本發(fā)明涉及材料科學(xué)與納米材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種膠原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/納米銀涂層制備方法。

背景技術(shù)：

生物醫(yī)用材料是用來對生物體進行診斷、治療、修復(fù)或替換其病損組織、器官或增進其功能，且對生物體組織不會產(chǎn)生不良影響的材料。它是研究人工器官和醫(yī)療器械的基礎(chǔ)，已成為當(dāng)代材料學(xué)科的重要分支。醫(yī)用鈦金屬耐蝕性能優(yōu)異，彈性模量接近于自然骨，生物相容性優(yōu)良，目前常用于制造植入人體內(nèi)的醫(yī)療器件、假體或人工器官和輔助治療設(shè)備。

然而由于醫(yī)用植入體所引起的細(xì)菌感染給病人帶來巨大的傷害,一旦發(fā)生不僅會帶來更多的痛苦和經(jīng)濟損失,甚至還會使人截肢或死亡。醫(yī)用鈦基材料植入同樣存在細(xì)菌感染的問題。為了減少細(xì)菌感染同時又不影響植入體的功能，我們希望對植入體進行改性，使其能在短時間里消滅感染的細(xì)菌，同時還能進一步促進細(xì)胞的粘附，增殖及分化。

納米銀具有較好的光催化性能，可以在可見光照射下產(chǎn)生活性氧，同時其本身也具有優(yōu)異的抗菌性能，從而作為一種廣譜抗菌材料對需氧、厭氧、革蘭氏陽性、革蘭氏陰性、真菌和病毒都具有抗菌效果，在醫(yī)療和其他產(chǎn)品中的應(yīng)用在逐漸增加。而納米銀由于其納米尺寸獲得了更大的比表面積，增加了與細(xì)菌接觸面積或者吸收光子的能力從而增加了抗菌活性。但是單獨的納米銀很容易團聚，從而降低抗菌活性，而過量的納米銀又對細(xì)胞具有一定的毒性。但是通過與氧化石墨烯的結(jié)合可以很好的解決其分散性問題，同時氧化石墨烯可以促進納米銀的光催化性能增加材料的抗菌活性。

氧化石墨烯作為石墨烯的衍生材料具有高的機械強度、大的表面積和優(yōu)良的生物相容性已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，如支架基質(zhì)、藥物或基因傳遞載體等。特別的是具有很好的導(dǎo)電性，在于納米銀結(jié)合后，能夠快速將納米銀產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移到氧化石墨烯表面產(chǎn)生活性氧。同時還可以提高干細(xì)胞的增殖和分化，具有較小的細(xì)胞毒性低。而且氧化石墨烯具有許多含氧活性官能團，可以很容易地與其他材料結(jié)合，進一步促進其生物相容性或者連接其他抗菌藥物用于抗菌，另一方面也可作為一種紐帶將各種功能材料連接到鈦植入體上，從而改善其性能。

膠原蛋白主要存在高階動物特別是在皮膚，肌腱和骨中，具有優(yōu)良的生物相容性、可促進細(xì)胞粘附、影響細(xì)胞形狀和增強，以及骨生成。但是膠原蛋白的機械性能低且降解速度快。同樣的通過與氧化石墨稀的相互作用可以改善這些缺點，從而獲得更加優(yōu)異的功效。以氧化石墨烯為基礎(chǔ)三者協(xié)調(diào)作用可以制備出一種基于氧化石墨烯的雜化生物功能涂層。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種膠原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/納米銀涂層制備方法，所述方法將氧化石墨烯，納米銀和膠原蛋白三者有機地結(jié)合起來，通過氧化石墨烯使納米銀以幾納米的尺寸均勻負(fù)載在氧化石墨烯片上，并且改善膠原蛋白易降解的缺陷。所述方法制備出既具有抗菌活性，又具有良好生物相容性的雜化涂層材料，通過可見光照著雜化涂層產(chǎn)生活性氧，從而殺滅細(xì)菌。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種膠原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/納米銀涂層制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

