本發(fā)明涉及甘露聚糖結合凝集素的新用途技術領域，具體涉及mbl在制備預防或治療th17細胞引發(fā)疾病藥物中的應用。
背景技術：
甘露聚糖結合凝集素（mannan-bindinglectin，mbl）是一種急性時相反應蛋白，主要由肝細胞分泌，為c型凝集素超家族中膠凝素（collectins）家族成員，屬于ca+依賴型的凝集素。人類mbl基因位于10q11-q21染色體上，mbl肽鏈由229個氨基酸殘基組成，成熟的mbl有四個結構域，自n端至c端依次為富含半胱氨酸的n端區(qū)、膠原樣區(qū)、頸區(qū)以及能夠進行糖類識別的c區(qū)。mbl是天然免疫系統(tǒng)中一個關鍵的可溶性模式識別受體（patternrecognitionreceptor，prr），可以選擇性識別多種病原體（如細菌、真菌、病毒、寄生蟲）表面的糖結構，通過激活補體凝集素途徑，發(fā)揮溶破和間接調理作用；或通過與吞噬細胞表面膠凝受體結合，發(fā)揮直接調理作用，從而保護機體免受病原體的侵害。研究表明，正常人血清中mbl濃度約為0.01-10mg/l，mbl作為一種急性期反應蛋白，在應急狀態(tài)下，其濃度可升高3倍以上。mbl被稱為“天然免疫系統(tǒng)中的關鍵分子”，其在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。
研究已證實mbl缺陷是人類最常見的免疫缺陷狀態(tài)，主要由mbl-2啟動子基因和結構基因第一外顯子的多態(tài)性所致。mbl缺陷使血清中mbl濃度水平明顯降低，機體處于免疫缺陷狀態(tài)，極易感染，情況嚴重者會危及生命。研究表明，mbl缺陷與多種感染性疾病密切相關，特別是在機體合并其它免疫功能低下時（如在hiv感染的患者中、腫瘤患者進行藥物化療后、兒童時期），其表現(xiàn)得更加明顯；mbl缺陷與多種自身免疫病密切相關，如mbl缺陷與系統(tǒng)性紅斑性狼瘡（sle）密切相關；mbl缺陷可能利于自身免疫復合物的沉積，激活補體經典途徑，導致關節(jié)損傷，從而引發(fā)類風濕關節(jié)炎（ra）；mbl與心血管疾病如動脈粥樣硬化也密切相關；mbl與糖尿病的發(fā)生發(fā)展也是密切相關的。
隨著對mbl的深入研究，發(fā)現(xiàn)其不僅作為天然免疫系統(tǒng)中的關鍵分子，在補體的第三種途徑（即甘露聚糖結合凝集素途徑）中發(fā)揮著重要作用，而且在適應性免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著極其重要的作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，用mbl預處理hiv-1可100%抑制hiv感染cd4+的h9淋巴細胞；高濃度的mbl（10-50mg/l）能夠顯著抑制b淋巴系raji細胞的生長；mbl可以抑制白假絲酵母菌（c.albicans）誘導的htp1/cd14細胞產生tnf-α和il-8。因此，深入研究mbl在適應性免疫系統(tǒng)中的作用，具有重要的科學意義和潛在的醫(yī)學實踐意義。
在適應性免疫應答反應中t淋巴細胞是主要的參與者，最初研究發(fā)現(xiàn)cd4+t細胞分為經典的th1細胞、th2細胞和調節(jié)性t細胞（regulatorytcell，treg）三個亞群。th1細胞主要通過分泌ifn-γ、il-12等細胞因子控制細胞內病原體（細菌和病毒）的感染，th1細胞與各種自身免疫病有關；th2細胞主要分泌il-4、il-5和il-13等細胞因子控制寄生蟲和其它細胞外微生物的感染，部分介導過敏反應；treg細胞主要在維持機體免疫平衡中起重要作用。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)以上幾種t細胞并不能完全解釋一些自身免疫性疾病，感染和過敏反應等一些疾病的發(fā)病機制。近年來研究發(fā)現(xiàn)一種不同于th1細胞、th2細胞和treg細胞獨立的cd4+t細胞，越來越受到人們的關注，因其主要分泌il-17細胞因子，被稱為th17細胞（thelper17cells）。th17細胞在維持機體平衡中起著舉足輕重的作用。研究發(fā)現(xiàn)在一些鼠自身免疫性疾病的模型中和一些自身免疫病患者中，均發(fā)現(xiàn)th17細胞數(shù)量增高，如實驗性自身免疫性腦脊髓炎（eae）、膠原誘導的關節(jié)炎（cia）、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡（sle）、類風濕關節(jié)炎（ra）、多發(fā)性硬化癥（ms）、哮喘等。這些研究成果表明，對th17細胞進行干預，可能是治療多種自身免疫性疾病和一些炎癥性疾病的靶目標。
