本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種基于干細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建的人源化慢性乙型肝炎模型。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hbv)流行范圍廣，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)有1億左右的乙肝病毒感染者。由于慢性乙型肝炎無(wú)法徹底治愈，給社會(huì)、家庭和患者帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。同時(shí)，因?yàn)橐倚透窝撞《局荒茉诟呒?jí)靈長(zhǎng)類動(dòng)物中致病，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统Ｐ枋褂迷澈镱悇?dòng)物，猿猴類實(shí)驗(yàn)成本高，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。而目前較為常用的鴨乙型肝炎模型是基于禽類載體，與人類的種屬差異大，具有較大的局限性。由于慢性乙型肝炎難以治愈，根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，約有30％的乙肝患者會(huì)進(jìn)入肝硬化和肝癌，對(duì)患者生命健康造成重大威脅。而目前常用的肝硬化動(dòng)物模型，均為手術(shù)(如膽總管結(jié)扎)和化學(xué)藥物(四氯化碳、二甲基亞硝胺等)，這一類肝硬化模型為非乙肝病毒所致，故在疾病的機(jī)制與轉(zhuǎn)歸上與乙肝所致的肝硬化有很大的差異，不適合用于研究乙肝肝纖維化、肝硬化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制與治療。在我國(guó)肝癌患者中，由乙肝引起的原發(fā)性肝癌占肝癌的絕大多數(shù)，原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，病死率高，早期診斷困難。其它利用小動(dòng)物構(gòu)建的肝癌模型多基于化學(xué)藥物，這類模型與基于hbv感染引起的肝癌模型有很大區(qū)別，尤其是在發(fā)病機(jī)制上，存在明顯的差異。

因此，建立能感染乙型肝炎病毒并致病的小型哺乳動(dòng)物模型有很大的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。但由于乙肝病毒無(wú)法感染小型哺乳動(dòng)物，因此小型哺乳動(dòng)物研究模型建立困難，嚴(yán)重阻礙了肝臟疾病發(fā)生進(jìn)展機(jī)制、治療和轉(zhuǎn)歸的研究，并很大程度上限制了治療方案的優(yōu)化。建立人源化慢性乙型肝炎鼠模型將為研究病毒性肝炎機(jī)制及其治療與疾病轉(zhuǎn)歸提供良好的研究載體。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有潛在分化能力，可以分化成成熟肝細(xì)胞，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)人骨髓間充質(zhì)肝細(xì)胞(hbmsc)能嵌合在肝損傷的鼠肝內(nèi)，嵌合率高達(dá)50-95％，為建立新型人源化鼠模型奠定了基礎(chǔ)，此鼠模型對(duì)闡明慢性乙型肝炎病毒生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制、研發(fā)和篩選治療新藥物等提供保障，為研究肝炎及其治療與疾病轉(zhuǎn)歸提供良好的研究載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明正是針對(duì)現(xiàn)有原發(fā)性肝癌模型的缺陷，提供了一種人源化乙型肝炎鼠模型，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明公開了一種利用干細(xì)胞構(gòu)建的人源化慢性乙型肝炎鼠模型，所述的鼠模型由以下步驟獲得：

1)、獲取人干細(xì)胞；

2)、將人干細(xì)胞植入肝損傷的鼠，致使鼠體內(nèi)存在移植的人干細(xì)胞1*10^{4^8}；

3)、人肝細(xì)胞嵌合：鼠肝臟內(nèi)，移植的人干細(xì)胞分化形成人肝細(xì)胞；人源化的免疫系統(tǒng)：鼠體內(nèi)，移植的人干細(xì)胞分化形成人免疫系統(tǒng)；

