本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大黃酸/殼聚糖水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大黃酸是源于中藥大黃的一種游離型蒽醌類物質(zhì)，分子式是CH₁₅H₈O₆。它是一種來源于天然的抗氧化劑和抗炎物質(zhì)，毒副作用小，而且具有很好的抗氧化和抗炎作用，因此在抗腫瘤，抗炎，瀉下，神經(jīng)保護，調(diào)脂等方面具有較高活性。

殼聚糖是自然界唯一大量存在的堿性多糖，生物毒性小，殼聚糖憑借著其良好的生物相容性(Biomacromolecules.2003.4：1457-1465)，特殊的生物活性(抗炎、止血、促進組織粘連、降脂、降膽固醇、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤作用等)和來源廣泛，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了深入的研究和廣泛的應(yīng)用，是一種理想的醫(yī)用植入材料。殼聚糖在體內(nèi)溶菌酶的作用下，一部分可最終代謝為二氧化碳排除體外，另一部分則以糖蛋白的形式為人體吸收。

殼聚糖之所以在生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到關(guān)注，是因為它是一種帶正電荷的多糖聚合物，可以和帶負(fù)電的細胞壁發(fā)生電荷吸引，有利于細胞的黏附；其降解后的產(chǎn)物與細胞外基質(zhì)的某些成分結(jié)構(gòu)類似，具有良好的生物相容性(Chem.Com.2015.51：15862-15865)；殼聚糖可以和細胞生長因子復(fù)合以減少藥物的失活。

可注射水凝膠中一種比較重要的運用形式是溫敏性凝膠注射系統(tǒng)，溫敏水凝膠是指隨溫度的變化會發(fā)生溶液—凝膠的轉(zhuǎn)變。這種水凝膠的形成往往不需要其它化學(xué)試劑的引發(fā)，可以液體的形式注射進入體內(nèi)，原位固化，并且它們的交聯(lián)點溫度可通過調(diào)節(jié)接近體溫，是一種非常理想的給藥系統(tǒng)。

小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞中的一種，其是參與大腦免疫炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞。在阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫等小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病中，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后，靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞被激活，遷移至損傷的腦細胞區(qū)?；罨男∧z質(zhì)細胞可分泌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和白介素12(IL-12)等多種細胞因子參與炎癥反應(yīng)的免疫應(yīng)答。因此，抑制小膠質(zhì)細胞的活化從而減輕炎癥因子的表達對治療阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫等小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等特性的可注射的大黃酸/殼聚糖水凝膠，可解決大黃酸溶解性差問題，并保留了大黃酸的生物活性。本發(fā)明還提供了上述大黃酸/殼聚糖水凝膠的制備方法，制備工藝簡單。本發(fā)明還提供了上述大黃酸/殼聚糖水凝膠在制備阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫等小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥性腦病的藥物中的應(yīng)用，治療效果明顯。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種大黃酸/殼聚糖水凝膠，包括大黃酸溶液和殼聚糖溶液，所述大黃酸溶液包括大黃酸和NaHCO₃溶液。

上述的大黃酸/殼聚糖水凝膠，優(yōu)選的，原料組分如下：所述殼聚糖溶液的濃度為20mg/mL，所述大黃酸溶液的濃度為1～3mg/mL，所述大黃酸溶液與所述殼聚糖溶液的體積比為2～5∶1，所述NaHCO₃溶液的濃度為0.1～0.5mol/L。

作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述的大黃酸/殼聚糖水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

S1、將大黃酸溶于NaHCO₃溶液中，得到大黃酸溶液；

S2、在冰浴條件下，向殼聚糖溶液邊攪拌邊加入所述大黃酸溶液，然后以70～120W的超聲功率超聲脫氣處理，置于高于32℃的溫度下加熱1～5min得到大黃酸/殼聚糖水凝膠。

上述的制備方法，優(yōu)選的，所述殼聚糖溶液采用以下方法制備得到：殼聚糖溶于乙酸溶液中，攪拌溶解得到殼聚糖溶液。

上述的制備方法，優(yōu)選的，所述乙酸溶液的體積百分含量為1％；所述殼聚糖溶液的濃度為20mg/mL。

上述的制備方法，優(yōu)選的，所述大黃酸溶液濃度為1～3mg/mL，所述大黃酸溶液與殼聚糖溶液的體積比為2～5∶1，所述NaHCO₃溶液的濃度為0.1～0.5mol/L。