近年來研究發(fā)現(xiàn)，th17細胞作為一種促炎性的cd4+t細胞亞群，在慢性炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤以及感染性疾病中均發(fā)揮重要作用。研究表明，核孤兒受體γt（theorphannuclearreceptorrorγt）是th17細胞分化的關鍵轉錄因子，促進人類th17細胞分化的特異性轉錄因子是rorc，而轉化生長因子tgf-β1（transforminggrowthfactor-β1）、il-6、il-21和il-23對th17細胞誘導分化中至關重要。因此，尋找新的抑制th17細胞分化因素，對于治療多種自身免疫性疾病具有重要的科學意義和臨床醫(yī)學實踐意義。如果想減少th17細胞的數(shù)量，除了阻斷其特異性核轉錄因子rorγt的表達以及減少誘導其分化的幾種細胞因子，是否還有其它未知的能夠抑制th17細胞的分化的因素亟待進一步深入研究。
近年來本課題組一直從事mbl免疫調節(jié)相關研究，研究發(fā)現(xiàn)，低濃度mbl（生理濃度，1mg/l）對樹突狀細胞（dc）分化成熟起促進作用，增強免疫應答；高濃度mbl（超生理濃度，10mg/l）明顯抑制b淋巴系raji細胞的生長；高濃度mbl（超生理濃度，10mg/l）可以抑制白假絲酵母菌（c.albicans）誘導的htp1/cd14細胞產生tnf-α和il-8。這些研究結果均表明，mbl在免疫調節(jié)中起著不同的作用。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提出了mbl在制備預防或治療th17細胞引發(fā)疾病藥物中的應用，主要探討了mbl對cd4+t細胞向th17細胞誘導分化的影響，結果表明mbl可以直接抑制cd4+t細胞向th17細胞誘導分化，這不僅是在理論上有顯著性突破（在此之前從未有關mbl誘導th17細胞的文獻報道），而且具有潛在的臨床醫(yī)學意義，為治療th17細胞引起的自身免疫性疾病、過敏性疾病和感染性疾病提供了一種新的治療途徑。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的采用如下技術方案，mbl在制備預防或治療th17細胞引發(fā)疾病藥物中的應用，th17細胞引發(fā)疾病包括自身免疫性疾病、過敏性疾病和感染性疾病，其中自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、graves病和糖尿病腎病，過敏性疾病包括支氣管哮喘、過敏性紫癜和過敏性鼻炎，感染性疾病包括慢性乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、hiv感染和hbv宮內感染。
進一步優(yōu)選，所述mbl通過抑制cd4+t細胞向th17細胞誘導分化實現(xiàn)藥物的功效。
進一步優(yōu)選，所述mbl為聯(lián)合應用配體和單克隆抗體親和層析純化人血漿天然mbl蛋白。
進一步優(yōu)選，所述mbl的濃度高于其在體內的生理濃度。
進一步優(yōu)選，所述mbl的濃度為10ng/ml。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
1、本發(fā)明采用的血標本來源是臍帶血，相比于外周血而言，臍帶血更容易獲得，而且采集的量相對來說較多，臍帶血中還有大量造血干細胞，更容易誘導分化；
2、本發(fā)明通過探索得到了調節(jié)th17細胞誘導分化的新因素，即mbl直接抑制cd4+t細胞向th17細胞誘導分化；
3、本發(fā)明中流式細胞術檢測的是th17細胞特異性的轉錄因子rorγt抗體，相對于檢測il-17a抗體（il-17a主要是th17細胞分泌的）更具有特異性；
4、本發(fā)明突顯出mbl的一種新功能，不僅在天然免疫中發(fā)揮重要作用，而且能夠抑制促炎性th17細胞的誘導分化，是治療多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的新靶點。
附圖說明
圖1是免疫磁珠分選cd4+t細胞的純度圖；