4)、hbv感染人源化鼠；

5)、hbv感染的確認(rèn)、肝臟疾病的確認(rèn)。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的人干細(xì)胞的來(lái)源是健康人分離培養(yǎng)的干細(xì)胞或商品化的細(xì)胞系。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的肝損傷的鼠包括化學(xué)藥物所致的肝臟化學(xué)損傷和外科手術(shù)所致的肝臟物理?yè)p傷，鼠是正常小鼠或免疫缺陷小鼠或正常大鼠或免疫缺陷大鼠。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟3)中，移植的人干細(xì)胞分化形成人肝細(xì)胞，干細(xì)胞可表達(dá)人肝細(xì)胞標(biāo)志物是hsa，hla，alb或ntcp等。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟3)中，由移植的干細(xì)胞分化而來(lái)的人免疫系統(tǒng)，可檢測(cè)到表達(dá)人淋巴細(xì)胞標(biāo)志物的cd45⁺/cd4⁺/cd8⁺t細(xì)胞。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明所述的步驟5)中，hbv感染的確認(rèn)是通過(guò)檢測(cè)鼠體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定存在hbv完整顆粒實(shí)現(xiàn)，肝臟疾病可以是肝炎、及在該肝炎模型上進(jìn)展形成肝臟纖維化、肝硬化或肝癌。

作為進(jìn)一步地改進(jìn)，本發(fā)明當(dāng)明確該模型鼠肝臟存在點(diǎn)狀壞死等癥狀的為肝炎；當(dāng)明確該模型鼠肝臟存在炎癥和纖維化，為肝臟纖維化；當(dāng)出現(xiàn)肝硬化的特征性改變假小葉，為肝硬化；當(dāng)鼠模型體內(nèi)存在組織學(xué)和影像學(xué)可觀察到的原發(fā)性肝癌病灶，為肝癌。

本發(fā)明還公開了一種利用干細(xì)胞構(gòu)建的人源化慢性乙型肝炎模型在進(jìn)行新型抗病毒藥物或新型抗纖維化藥物或新型抗癌藥物的開發(fā)研究的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了一種利用干細(xì)胞構(gòu)建的人源化慢性乙型肝炎鼠模型在進(jìn)行抗病毒藥物耐藥性研究的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了一種利用干細(xì)胞構(gòu)建的人源化慢性乙型肝炎鼠模型在進(jìn)行慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制研究的應(yīng)用。

與現(xiàn)有模型相比，本發(fā)明的有益效果如下：

為闡明乙型肝炎病毒生物學(xué)特性、慢性乙型肝炎發(fā)病的具體機(jī)制，本發(fā)明從生化指標(biāo)、免疫組織化學(xué)，基因表達(dá)水平，蛋白組學(xué)等多個(gè)方面進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)通過(guò)誘導(dǎo)肝損害并移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并注射乙型肝炎病毒，形成人源化慢性乙型肝炎鼠模型。該模型的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)為該模型鼠具有由干細(xì)胞分化而來(lái)的人類免疫系統(tǒng)和嵌合在鼠肝內(nèi)的人的肝細(xì)胞。在鼠模型體內(nèi)存在有表達(dá)早期標(biāo)志的人淋巴細(xì)胞，表達(dá)肝細(xì)胞表面標(biāo)志物的人肝細(xì)胞。在注射乙型肝炎病毒后，在小鼠肝內(nèi)嵌合的人肝細(xì)胞基因組中，可發(fā)現(xiàn)乙肝病毒dna的整合。在小鼠的血清中，可發(fā)現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的乙肝病毒。分離該病毒可繼續(xù)感染健康小鼠。說(shuō)明這種病毒顆粒是完整具有感染性的。在完成乙肝病毒的感染后，在生化水平上，可觀察到持續(xù)的轉(zhuǎn)氨酶升高，說(shuō)明存在持續(xù)的慢性肝臟炎癥。該模型能研究慢性乙型肝炎的整個(gè)自然病史，及乙型肝炎病毒慢性感染過(guò)程中的人源化免疫應(yīng)答反應(yīng)。與現(xiàn)有的動(dòng)物模型相比，該人源化慢性乙型肝炎病毒模型有明顯的優(yōu)勢(shì)。相比靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，鼠模型縮短了實(shí)驗(yàn)周期，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，同時(shí)，極大的降低了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。而相比鴨慢性乙型肝炎模型，小鼠為哺乳動(dòng)物，與人類更為接近，該鼠模型可直接研究人類乙型肝炎病毒。與其他乙肝病毒感染的轉(zhuǎn)基因鼠類模型相比，該模型小鼠在體內(nèi)構(gòu)建了基于干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來(lái)的人肝細(xì)胞和人類的免疫系統(tǒng)，人類的免疫系統(tǒng)會(huì)識(shí)別并攻擊感染了乙肝病毒的人類肝細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生肝臟的炎癥損傷。該模型最大程度上模擬了人體內(nèi)乙肝病毒和人體免疫系統(tǒng)之間的相互作用。