作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明提供了一種上述的大黃酸/殼聚糖水凝膠或上述制備方法制備得到的大黃酸/殼聚糖水凝膠在制備用于治療小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明提供了一種上述的大黃酸/殼聚糖水凝膠或上述制備方法制備得到的大黃酸/殼聚糖水凝膠在制備用于減輕或治療小膠質(zhì)細胞炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用；或在制備用于保護神經(jīng)細胞藥物中的應(yīng)用；或在制備用于治療小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥性腦病藥物中的應(yīng)用。

作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明提供了一種上述的大黃酸/殼聚糖水凝膠或上述制備方法制備得到的大黃酸/殼聚糖水凝膠在制備用于治療阿爾茨海默病、帕金森病、腦外傷、腦水腫藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明提供了一種大黃酸/殼聚糖水凝膠，可注射水凝膠中一種比較重要的運用形式是溫敏性凝膠注射系統(tǒng)，溫敏水凝膠是指隨溫度的變化會發(fā)生溶液—凝膠的轉(zhuǎn)變。這種水凝膠的形成往往不需要其它化學(xué)試劑的引發(fā)，可以液體的形式注射進入體內(nèi)，原位固化，并且它們的交聯(lián)點溫度可通過調(diào)節(jié)接近體溫，是一種非常理想的給藥系統(tǒng)。利用上述原理，我們成功地制備了大黃酸/殼聚糖水凝膠，此形成的水凝膠不僅解決了大黃酸溶解性差的問題，而且保留了大黃酸的生物活性，水凝膠的力學(xué)強度更大，運用更廣泛。

(2)本發(fā)明提供了一種大黃酸/殼聚糖水凝膠，大黃酸和殼聚糖都具有抗炎作用，是源于天然產(chǎn)物的抗炎藥物，加入的殼聚糖可以和大黃酸發(fā)生共組裝，增強了水凝膠的機械強度和抗炎，抗菌性，使水凝膠具有適合的硬度，彈性和粘性。該水凝膠易于注射，注射后可迅速原位固化，然后緩慢藥物，延長藥物作用時間。因此，大黃酸/殼聚糖水凝膠運用于小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病中，可以發(fā)揮協(xié)同作用，很好地抑制活化的小膠質(zhì)細胞分泌的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和白介素12(IL-12)等多種炎癥因子的表達，從而發(fā)揮抗炎治療相關(guān)疾病的療效。對促進大黃酸應(yīng)用于臨床，成為臨床新藥具有積極意義。

(3)本發(fā)明提供了一種大黃酸/殼聚糖水凝膠的制備方法，制備過程簡單，成本低，可商品化，適于大規(guī)模生產(chǎn)，有望運用在組織工程，藥物緩釋，傷口愈合和神經(jīng)保護等生物醫(yī)藥領(lǐng)域。即保留了大黃酸生物活性，又延長了大黃酸在病變位置的作用時間，增強了藥物的治療效果，在生物醫(yī)學(xué)方面具有良好的運用前景。

附圖說明

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述。

圖1為本發(fā)明實施例1中大黃酸/殼聚糖水凝膠的透射電子顯微鏡(TEM)圖。

圖2為本發(fā)明實施例1中大黃酸/殼聚糖水凝膠的數(shù)碼照片圖。

圖3為本發(fā)明實施例1中對照組和大黃酸/殼聚糖水凝膠組的傅里葉紅外譜圖。

圖4為本發(fā)明實例2中不同濃度的大黃酸/殼聚糖水凝膠的體外緩釋曲線圖。

圖5為本發(fā)明實施例3中大黃酸/殼聚糖水凝膠和大黃酸對LPS誘導(dǎo)BV2細胞生成誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平的影響。

圖6為本發(fā)明實施例3中大黃酸/殼聚糖水凝膠和大黃酸對LPS誘導(dǎo)BV2細胞生成TNF-α炎癥因子水平的影響。

圖7為本發(fā)明實施例3中大黃酸/殼聚糖水凝膠和大黃酸LPS誘導(dǎo)BV2細胞生成6(IL-6)炎癥因子水平的影響。

圖8為本發(fā)明實施例3中大黃酸/殼聚糖水凝膠和大黃酸LPS誘導(dǎo)BV2細胞生成12(IL-12)炎癥因子水平的影響。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。

