本發(fā)明涉及胎盤細胞外基質(zhì)的制備方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：組織與器官的功能喪失是人類健康的主要障礙。理論上，組織與器官的再生可以克服這些障礙。有機體內(nèi)固有的細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ecm)可以引導(dǎo)器官發(fā)育、修復(fù)和生理再生。目前，細胞外基質(zhì)去細胞的方法主要有三種：(一)血管灌流法；(二)酶學(xué)法；(三)化學(xué)脫細胞劑清洗法。這些去細胞的方法常常有下述的缺點：(一)脫細胞時間長；(二)組織去細胞化不完整；(三)異體組織抗原殘留；(四)細胞外基質(zhì)生物成分和物理性能受到損害。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種胎盤細胞外基質(zhì)的制備方法，該制備方法不僅簡單易操作，而且脫細胞時間短，同時獲得的外基質(zhì)去細胞化完整、無異體組織抗原殘留、生物成分和物理性能不會受到損害。為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種胎盤細胞外基質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：step1：將新鮮胎盤速凍并保存在-80℃環(huán)境中，凍存48h以上；step2：將凍存的胎盤取出，室溫融化；step3：將融化的胎盤組織分離，并在研磨機上研磨成組織碎塊，大小為0.1mm～2mm；step4：對研磨得到的組織碎塊進行去細胞、病毒滅活和漂洗處理；step5：將處理后的組織碎塊預(yù)先放置在-20℃～-80℃環(huán)境中過夜，或者迅速浸在干冰中，然后將組織碎塊放置于凍干機內(nèi)凍干24h～48h，即得胎盤細胞外基質(zhì)。前述的制備方法，其特征在于，在step4中，前述去細胞、病毒滅活和漂洗處理在室溫下進行，具體的過程如下：(1)將組織碎塊浸于濃度為0.2％～2％的sds溶液中，持續(xù)攪拌混勻30min～60min；(2)將經(jīng)上述處理后的組織碎塊浸于濃度為0.3％～3％的tritonx-100溶液中，持續(xù)攪拌混勻1h～24h；(3)將經(jīng)上述處理后的組織碎塊浸于濃度為1％～5％的nacl溶液中，持續(xù)攪拌混勻30min～60min；(4)將經(jīng)上述處理后的組織碎塊浸于濃度為0.2％～2％的過氧乙酸溶液中，持續(xù)攪拌混勻15min～30min；(5)將經(jīng)上述處理后的組織碎塊浸于去離子水中，持續(xù)攪拌混勻30min～60min；(6)重復(fù)步驟(1)至步驟(5)，重復(fù)兩次。前述的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，前述sds溶液的濃度為1％。前述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，前述tritonx-100溶液的濃度為2％。前述的制備方法，其特征在于，組織碎塊浸于濃度為2％的tritonx-100溶液中后，持續(xù)攪拌混勻4h。前述的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中，前述nacl溶液的濃度為3％。前述的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中，前述過氧乙酸溶液的濃度為1％。本發(fā)明的有益之處在于：(1)本發(fā)明的制備方法結(jié)合了三種組織器官脫細胞方法，簡單易操作，脫細胞時間大大縮短，生物成分和物理性能不會受到明顯損害，最大程度保留了各種細胞反應(yīng)因子和傷口愈合因子，富含膠原蛋白、彈力纖維蛋白和gags，有益于生產(chǎn)擴大化；(2)本發(fā)明的制備方法因為將組織預(yù)先加工成碎塊，所以去細胞化完整，無異體組織抗原殘留。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作具體的介紹。第一部分：制備胎盤細胞外基質(zhì)step1：凍存將新鮮胎盤速凍并保存在-80℃環(huán)境中，凍存48h以上，保證徹底冰凍。新鮮胎盤取自于人體。step2：融化將凍存的胎盤取出，室溫融化。step3：研磨將融化的胎盤組織分離，并在研磨機上研磨成組織碎塊，組織碎塊的大小為0.1mm～2mm。