步驟一，在氧化石墨烯表面負(fù)載納米銀

制備氧化石墨烯/硝酸銀溶液，所述氧化石墨烯/硝酸銀溶液中氧化石墨烯的濃度為0.8-1.2mg/ml，所述硝酸銀的濃度為0.006-0.010mol/l，將制備好的氧化石墨烯/硝酸銀溶液真空室溫放置1-3天，然后在持續(xù)攪拌下用275nm的紫外光照射0.8-1.2小時原位還原得到表面負(fù)載有納米銀的氧化石墨烯；

步驟二，堿熱處理鈦片

將鈦片用砂紙逐級表面打磨后，依次在丙酮、蒸餾水、酒精中超聲清洗，再將所述鈦片放入化學(xué)刻蝕液中進行刻蝕，隨后將鈦片放入盛有濃度為3.5-4.5mol/l的koh溶液的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放入烘箱中，在75-85℃下反應(yīng)80-100分鐘，取出鈦片洗滌干燥；

步驟三，鈦片的氨基化

將步驟二制得的鈦片浸入硅烷偶聯(lián)劑甲苯溶液中，70-90℃下回流10-14小時，鈦片取出后用乙醇洗滌干燥；

或?qū)⒉襟E二制得的鈦片在黑暗條件下浸入含有鹽酸多巴胺的緩沖溶液中放置22-26小時，取出鈦片洗滌干燥；

步驟四，在鈦片表面負(fù)載氧化石墨烯/納米銀復(fù)合材料

將步驟三制得的鈦片浸入步驟一制得的負(fù)載了納米銀的氧化石墨烯溶液中，真空室溫放置20-24小時，取出鈦片洗滌干燥；

步驟五，在鈦片表面覆蓋一層膠原蛋白薄膜

將膠原蛋白溶于體積濃度為1.5-2.5％的乙酸溶液中制成濃度為1-2mg/ml的膠原蛋白溶液，隨后將步驟四制得的鈦片浸入所述膠原蛋白溶液22-26小時，所述鈦片上即制得膠原蛋白包裹的氧化石墨烯/納米銀涂層。

步驟二中所述的化學(xué)刻蝕液為h2o2和濃h2so4的混合溶液，所述混合溶液中h2o2和濃h2so4的體積比為1:3,；所述h2o2的體積濃度為30％，所述濃h2so4的質(zhì)量濃度為98％。

或步驟二中所述的化學(xué)刻蝕液為hf、hno3和純水的配比溶液，所述配比溶液中hf、hno3和純水的體積比為1:4:5；所述hf的質(zhì)量濃度為40％，所述hno3的濃度為1mol/l。

所述刻蝕的時間為20-40分鐘。

或所述刻蝕的時間為1-3分鐘。

步驟三所述的硅烷偶聯(lián)劑為kh550、kh560或kh570中的一種。

步驟三所述的硅烷偶聯(lián)劑甲苯溶液中硅烷偶聯(lián)劑的體積濃度為2-4％。

步驟三中所述緩沖溶液為tris-hcl緩沖液，所述tris-hcl緩沖液的ph值為8-9。

步驟三中所述含有鹽酸多巴胺的緩沖溶液中，鹽酸多巴胺的濃度為1-3mg/ml。

本發(fā)明所述的一種膠原蛋白膜包裹的氧化石墨烯/納米銀涂層制備方法，相比較現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點：

(1)通過靜電吸附使氧化石墨烯和銀離子結(jié)合，再原位還原納米銀粒子，可以使納米銀以極小的尺寸均勻的分散在氧化石墨烯表面，此法投入設(shè)備投入少，實施難度小，制備方法簡單易行，并且對環(huán)境并無太大影響；