以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。

實施例1

一種本發(fā)明的大黃酸/殼聚糖水凝膠，包括大黃酸溶液和殼聚糖溶液，大黃酸溶液包括大黃酸和NaHCO₃溶液，采用以下方法制備得到：

(1)殼聚糖溶液的制備：稱取200mg的殼聚糖于離心管中，加入10mL體積比為1％乙酸溶液，攪拌溶解，配置濃度為20mg/mL的殼聚糖溶液。

(2)NaHCO₃溶液的制備：稱取0.84g NaHCO₃于燒杯中，加入超純水?dāng)嚢枞芙?，然后轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加水定容，配置濃度0.1mol/L的NaHCO₃溶液。

(3)稱取2mg大黃酸粉末于相應(yīng)的離心管中，向離心管中邊震蕩邊加入1mL步驟(2)的NaHCO₃溶液得到濃度為2mg/mL的大黃酸溶液。

(4)取0.5mL步驟(1)的殼聚糖溶液于螺口瓶中，在0℃冰水混合的冰浴條件下，向殼聚糖溶液中邊攪拌邊滴加1mL大黃酸溶液，攪拌均勻后然后以100W的超聲功率超聲1min脫氣處理，置于高于32℃(本實施例為32℃)的恒溫水浴鍋中加熱2min即可得到的大黃酸/殼聚糖水凝膠，其中大黃酸的濃度為1.4mg/mL，殼聚糖的最終濃度6.67mg/mL。

在其他實施例中，步驟(4)中可添加2.5mL大黃酸溶液。

用掃描電鏡(TEM)考察其微觀結(jié)構(gòu)。

透射電鏡制樣：夾取銅網(wǎng)小心的放入水凝膠的半固體膠體或稀釋后的溶液內(nèi)，緩緩擺動銅網(wǎng)1min使樣品附著在銅網(wǎng)上。取出銅網(wǎng)，用濾紙輕輕拭去銅網(wǎng)上多余樣品。自然晾干，將樣品放入干燥器內(nèi)保持干燥，待測TEM。

圖1為大黃酸/殼聚糖水凝膠電鏡掃描結(jié)果。如圖1所示大黃酸/殼聚糖水凝膠表現(xiàn)出帶狀的三維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)。殼聚糖屬于高分子聚合物，具有良好的成膜性，所得形貌圖是層狀結(jié)構(gòu)。因此，大黃酸和殼聚糖通過非共價鍵自組裝形成的可注射水凝膠是帶狀的相互交織的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

用數(shù)碼相機記錄實施例1中制備得到的大黃酸/殼聚糖水凝膠的外觀。如圖2所示，大黃酸/殼聚糖水凝膠是橘黃色的，均一穩(wěn)定的。

對大黃酸/殼聚糖水凝膠進行傅里葉紅外譜圖譜考察；

大黃酸/殼聚糖水凝膠組：即實施例1的大黃酸/殼聚糖水凝膠，其中大黃酸的濃度為1.4mg/mL，殼聚糖的最終濃度為6.67mg/mL。

對照組：大黃酸粉末。

紅外測試實驗步驟：把實施例1的大黃酸/殼聚糖水凝膠冷凍干燥，得到凍干凝膠。稱取一定質(zhì)量的凍干水凝膠與相應(yīng)質(zhì)量的溴化鉀壓片(50:1)，得到片狀的樣品，大黃酸粉末固體作為對照。

圖3為大黃酸/殼聚糖水凝膠的傅里葉紅外譜圖。圖中(a)是對照組；(b)是大黃酸/殼聚糖水凝膠組。如圖所示：a中3448cm^-1屬于的O-H的伸縮振動吸收峰，1962cm^-1和1630cm^-1分別屬于C＝O的非對稱和對稱伸縮振動吸收峰，出現(xiàn)在1692cm^-1，1630cm^-1和1452cm^-1的吸收峰屬于芳環(huán)骨架的伸縮振動峰，位于1268cm^-1處的峰屬于C-O的伸縮振動峰，出現(xiàn)在808cm^-1處的峰屬于O-H的彎曲振動吸收峰；b中3446cm^-1為O-H的伸縮振動吸收峰，此吸收峰變?nèi)酰⑶以?558cm^-1處出現(xiàn)了一個吸收峰，這是酰胺中N-H的特征吸收峰，說明有酰胺鍵的生成，大黃酸中的羧基和殼聚糖中的氨基發(fā)生反應(yīng)生成一個有酰胺鍵。

