藥物載體，具有良好的藥代動力學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在腫瘤的部位具有很高的富集，改善腫瘤區(qū)域局部乏氧狀況，提高外放療對癌細(xì)胞的殺傷效果，提高了放化療的治療效果，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤高效殺滅。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實(shí)施例1所得脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的透射電鏡圖；

圖2示實(shí)施例1所得脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在水中的粒徑分布；其中，實(shí)線表示脂質(zhì)體-順鉑前藥制劑(Pt(IV)-Liposome)在水中的粒徑；虛線表示脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑(CAT@Pt(IV)-Liposome)在水中的粒徑；

圖3示實(shí)施例1所得脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在過氧化氫溶液中催化產(chǎn)生的氧含量變化；其中，數(shù)值點(diǎn)為正方形的曲線表示對照組CTR過氧化氫溶液中氧氣濃度隨時(shí)間的變化；數(shù)值點(diǎn)為圓點(diǎn)的曲線表示加入脂質(zhì)體-順鉑前藥制劑(Pt(IV)-Liposome)后的過氧化氫溶液中氧氣濃度隨時(shí)間的變化；數(shù)值點(diǎn)為三角形的曲線表示加入脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑(CAT@Pt(IV)-Liposome)后的過氧化氫溶液中氧氣濃度隨時(shí)間的變化；

圖4示實(shí)施例1所得脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑基于不同過氧化氫酶濃度催化過氧化氫溶液導(dǎo)致的氧含量變化；其中，過氧化氫溶液中加入的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑中過氧化氫酶的濃度分別為0mg/L(方形數(shù)值點(diǎn)曲線)、0.06mg/L(向下三角數(shù)值點(diǎn)曲線)、0.12mg/L(向右三角數(shù)值點(diǎn)曲線)、0.24mg/L(五邊形數(shù)值點(diǎn)曲線)、0.48mg/L(十字線段數(shù)值點(diǎn)曲線)、0.96mg/L(單線段數(shù)值點(diǎn)曲線)；

圖5示實(shí)施例1所得脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在消化酶作用下酶活力的變化；其中，數(shù)值點(diǎn)為正方形的曲線表示過氧化氫酶溶液(Free CAT)在消化酶作用下酶活力隨時(shí)間的變化；數(shù)值點(diǎn)為圓點(diǎn)的曲線表示過脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑(CAT@Pt(IV)-Liposome)在消化酶作用下酶活力隨時(shí)間的變化；

圖6示實(shí)施例1所得脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在消化酶作用下催化過氧化氫溶液產(chǎn)生氧氣氣泡的示意圖；其中，1號溶液為過氧化氫溶液對照組(Control)；2號溶液為加入過氧化氫酶溶液(Free CAT)催化后的過氧化氫溶液；3號溶液為加入消化酶(Free CAT+Protease K)作用24h的過氧化氫酶溶液的過氧化氫溶液；4號溶液為加入脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑(CAT@Pt(IV)-Liposome)后的過氧化氫溶液；5號為加入消化酶作用24h的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑(CAT@Pt(IV)-Liposome+Protease K)的過氧化氫溶液；

圖7示實(shí)施例5小鼠注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑后，不同時(shí)間點(diǎn)在腫瘤部位富集情況的活體熒光成像圖；

圖8示實(shí)施例5小鼠注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑后，不同時(shí)間點(diǎn)在腫瘤部位富集情況的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖；

圖9示實(shí)施例5小鼠注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑24h后，在體內(nèi)各個(gè)器官分布的熒光成像圖；

圖10示實(shí)施例5小鼠注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑24h后，在體內(nèi)各個(gè)器官分布的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖；

圖11示實(shí)施例6免疫熒光染色的方法對小鼠腫瘤部位乏氧狀況變化的檢測，該圖為共聚焦顯微鏡的成像結(jié)果圖，其中橫坐標(biāo)為不同實(shí)驗(yàn)組(分別為：I，對照組(僅注生理鹽水)；II，注射脂質(zhì)體-過氧化氫酶制劑組；III，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥制劑組；IV，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑)；