人源化慢性乙型肝炎鼠模型除了用于研究乙肝病毒感染機(jī)制外，還可用于治療的研究。針對(duì)目前乙肝藥物的開發(fā)，大多基于肝細(xì)胞水平，缺乏有效的動(dòng)物模型進(jìn)行藥物的全面評(píng)估。該模型簡(jiǎn)單易得，很好的模擬了人體感染乙肝病毒的應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)于慢性乙型肝炎藥物的研發(fā)具有重大意義。

該慢性乙型肝炎鼠模型在常見的飼養(yǎng)觀察中，可發(fā)生乙肝肝纖維化、乙肝肝硬化以及乙肝原發(fā)性肝癌。

附圖說(shuō)明

圖1為運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎小鼠模型進(jìn)行新型抗病毒藥物開發(fā)研究示意圖；

圖2為運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎大鼠模型進(jìn)行抗病毒藥物耐藥性的研究示意圖；

圖3運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎大鼠模型慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制研究示意圖；

圖4運(yùn)用人源化肝纖維化、肝硬化大鼠模型進(jìn)行新型抗纖維化藥物開發(fā)研究示意圖；

圖5運(yùn)用人源化乙型肝炎原發(fā)性肝癌小鼠模型進(jìn)行乙型肝炎原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制研究示意圖；

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種基于干細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建的人源化慢性乙型肝炎鼠模型，下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地說(shuō)明：

一種利用干細(xì)胞構(gòu)建的人源化慢性乙型肝炎鼠模型，鼠模型通過(guò)以下步驟獲得：

1)、獲取人干細(xì)胞，人工細(xì)胞的來(lái)源是健康人分離培養(yǎng)的干細(xì)胞或商品化的細(xì)胞系。

2)、將人干細(xì)胞植入肝損傷的鼠，致使鼠體內(nèi)存在移植的人干細(xì)胞1*10^{4^8}；肝損傷的鼠包括化學(xué)藥物所致的肝臟化學(xué)損傷和外科手術(shù)所致的肝臟物理?yè)p傷，鼠是正常小鼠或免疫缺陷小鼠或正常大鼠或免疫缺陷大鼠。

3)人肝細(xì)胞嵌合：鼠肝臟內(nèi)，移植的人干細(xì)胞分化形成人肝細(xì)胞，移植的人干細(xì)胞分化形成人肝細(xì)胞，干細(xì)胞可表達(dá)人肝細(xì)胞標(biāo)志物是hsa，hla，alb或ntcp等；

4)人源化的免疫系統(tǒng)：鼠體(肝臟、血液、脾臟、骨髓等)內(nèi)，移植的人干細(xì)胞分化形成人免疫系統(tǒng)。由移植的干細(xì)胞分化而來(lái)的人免疫系統(tǒng)，可檢測(cè)到表達(dá)人淋巴細(xì)胞標(biāo)志物的cd45⁺/cd4⁺/cd8⁺等t細(xì)胞。

5)、hbv感染人源性鼠。

6)、hbv感染的確認(rèn)、通過(guò)檢測(cè)鼠體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定存在hbv完整顆粒。

7)、肝臟疾病的確認(rèn)：當(dāng)明確該模型鼠肝臟存在點(diǎn)狀壞死等癥狀的為肝炎；當(dāng)明確該模型鼠肝臟存在炎癥和纖維化，為肝臟纖維化；當(dāng)出現(xiàn)肝硬化的特征性改變假小葉，為肝硬化；當(dāng)鼠模型體內(nèi)存在組織學(xué)和影像學(xué)可觀察到的原發(fā)性肝癌病灶，為肝癌。