實施例2

一種本發(fā)明的大黃酸/殼聚糖水凝膠，包括大黃酸溶液和殼聚糖溶液，大黃酸溶液包括大黃酸和NaHCO₃溶液，采用以下方法制備得到：

(1)NaHCO₃溶液的制備：稱取0.84gNaHCO₃于燒杯中，加入超純水?dāng)嚢枞芙?，然后轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加水定容，配置濃度0.1mol/L的NaHCO₃溶液。

(2)大黃酸溶液的制備：分別稱取3mg、2.5mg、2mg、1.7mg大黃酸于相應(yīng)的螺口瓶中，向每個螺口瓶中邊震蕩邊加入1mL濃度為0.1mol/L的NaHCO₃溶液，分別配制成3mg/mL、2.5mg/mL、2mg/mL、1.7mg/mL的大黃酸溶液。

(3)殼聚糖溶液的制備：稱取200mg的殼聚糖于離心管中，加入10mL體積比為1％乙酸溶液，超聲溶解，配置濃度為20mg/mL的殼聚糖溶液。

(4)分別取0.5mL殼聚糖溶液于4個螺口瓶中，在0℃冰水混合的冰浴條件下，邊攪拌邊分別滴加1mL濃度為3mg/mL、2.5mg/mL、2mg/mL、1.7mg/mL的大黃酸溶液，攪拌均勻后以100W的超聲功率超聲1min脫氣處理，然后放入高于32℃(本實施例為32℃)的恒溫水浴鍋中加熱2min后即可得到的大黃酸/殼聚糖水凝膠，其中大黃酸的濃度分別為2mg/mL、1.7mg/mL、1.4mg/mL、1.1mg/mL，殼聚糖溶液的最終濃度為6.67mg/mL。

在紫外可見分光度計下進行吸光度檢測，檢測方法為：配置PH＝7.4(模擬生理體液)，濃度為10mmol/L的PBS(磷酸氫二鈉～磷酸二氫鉀)緩沖溶液作為大黃酸的釋放介質(zhì)，每個大黃酸/殼聚糖水凝膠中加入5mL的PBS緩沖液，置于高于32℃(本實施例為32℃)的恒溫水浴鍋中，在一定的時間點分別搖動水凝膠，大黃酸逐漸被釋放出來，每隔一段時間取出PBS緩沖液3mL，并同時補充3mL新鮮的PBS緩沖液到釋放體系中，在紫外可見分光度計下測試吸光度，以空白凝膠作對照，記錄不同時間段的吸光度值，本實驗選取的時間點為0.5h、2h、6h、30h、54h、72h、90h、108h。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大黃酸的濃度，從而繪制出釋放曲線。

表1：大黃酸水凝膠的吸光度變化率

釋放率＝累計釋放量/載藥量×100％。

同時參見圖4，圖4體現(xiàn)不同濃度的大黃酸/殼聚糖水凝膠釋放大黃酸的情況。

從表1和圖4中可知：在6h內(nèi)，不同濃度的大黃酸/殼聚糖水凝膠釋放大黃酸的速度都很快，隨著時間的增加，釋放速率逐漸減慢。隨著大黃酸濃度的增加，大黃酸和殼聚糖之間的相互作用力增強，釋放速率降低。在100h內(nèi)，大黃酸/殼聚糖水凝膠能持續(xù)釋放藥達70％以上。這表明大黃酸/殼聚糖水凝膠具有很好的緩釋效果。

實施例3

一種本發(fā)明的大黃酸/殼聚糖水凝膠在治療小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病中的應(yīng)用，具體方法包括以下步驟：

1.藥物培基的配制：

含藥培基1的配置：取含大黃酸濃度為1.6mg/mL的大黃酸/殼聚糖水凝膠母液，加入培養(yǎng)基中稀釋得到含藥培基1，含藥培基1中大黃酸/殼聚糖水凝膠所含大黃酸的濃度為4.5μg/mL。