圖12為示實(shí)施例6免疫熒光染色的方法對小鼠腫瘤部位乏氧狀況變化的熒光信號統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖，其中橫坐標(biāo)為不同實(shí)驗(yàn)組(分別為：I，對照組(僅注生理鹽水)；II，注射脂質(zhì)體-過氧化氫酶制劑組；III，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥制劑組；IV，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑)；

圖13示實(shí)施例7不同分組的小鼠腫瘤在光動力治療后腫瘤的生長曲線；其中，第一組，對照組(僅注生理鹽水)；第二組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥制劑組；第三組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑；第四組，只照射線組；第五組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥制劑24h后進(jìn)行射線照射治療組；第六組，注射脂質(zhì)體-過氧化氫酶制劑24h后進(jìn)行射線照射治療組；第七組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑24h后進(jìn)行射線照射治療組。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為了進(jìn)一步理解本申請，下面結(jié)合實(shí)施例對本申請?zhí)峁┑闹|(zhì)體制劑及其制備方法與應(yīng)用進(jìn)行具體地描述。

實(shí)施例1、脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的制備

將順鉑與過氧化氫在水溶液中充分氧化，得到產(chǎn)物溶入DMSO與丁二酸酐反應(yīng)生成四價(jià)順鉑前藥(具體制備內(nèi)容可參見文獻(xiàn)1.Rational Design of Polyion Complex Nanoparticles to Overcome Cisplatin Resistance in Cancer Therapy.Advance materials,2014,26,931-936.文獻(xiàn)2.Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV)Warheads.J.Am.Chem.Soc.,2009,131,14652–14653)，得到的順鉑前藥在經(jīng)過EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)活化后，在一定氯仿、乙醇和水的混合溶劑中與磷脂酰乙醇胺按照摩爾比例2:1反應(yīng)，生成磷脂酰乙醇胺-順鉑前藥(DSPE-Pt(IV))。

將DSPE-Pt(IV)、DPPC、CH、DSPE-PEG(5k，Laysan bio公司)按照摩爾比為8:8:4:1的比例稱取后，溶于三氯甲烷溶液中，用氮?dú)鈱⑷燃淄槿芤捍蹈?。加入磷酸緩沖液在65℃水浴中攪拌30分鐘后，加入過氧化氫酶溶液(7.5mg/mL)后，用200nm濾膜來回?cái)D壓20次，得到脂質(zhì)體制劑。

所述脂質(zhì)體制劑中，疏水性的結(jié)構(gòu)DSPE-Pt(IV)在脂質(zhì)體表面，親水性的過氧化氫酶在脂質(zhì)體親水內(nèi)部。

實(shí)施例2、脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶-熒光染料制劑的制備

將DSPE-Pt(IV)、DPPC、CH、DSPE-PEG(5k，Laysan bio公司)和DiD按照摩爾比為8:8:4:1：1的比例稱取后，根據(jù)實(shí)施例1中的步驟制備，得到脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶-熒光染料制劑。

實(shí)施例3、脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的性質(zhì)檢測

對實(shí)施例1制得的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑進(jìn)行定性檢測，分別進(jìn)行透射電鏡檢測、動態(tài)光散射。

其中，透射電鏡檢測的結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示，實(shí)施例1制得的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在水中呈單分散狀態(tài)分布，表明本發(fā)明制得的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的粒徑均一，在水中分散良好。

動態(tài)光散射檢測的結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示，實(shí)施例1制得的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在水中粒徑主要集中在100nm左右。

實(shí)施例4、脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的催化活力檢測

對實(shí)施例1制得的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑進(jìn)行催化活力檢測，分別進(jìn)行催化氧含量檢測、酶活力檢測。