圖2是流式細胞術檢測mbl對cd4+t細胞向th17細胞誘導分化圖。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明的上述內容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內容實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例
實驗材料
1、實驗所用細胞來源
新生兒臍帶血采自新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院和新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院婦產科足月健康新生兒，胎兒娩出后立即從胎盤臍靜脈穿刺采血放入含有28ml保存液的采血袋中。所有血樣標本均在采樣后4h內送達實驗室。
2、主要試劑
培養(yǎng)基rpmi1640、胎牛血清（fetalbovineserum，fbs）10×pbs溶液、均購自thermofisherscientific公司。
淋巴細胞分離液（ficoll-paqueplus），是ficolltmpm400和密度1.077g/ml的泛影酸鈉的無菌內毒素（＜0.12eu/ml）測試溶液，購自gehealthcarelifesciences公司。
抗人cd3單克隆抗體（cd3mab）、抗人cd28單克隆抗體（cd28mab）、pe-cyanine7標記的cd3mab、fitc標記的cd4mab、pe標記的rorγtmab以及cellstimulationcocktail（plusproteintransportinhibitors）均購自ebioscience公司；bv605標記的cd8mab購自biolegend公司。
人cd4+磁珠分選試劑盒、ms分選柱、macs分選架均購自miltenyibiotec公司。
重組人mbl購自acrobiosystems公司；人il-6和轉化生長因子-β1（tgf-β1）購自miltenyibiotec公司。
3、主要儀器和設備
超凈工作臺，sw-cj-2fd型，蘇州凈化設備有限公司。
水浴箱，ssw-420-2s型，上海博訊公司。
co2培養(yǎng)箱，thermo，thermo公司。
低速臺式離心機，tdl-5型，上海安享科學儀器廠。
流式細胞儀，facscalibur型，美國bd公司。
倒置顯微鏡，ts100-f型，日本nikon公司。
低溫離心機，eppendorf5810r型，德國eppendorf公司。
純水儀，nw型，healforece公司。
4、常用試劑配制
（1）1×pbs溶液
1體積份10×pbs溶液+9體積份蒸餾水
（2）1×permbuffer溶液
1體積份10×permbuffer+9體積份deionizedwater
例如：需要10ml的1×permbuffer溶液，則量取1ml的10×permbuffer，9ml的deionizedwater，混勻即可。
實驗方法
1、人臍帶血單個核細胞（cbmc）的提取
依照淋巴細胞分離液（ficoll）說明書，通過密度梯度離心法分離人臍帶血單個核細胞，具體操作步驟如下：取15ml的玻璃管數(shù)支，每支加4ml的ficoll，玻璃管傾斜45℃，沿管壁緩慢加入1:1稀釋的新鮮臍帶血液8ml于淋巴細胞分離液液面上，并且保持兩界面清晰。水平離心機1500r/min室溫離心30min。離心結束后液面分三層，上層為血漿層，中間為人淋巴分離液層，下層主要為紅細胞和粒細胞層。在上層和中間層之間乳白色云霧狀層即為單個核細胞層（cbmc）。用一次性吸管小心吸取云霧狀層，移入到一支新的15ml離心管中，并加入三倍體積的1×pbs洗滌細胞。1500r/min離心10min，棄去上清，并重復兩次。用rpmimedium1640培養(yǎng)基（10wt%fbs）重懸細胞沉淀，并進行活細胞計數(shù)，以待用。
2、人臍帶血cd4+t細胞磁性分選
樣品準備
用buffer重懸已提取的cbmc細胞，為去除血小板，用buffer重懸細胞并200×g離心10-15min，小心吸取上清，重復洗滌兩次。
磁性標記cd4+t細胞
整個過程要快速完成，并保持細胞處于預冷狀態(tài)，防止成帽現(xiàn)象出現(xiàn)。
推薦孵育的溫度為2-8℃。
ms柱磁性標記≤107細胞。
采用帶有30μm的血液尼龍過濾網的過濾器處理細胞懸液，過濾器使用前用buffer濕潤一下。
（1）細胞計數(shù)；
（2）細胞懸液300×g離心10min，完全棄上清；
（3）每107細胞加入80μlmacsbuffer重懸細胞；
（4）每107細胞加入20μlcd4microbeads；
（5）混勻并在冰箱（2-8℃）孵育15min；
（6）（可選步驟）加入染色抗體。比如，加入10μlcd4-fitc，在冰箱（2-8℃）避光孵育5min；