(2)以氧化石墨烯為基礎(chǔ)可以使氧化石墨烯、膠原蛋白和納米銀三者有機地結(jié)合起來，并且通過三者的協(xié)調(diào)作用可改善其各自的缺點，使其具有更加優(yōu)異的生物功能；

(3)本發(fā)明技術(shù)制備的雜化涂層具有很好的光動力抗菌活性，既在可見光照射下能快速高效的產(chǎn)生活性氧，從而殺滅細(xì)菌。

附圖說明

圖1為實施例1中各步驟樣品的sem圖；

圖中，a：鈦片經(jīng)過件熱處理后的圖片；b：樣品用硅烷偶聯(lián)劑氨基化的圖；c：樣品接枝氧化石墨烯/納米銀后的樣品圖；d：樣品包裹膠原蛋白后的圖。

圖2為實施例1中樣品的接觸角圖；

圖3為實施例1中殺死的細(xì)菌sem圖；

圖4為實施例2中鈦片表面的細(xì)胞熒光圖；

圖5為實施例3中接枝氧化石墨稀后拉曼圖。

具體實施方式

為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步地詳細(xì)說明，但是本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。

本發(fā)明實施例中所用的硅烷偶聯(lián)劑為kh550，kh550在甲苯溶液中的體積濃度為3％；所用h2o2的體積濃度為30％；所用h2so4的質(zhì)量濃度為98％；hf的質(zhì)量濃度為40％；所用hno3的濃度為1mol/l。

實施例1：

(1)將氧化石墨烯超聲分散成1mg/ml的溶液，取50ml加入0.0679g硝酸銀，攪拌30分鐘，黑暗條件下真空放置2天。最后將溶液在持續(xù)攪拌條件下，用275nm紫外光照射溶液1小時，備用。

(2)將醫(yī)用鈦片分別用規(guī)格為240#、400#、600#、800#、1200#的砂紙在拋光研磨機上打磨至光滑鏡面，而后用1:3的h2o2:h2so4(濃)的混合溶液化學(xué)刻蝕30分鐘。

(3)隨后放入盛有4mol/l的koh溶液的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放入烘箱中，在80℃下反應(yīng)90分鐘，最后取出洗滌干燥。

(4)將上述處理后的鈦片浸入3％的硅烷偶聯(lián)劑甲苯溶液中，80℃下回流12小時，取出用乙醇洗滌干燥。再浸入上述制備好的氧化石墨烯/納米銀溶液中真空放置24小時。取出洗滌干燥。

(5)將膠原蛋白溶于2％的乙酸溶液中制成濃度為1.5mg/ml的膠原蛋白溶液，隨后將接枝了氧化石墨烯/納米銀的鈦片浸入其中24小時，制的膠原蛋白包裹的氧化石墨烯/納米銀雜化涂層。

實施例1的實驗效果從圖1可以看出，圖a：鈦片經(jīng)過件熱處理后的圖片，增加鈦片的比表面積，同時在金屬表面引入大量羥基有利于氨基化，從而增加接枝氧化石墨烯的量；圖b：用硅烷偶聯(lián)劑氨基化的圖，氨基化可以在鈦片表面引入氨基，通過與氧化石墨烯表面的含氧官能團反應(yīng)接枝氧化石墨烯；圖c：接枝氧化石墨烯/納米銀后的樣品圖。納米銀具有優(yōu)異的物理抗菌能力，同時也具有光動力抗菌；氧化石墨烯有助于納米銀的均勻分布，避免團聚使抗菌性能下降細(xì)胞毒性增加。同時其優(yōu)異的電子轉(zhuǎn)移能力可以很大程度上增強光動力抗菌的能力；圖d：包裹膠原蛋白后的圖，膠原蛋白有利于增加生物活性。

實施例2：

(1)制備濃度分別為1.2mg/l和0.01mol/l的氧化石墨烯/硝酸銀溶液，將制備好的氧化石墨烯/硝酸銀溶液真空放置1天，此后在持續(xù)攪拌下用紫外光照射還原獲得均勻負(fù)載納米銀的氧化石墨烯復(fù)合材料；