本發(fā)明的利用干細(xì)胞構(gòu)建的人源化慢性乙型肝炎鼠模型可以用于進(jìn)行新型抗病毒藥物開發(fā)研究，抗病毒藥物耐藥性研究和慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制研究。

下面根據(jù)說(shuō)明書附圖，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地說(shuō)明：

鼠模型的具體制備步驟為：

一、獲取人干細(xì)胞

1、分離培養(yǎng)人干細(xì)胞

1)獲得純化人干細(xì)胞。

2)干細(xì)胞培養(yǎng)，傳代。

3)培養(yǎng)于20℃-40℃，2％-10％co2的培養(yǎng)箱中。

2、獲取商品化的分離或凍存的人干細(xì)胞或細(xì)胞系。

二、干細(xì)胞移植入肝損傷的鼠

1、獲得不同品系的實(shí)驗(yàn)鼠，實(shí)驗(yàn)鼠包括正常小鼠、免疫缺陷小鼠、正常大鼠和免疫缺陷大鼠。

2、通過(guò)腹腔、肌肉、外周靜脈注射、口服或灌胃的方式予以肝損藥物，或予以外科部分肝切除術(shù)，建立肝損傷鼠模型。

3、通過(guò)外周靜脈、門靜脈、脾臟或肝臟注射的方式移植1×10^4-8干細(xì)胞。

三、hbv感染人源性鼠

通過(guò)外周靜脈、皮下、肌肉或腹腔每只鼠注射乙型肝炎病毒。

實(shí)施例1運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎小鼠模型進(jìn)行新型抗病毒藥物開發(fā)研究。

1、將150只人源化慢性乙型肝炎小鼠隨機(jī)分為3組，每組50只，3組治療前的乙肝病毒為1*10^7左右，無(wú)顯著性差異。

2、實(shí)驗(yàn)組予以治療劑量的新型抗病毒藥物，對(duì)照組1予以一線核苷類似物抗病毒藥物替諾福韋(100mg/kg)口服，對(duì)照組2予以干擾素注射抗病毒治療。

3、在治療1周，2周，4周，8周，12周，24周分別檢測(cè)各組小鼠乙肝病毒載量，并檢測(cè)其他主要臟器的不良反應(yīng)(如腎功能、心肌酶譜等)

4、將治療組的小鼠病毒載量變化與替諾福韋對(duì)照組和干擾素對(duì)照組的病毒曲線進(jìn)行比較，從而得出新型抗病毒藥物的抗病毒作用與目前一線抗病毒藥物替諾福韋、干擾素的差異。

5、通過(guò)副反應(yīng)的觀察，得出新型抗病毒藥物的不良反應(yīng)，為進(jìn)行一期臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

圖1運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎小鼠模型進(jìn)行新型抗病毒藥物開發(fā)的示意圖。說(shuō)明了運(yùn)用該人源化慢性乙型肝炎小鼠模型，可有效的進(jìn)行新藥的篩選實(shí)驗(yàn)，途中新藥組的病毒滴度下降曲線與一線藥物替諾福韋接近，優(yōu)于干擾素組。

實(shí)施例2：運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎大鼠模型進(jìn)行抗病毒藥物療效和耐藥性的研究。

1、200只人源化慢性乙型肝炎大鼠隨機(jī)分為四組，各組間年齡、性別、體重和基線乙肝病毒載量無(wú)顯著差異。

2、四組分別予以治療劑量的常用的抗病毒藥物拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋及替諾福韋。