（7）每107細胞加入1-2mlmacsbuffer重懸細胞，300×g離心10min，完全棄上清；
（8）每108細胞加入500μlbuffer重懸細胞，細胞數(shù)目應小于108，大于108應相應增加buffer的體積；
（9）進入下一步磁性分選。
cd4+t細胞的磁性正分選
依據(jù)總細胞數(shù)目選擇適合的分選柱。
總是要等到分離柱中的液體流盡時，再執(zhí)行下一步。
用ms分離柱分選
（1）將ms分離柱置于macs分選器中；
（2）加入500μlbuffer潤洗分離柱；
（3）將500μl細胞懸液置于ms分離柱中，收集流出的液體（即未標記的cd4-t細胞）；
（4）加入500μlbuffer沖洗ms分離柱3次，收集流出的液體（即未標記的cd4-t細胞）；
（5）將ms分離柱移出macs分選器，放置合適的收集管上；
（6）加入1mlbuffer置于ms分離柱中，立即推動活塞將標記的cd4+t細胞置于收集管中，重復兩次；
（7）為增加cd4+t細胞的純度，上一步收集的cd4+t細胞可以通過第二個ms分離柱，重復1-6的分選步驟；
（8）收集的cd4+t細胞懸液，1500rpm離心10min，完全棄去上清，用10wt%fbsrpmimedium1640培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，并進行活細胞計數(shù)，以待用。
3、包被anti-cd3mab
將1mg/ml的anti-cd3mab用無菌的1×pbs稀釋至2μg/ml，加入96孔板，50μl/孔，4℃過夜。
4、不同濃度mbl對th17細胞的誘導分化
以每孔1×106個/ml的密度，將分選的cd4+t細胞加入預先包被的2μg/mlanti-cd3mab的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200μl，各孔均加入anti-cd28mab（1μg/ml）、il-6（25ng/ml）tgf-β1（0.5ng/ml），實驗組分別加入不同濃度（1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）的mbl，對照組不加mbl，每組均設3個復孔。將細胞置于37℃，體積分數(shù)為5%的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)的第3天，加入cellstimulationcocktail（plusproteintransportinhibitors500×）刺激20h，然后收集細胞用于相關實驗。
5、流式細胞術檢測th17細胞在不同條件下轉錄因子rorγt的表達
（1）收集各組培養(yǎng)后的細胞懸液于1.5mlep管，每管1×106個細胞；
（2）4℃離心機500×g，離心5min，完全棄上清；
（3）加入400μl1×pbs重懸細胞沉淀，4℃離心機500×g，離心5min，棄上清，重復一次；
（4）加入200μl1×pbs重懸細胞，分別加入1μlpecyanine7-cd3、2μlfitc-cd4、1μlbv605-cd8，4℃，避光孵育30min；
（5）孵育完成后，直接加入200μl1×pbs，4℃，500×g，離心5min，棄上清，重復一次；
（6）加入200μl1×fixation/permeabilization溶液重懸細胞，4℃，避光孵育30min；
（7）孵育完成后，直接加入200μl1×perm/washbuffer，4℃，500×g，離心5min，棄上清，重復一次；
（8）分別加入100μl1×perm/washbuffer和1μlpe-rorγt，4℃，避光孵育30min；
（9）孵育完成后，直接加入200μl1×perm/washbuffer，4℃，500×g，離心5min，棄上清，重復一次；
（10）分別加入400μl1×pbs重懸細胞，待上機檢測，倘若不能及時上機檢測可加入500μl4wt%多聚甲醛重懸細胞，于24-48h內上機。
實驗結果
從圖1可以看出，通過免疫磁珠分選可以得到高純度的cd4+t細胞；從圖2可以看出，mbl抑制cd4+rorγt+th17細胞的比例，由此可見，高濃度（10ng/ml，高于生理濃度）的mbl能夠抑制cd4+t細胞向th17細胞誘導分化，進而能夠作為治療多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的新靶點。
以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發(fā)明保護的范圍內。