含藥培基2的配置：取濃度為6mg/mL的大黃酸單體母液，加入到培養(yǎng)基中，配制含藥培基2，含藥培基2中大黃酸單體濃度4.5μg/mL。

2.大鼠小膠質(zhì)細胞(BV2細胞系)炎癥性模型的制備：

大黃酸組：取處于對數(shù)生長期的BV2細胞，用胰酶消化液消化，制成細胞懸液；鋪板，保證每孔70％的覆蓋率。過夜，細胞貼壁；去除BV2細胞的培基，加入上述含藥培基2，并標(biāo)號；待以上含藥培基2處理30min后，每孔加入1μg/mL的脂多糖(LPS)，處理48h后收集細胞和上清液，進行后續(xù)檢測。

大黃酸/殼聚糖水凝膠組：取處于對數(shù)生長期的BV2細胞，用胰酶消化液消化，制成細胞懸液；鋪板，保證每孔70％的覆蓋率。過夜，細胞貼壁；去除BV2細胞的培基，加入含藥培基1，并標(biāo)號；待以上含藥培基1處理30min后，每孔加入1μg/mL的LPS，處理48h后收集細胞和上清液，進行后續(xù)檢測。

LPS組：取處于對數(shù)生長期的BV2細胞，用胰酶消化液消化，制成細胞懸液；鋪板，保證每孔70％的覆蓋率。過夜，細胞貼壁；去除BV2細胞的培基，加入新鮮不含藥物的培基，30min后，加入1μg/mL的LPS，處理48h后收集細胞和上清液，進行后續(xù)檢測。

空白組：取處于對數(shù)生長期的BV2細胞，用胰酶消化液消化，制成細胞懸液；鋪板，保證每孔70％的覆蓋率。過夜，細胞貼壁；去除BV2細胞的培基，加入新鮮不含藥物的培基，并標(biāo)號。

3.ELISA法測定小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素12(IL-12)的表達：

(1)實驗儀器：臺式高速冷凍離心機湘儀(H1650R)；全自動酶標(biāo)洗板機匯松(PW-812)；多功能酶標(biāo)分析儀匯松(MB-530)；恒溫培養(yǎng)箱光明(DHP-500)；自動平衡離心機湘儀(L530)；干凈試管和離心管；容量瓶；系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭。

(2)樣本采集；分別收集每孔板中的細胞上清，于10000rpm離心10min，仔細吸取上清，-20℃冰箱保存留作實驗的樣本，實驗之前從冰箱取出，自然解凍。

(3)實驗試劑的配制：

本實施例中，試劑盒為武漢華美生物科技有限公司生產(chǎn)的ELISA法試劑盒，其中各試劑盒的批號如下：一氧化氮合酶試劑盒為Lot:A16039818，腫瘤壞死因子的試劑盒為Lot:Z06939817，白介素6的試劑盒為Lot:Z01039820，白介素12的試劑盒為Lot:Z01039822。

標(biāo)準(zhǔn)品：從試劑盒中取出一支標(biāo)準(zhǔn)品，于10000rpm離心30s。用1mL樣本稀釋液(本實施例為10mmol/L的PBS(磷酸氫二鈉～磷酸二氫鉀)，PH值為7.4，0.05％吐溫-20(體積比)，0.5％的牛血清蛋白(BSA)溶解，并用槍頭對準(zhǔn)凍存管底部反復(fù)吸打5次以助溶解，充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)品S₇，放置備用；取7個1.5mL離心管，編號為S₆～S₀。將離心管依次排列，各加入250μL樣本稀釋液。吸取250μL標(biāo)準(zhǔn)品S₇到第一個離心管中(S₆)，輕輕吹打混勻。從S₆中吸取250μL到第二個EP管(S₅)，輕輕吹打混勻，以此類推進行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S₀為樣本稀釋液。

洗滌工作液：將濃洗滌液(本實施例為0.02mol/L PBS(PH＝7.4)加上0.05％吐溫-20)按1∶25倍用去離子水進行稀釋，具體為：用量筒量取240mL去離子水，倒入燒杯或其他潔凈容器中，再量取10mL濃洗滌液，均勻加入，攪拌混勻，在臨用前配妥。濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