3、在治療1周，2周，4周，8周，12周，24周分別檢測(cè)大鼠乙肝病毒載量。

4、將各組各時(shí)間點(diǎn)的病毒載量繪制曲線，比較各組間差異，評(píng)估目前常用的抗病毒藥物療效和耐藥性。

圖2運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎大鼠模型進(jìn)行抗病毒藥物耐藥性研究中各組的病毒曲線圖。說(shuō)明了運(yùn)用該人源化慢性乙型肝炎大鼠模型，可有效的進(jìn)行抗病毒藥物的耐藥性研究。圖中替諾福韋、恩替卡韋組24周的病毒滴度下降曲線優(yōu)于替比夫定、拉米夫定組。

實(shí)施例3：運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎大鼠模型慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制研究。

1、50只人源化慢性乙型肝炎大鼠，從注射病毒開始作為起始點(diǎn)。

2、在起始點(diǎn)后1天，3天，5天，7天，14天，30天，60天，90天，180天，360天各處死5只大鼠，收取血清、肝組織等樣本。

3、通過(guò)蛋白組、基因組等多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，尋找在乙肝病毒感染和慢性乙型肝炎發(fā)生發(fā)展中的基因組、蛋白組變化譜。

4、找出其中有顯著差異的基因和蛋白，并進(jìn)行相關(guān)通路的分析，揭示慢乙肝發(fā)病機(jī)制。

圖3運(yùn)用人源化慢性乙型肝炎大鼠模型慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制研究的示意圖。該模型可從蛋白質(zhì)組學(xué)，基因組學(xué)水平研究，通過(guò)多組學(xué)聯(lián)合的方式進(jìn)行慢性乙型肝炎的機(jī)制研究。

實(shí)施例4：運(yùn)用人源化肝纖維化、肝硬化大鼠模型進(jìn)行新型抗纖維化藥物開發(fā)研究

1、將75只人源化肝纖維化、肝硬化大鼠隨機(jī)分為3組，每組25只，3組治療前的肝纖維化程度無(wú)顯著性差異。

2、實(shí)驗(yàn)組予以治療劑量的新型抗纖維化藥物，對(duì)照組予以安絡(luò)化纖丸口服和一線抗病毒藥替諾福韋口服。

3、在治療1周，2周，4周，8周，12周，24周分別檢測(cè)大鼠肝纖維化程度，并檢測(cè)其他主要臟器的不良反應(yīng)(如腎功能、心肌酶譜等)

4、將治療組的大鼠肝纖維化程度與安絡(luò)化纖丸、替諾福韋對(duì)照組的肝纖維化程度進(jìn)行比較，從而得出新型抗纖維化藥物的抗纖維化作用與目前一線抗纖維化藥物安絡(luò)化纖丸的差異。

5、通過(guò)副反應(yīng)的觀察，得出新型抗纖維化藥物的不良反應(yīng)，為進(jìn)行一期臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

圖4說(shuō)明了運(yùn)用該人源化乙型肝炎肝硬化大鼠模型，可有效的進(jìn)行新藥的篩選實(shí)驗(yàn)。圖中新藥組的肝硬化程度下降曲線與抗纖維化藥物安絡(luò)化纖丸組接近，略好于安絡(luò)化纖丸組，明顯優(yōu)于一線藥物替諾福韋組。

實(shí)施例5：運(yùn)用人源化乙肝原發(fā)性肝癌小鼠模型進(jìn)行肝癌的機(jī)制研究。

1、100只人源化乙肝原發(fā)性肝癌小鼠，予以常規(guī)飼養(yǎng)，無(wú)治療干預(yù)。

2、在7天，14天，30天，60天，90天各處死10只小鼠，收取血清、肝組織等樣本。

3、通過(guò)蛋白組、基因組等多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，尋找在肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的基因組、蛋白組變化譜。

4、找出其中有顯著差異的基因和蛋白，并進(jìn)行相關(guān)通路的分析，揭示肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制。

圖5所示該小鼠肝癌模型可從蛋白質(zhì)組學(xué)，基因組學(xué)水平研究，通過(guò)多組學(xué)聯(lián)合的方式進(jìn)行乙型肝炎原發(fā)性肝癌的機(jī)制研究。

以上例舉的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明并不限于以上實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和構(gòu)思的前提下直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的其他改進(jìn)和變化，均應(yīng)認(rèn)為包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。