step4：去細胞、病毒滅活和漂洗對研磨得到的組織碎塊進行去細胞、病毒滅活和漂洗處理，在室溫下進行，具體的過程如下：(1)將組織碎塊浸于濃度為1％的sds溶液中(sds溶液的濃度在0.2％～2％范圍內(nèi)均可)，持續(xù)攪拌混勻30min(可適當延長至60min)，在這個過程中sds可高效溶解細胞并且不會對細胞外基質(zhì)造成明顯的損害；(2)將經(jīng)上述處理后的組織碎塊浸于濃度為2％的tritonx-100溶液中(tritonx-100溶液的濃度在0.3％～3％范圍內(nèi)均可)，持續(xù)攪拌混勻4h(時間可控制在1h～24h)，在這個過程中tritonx-100作為非離子型除垢劑，因其不含電荷，故對蛋白結(jié)構(gòu)影響最??；(3)將經(jīng)上述處理后的組織碎塊浸于濃度為3％的nacl溶液中(nacl溶液的濃度在1％～5％范圍內(nèi)均可)，持續(xù)攪拌混勻30min(可適當延長至60min)，在這個過程中高滲溶液nacl可裂解細胞膜和殺菌；(4)將經(jīng)上述處理后的組織碎塊浸于濃度為1％的過氧乙酸溶液中(過氧乙酸溶液的濃度在0.2％～2％范圍內(nèi)均可)，持續(xù)攪拌混勻15min(可適當延長至30min)，在這個過程中過氧乙酸完成了對病毒的滅活處理；(5)將經(jīng)上述處理后的組織碎塊浸于去離子水中，持續(xù)攪拌混勻30min(可適當延長至60min)，在這個過程中去離子水可清除剩余的化學(xué)物質(zhì)；(6)重復(fù)步驟(1)至步驟(5)，重復(fù)兩次。step5：凍干將處理后的組織碎塊預(yù)先放置在-20℃～-80℃環(huán)境中過夜(或者迅速浸在干冰中)，然后將組織碎塊放置于凍干機內(nèi)凍干24h～48h，即得胎盤細胞外基質(zhì)，凍干的細胞外基質(zhì)可進一步加工成各種形狀的制品以滿足市場和臨床的需要。第二部分：對制備得到的胎盤細胞外基質(zhì)進行質(zhì)量評價1、去細胞化完整程度為檢驗組織去細胞化的完整程度，我們將去細胞化的組織制作成切片標本并進行h.e.色，顯微鏡下沒有觀察到明顯殘留的細胞核。結(jié)論：采用本發(fā)明的方法制備得到的胎盤細胞外基質(zhì)去細胞化完整，無異體組織抗原殘留。2、去細胞后細胞外基質(zhì)所保留的生物成分經(jīng)檢測，用本發(fā)明的方法去細胞后的組織保留了各種細胞反應(yīng)因子和傷口愈合因子：tgfb1100毫微克bfgf1400毫微克egf200毫微克pdgf200毫微克igf1800～900毫微克vegf800毫微克膠原蛋白300～400微克彈力纖維蛋白300～350微克gags20微克結(jié)論：因為化學(xué)處理組織的時間大大縮短，所以采用本發(fā)明的方法制備得到的胎盤細胞外基質(zhì)生物成分和物理性能沒有明顯受到損害，最大程度保留了各種細胞反應(yīng)因子和傷口愈合因子，富含膠原蛋白、彈力纖維蛋白和gags，有益于生產(chǎn)擴大化。4、水溶性經(jīng)檢測，采用本發(fā)明的方法制備得到的胎盤細胞外基質(zhì)不溶于水。5、儲存時間經(jīng)檢測，采用本發(fā)明的方法制備得到的胎盤細胞外基質(zhì)可儲存在4℃環(huán)境下，儲存時間長達兩年。綜上所述，采用本發(fā)明的方法制備得到的胎盤細胞外基質(zhì)不僅去細胞化完整、無異體組織抗原殘留，而且生物成分和物理性能沒有明顯受到損害，最大程度保留了各種細胞反應(yīng)因子和傷口愈合因子，富含膠原蛋白、彈力纖維蛋白和gags，可以進一步加工成各種用于臨床再生醫(yī)學(xué)、組織修復(fù)、生物打印、制藥、衛(wèi)生保健、美容、食品等領(lǐng)域。第三部分：上述胎盤細胞外基質(zhì)的應(yīng)用采用本發(fā)明的方法制備得到的胎盤細胞外基質(zhì)不溶于水，并且去細胞化完整、無異體組織抗原殘留、生物成分和物理性能沒有明顯受到損害，所以其可制成膜片、流性軟基質(zhì)、微顆粒、粉劑、膏劑、海綿狀制品等劑型，以滿足臨床上不同的需要，其主要應(yīng)用在組織工程、人工器官、損傷與修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)中，用來吸引炎癥細胞、促進血管生成、促進組織再生、促進分泌細胞因子、改善傷口愈合過程。此外，采用本發(fā)明的方法制備得到的細胞外基質(zhì)，其還可以與各種生長因子、細胞因子、蛋白質(zhì)、抗體、多肽、氨基酸、核苷酸等結(jié)合或混合，制成應(yīng)用在臨床再生醫(yī)學(xué)、組織修復(fù)、生物打印、制藥、衛(wèi)生保健、美容、食品等領(lǐng)域。需要說明的是，上述實施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。當前第1頁12