(2)將直徑6mm、厚度2.5mm的鈦金屬圓片用砂紙逐級表面打磨后，依次在丙酮、蒸餾水、酒精中超聲清洗，而后用1:3的h2o2:h2so4(濃)的混合溶液化學(xué)刻蝕30分鐘

(3)將上述鈦片放入盛有濃度為4mol/l的koh溶液的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放入烘箱中，在85℃下反應(yīng)80分鐘，取出洗滌干燥；

(4)將上述處理后的鈦片在黑暗條件下浸入5％的硅烷偶聯(lián)劑甲苯溶液中，90℃下回流8小時，取出用乙醇洗滌干燥。再浸入上述制備好的氧化石墨烯/納米銀溶液中真空放置24小時。取出洗滌干燥。

(5)將膠原蛋白溶于2％的乙酸溶液中制成濃度為1mg/ml的膠原蛋白溶液，隨后將接枝了氧化石墨烯/納米銀的鈦片浸入其中24小時，制的膠原蛋白包裹的氧化石墨烯/納米銀雜化涂層。

實施例3：

(1)制備濃度分別為1mg/l和0.008mol/l的氧化石墨烯/硝酸銀溶液，將制備好的氧化石墨烯/硝酸銀溶液真空放置2天，此后在持續(xù)攪拌下用紫外光照射還原獲得均勻負(fù)載納米銀的氧化石墨烯復(fù)合材料。

(2)將鈦片分別用規(guī)格為240#、400#、600#、800#、1200#的砂紙在拋光研磨機上打磨至光滑鏡面，而后用1:4:5的hf:1mol/lhno3:h2o的混合溶液化學(xué)刻蝕2分鐘，隨后放入盛有濃度為4mol/l的koh溶液的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放入烘箱中，在80℃下反應(yīng)90分鐘，取出洗滌干燥；

(3)將上述處理后的鈦片在黑暗條件下浸入含有2mg/ml的鹽酸多巴胺的tris-hcl(ph＝8.5)緩沖溶液中，放置24小時，取出洗滌干燥。再浸入上述制備好的氧化石墨烯/納米銀復(fù)合材料中24小時。取出洗滌干燥。

(4)膠原蛋白溶于2％的乙酸溶液中制成濃度為1.5mg/ml的膠原蛋白溶液，隨后將接枝了氧化石墨烯/納米銀的鈦片浸入其中24小時，制的膠原蛋白包裹的氧化石墨烯/納米銀雜化涂層。

對制備后的產(chǎn)品作相應(yīng)的檢測，其檢測結(jié)果如下：1)吸附在氧化石墨細(xì)胞膜上的銀離子在原位還原后以幾納米的尺寸均勻的附在氧化石墨烯片上，堿熱處理后的鈦片表面形成納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在氨基化后網(wǎng)孔被部分覆蓋，在接上氧化石墨烯納米銀后被完全覆蓋；2)改性后的鈦片在可見光的照射下能夠在短時間里有效的殺死細(xì)菌，而在黑暗條件下短時間沒有抗菌能力，但是對細(xì)胞影響不大；3)提高硝酸銀的量，在可見光的照射下其抗菌性能幾乎不變，但生物活性下降，而縮短與氧化石墨烯混合時間后其抗菌能力和生物相容性基本不變；增加膠原蛋白后的樣品其抗菌效果有所下降，但生物活性得到提高；4)接枝硅烷偶聯(lián)劑比接枝多巴胺分散更均勻，有利于氧化石墨烯均勻接枝在鈦片表面，而硅烷偶聯(lián)劑的濃度過高，時間過長不利于接枝氧化石墨烯。

當(dāng)然，以上僅是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，對本發(fā)明的保護范圍不構(gòu)成任何限制。除上述實施例外，本發(fā)明還可以有其它實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求保護的范圍之內(nèi)。