催化氧含量結(jié)果如圖3、4所示，結(jié)果顯示，實(shí)施例1制得的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑能夠有效催化過氧化氫產(chǎn)生氧氣，提高過氧化氫溶液中的氧含量。

酶活性檢測的實(shí)施方法是：將過氧化氫酶或者包埋有過氧化氫酶的脂質(zhì)體與過氧化氫溶液反應(yīng)1分鐘，加入鉬酸銨溶液與未分解的過氧化氫反應(yīng)形成淡黃色產(chǎn)物，然后測量其在405nm的紫外吸收強(qiáng)度，通過對比相對強(qiáng)度來得到酶的相對活性。另一個(gè)酶穩(wěn)定性的檢測是：先將過氧化氫酶或包埋有過氧化氫酶的脂質(zhì)體與蛋白酶K(一種蛋白剪切酶)反應(yīng)一段時(shí)間，再使用上述方法檢測其活性，通過活性判斷其穩(wěn)定性。

酶活力檢測結(jié)果如圖5、6所示，結(jié)果顯示，實(shí)施例1制得脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑能夠在剪切酶的作用下很好保護(hù)過氧化氫酶的酶活力。

實(shí)施例5、脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑注射進(jìn)小鼠后在小鼠的體內(nèi)行為

將實(shí)施例1制得的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，腫瘤使用細(xì)胞種類為4T1(小鼠乳腺癌細(xì)胞)，老鼠種類為雌性Balb/c，腫瘤生長期為一周左右。在小動物成像系統(tǒng)(CRI)上在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)采集圖片，觀察脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在腫瘤部位的富集量，結(jié)果見圖7、8。選用的激發(fā)光源是635nm，曝光時(shí)間是50ms。

圖7、8結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，腫瘤區(qū)域脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的熒光信號逐漸增強(qiáng)，其在腫瘤部位的富集隨時(shí)間增加。

將脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，24小時(shí)后將小鼠主要器官取出后，測量其熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度的數(shù)值定量分析出脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶在不同器官中分布情況，結(jié)果見圖9、10。

圖9、10結(jié)果顯示，脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑在腫瘤部位富集可以達(dá)到較高的水平。

實(shí)施例6、免疫熒光染色檢測腫瘤乏氧狀況的變化

將實(shí)施例1制得的脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑經(jīng)尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，24小時(shí)后將四組小鼠腹腔注射0.6mg/只乏氧熒光探針Hypoxyprobe^TM(pimonidazole hydrochloride)，90分鐘后將小鼠腫瘤切下后冷凍切片染色，結(jié)果見圖11、12。

圖11共聚焦顯微鏡的成像結(jié)果表明，相比較于對照組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑的小鼠腫瘤區(qū)域的乏氧狀況有明顯改善。

實(shí)施例7、腫瘤的放化療聯(lián)合治療

將帶有乳腺癌皮下腫瘤模型的小鼠分為7組，治療時(shí)的腫瘤大小為250mm*3左右，注射劑量為：順鉑前藥5mg/kg，過氧化氫酶2mg/kg；其中包括：第一組，對照組(僅注生理鹽水)；第二組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥制劑組；第三組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑；第四組，只照射線組；第五組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥制劑24h后進(jìn)行射線照射治療組；第六組，注射脂質(zhì)體-過氧化氫酶制劑24h后進(jìn)行射線照射治療組；第七組，注射脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑24h后進(jìn)行射線照射治療組。對小鼠進(jìn)行相應(yīng)的治療后，測量其腫瘤的生長，結(jié)果見于圖13。

結(jié)果表明，相比較對照組，第四組、第五組、第六組和第七組的腫瘤生長僅得到了部分抑制，而第七組的腫瘤生長則得到了有效的抑制。表明脂質(zhì)體-順鉑前藥-過氧化氫酶制劑能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤的高效殺滅。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于使本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，是能夠?qū)崿F(xiàn)對這些實(shí)施例的多種修改的，而這些修改也應(yīng)視為本發(fā)明應(yīng)該保護(hù)的范圍。