生物素標(biāo)記抗體工作液：將生物素標(biāo)記抗體液(本實施例為10mg/mL生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液)按1∶100倍用生物素標(biāo)記抗體稀釋液進行稀釋，具體為：10μL生物素標(biāo)記抗體液加990μL生物素標(biāo)記抗體稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10min內(nèi)配妥。

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液：辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(本實施例采用的為武漢華美生物科技有限公司生產(chǎn)的辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素)按1∶100倍用辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液進行稀釋，具體為：10μL辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μL辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10min。

(4)操作步驟：

4.1、將各種試劑移至室溫(18～25℃)平衡至少30min，按前述方法配置試劑，備用。

4.2、加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣本孔，每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，置37℃溫育2h。

4.3、棄去液體，甩干，不用洗滌。

4.4、每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μL，覆上新的板貼，置37℃溫育1h。

4.5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，采用配制的洗滌工作液洗板3次。每次洗板，將洗滌工作液浸泡2min，200μL每孔，甩干。

4.6、每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100μL，覆上新的板貼，置37℃溫育1h。

4.7、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2min，200μL每孔，甩干。

4.8、依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色15min。

4.9、依序每孔加終止液(本實施例為2mol/L H₂SO₄溶液)50μL，終止反應(yīng)。

4.10、在反應(yīng)終止后5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)，計算各個炎癥因子的含量。實驗結(jié)果分別見圖5、圖6、圖7和圖8。

圖5為大黃酸/殼聚糖水凝膠和大黃酸對LPS誘導(dǎo)BV2細胞產(chǎn)生誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平的影響，從圖5可以看出：與空白組相比(^#p＜0.01)，LPS組iNOS的水平顯著增加，說明LPS能刺激BV2細胞產(chǎn)生iNOS水平明顯增加，與LPS組比較，大黃酸組iNOS表達水平明顯低于LPS組(^△p＜0.01)，大黃酸/殼聚糖水凝膠組iNOS表達水平明顯低于LPS組(^*p＜0.01)，這說明大黃酸和大黃酸/殼聚糖水凝膠均能抑制iNOS的表達，與大黃酸組相比，大黃酸/殼聚糖水凝膠組iNOS表達水平明顯低于大黃酸組(^□p＜0.01)，這說明大黃酸/殼聚糖水凝膠抑制iNOS表達的水平明顯優(yōu)于大黃酸。

圖6為大黃酸/殼聚糖水凝膠和大黃酸對LPS誘導(dǎo)BV2細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平的影響，從圖6可以看出：與空白組比(^#p＜0.01)，LPS組TNF-α水平顯著增加，說明LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生TNF-α水平明顯增加；與LPS組比較，大黃酸組TNF-α表達水平明顯降低(^△p＜0.05)，大黃酸/殼聚糖水凝膠組TNF-α表達水平也顯著下降(^*p＜0.01)，這說明大黃酸/殼聚糖水凝膠均能抑制TNF-α的表達水平；與大黃酸組比，大黃酸/殼聚糖水凝膠組TNF-α表達水平明顯下降(^□p＜0.05)，這說明大黃酸/殼聚糖水凝膠抑制TNF-α的表達明顯優(yōu)于大黃酸。

圖7為大黃酸/殼聚糖水凝膠和大黃酸對LPS誘導(dǎo)BV2細胞產(chǎn)生白介素6(IL-6)水平的影響，從圖7可以看出：與空白組比(^#p＜0.01)，LPS組IL-6水平顯著增加，說明LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生IL-6水平明顯增加；與LPS組比較，大黃酸組IL-6表達水平明顯降低(^△p＜0.01)，大黃酸/殼聚糖水凝膠組IL-6表達水平也顯著下降(^*p＜0.01)，這說明大黃酸和大黃酸/殼聚糖水凝膠均能抑制IL-6的表達水平；與大黃酸組比，大黃酸/殼聚糖水凝膠組IL-6表達水平明顯下降(^□p＜0.05)，這說明大黃酸/殼聚糖水凝膠抑制IL-6的表達明顯優(yōu)于大黃酸。

圖8為大黃酸/殼聚糖水凝膠和大黃酸對LPS誘導(dǎo)BV2細胞白介素12(IL-12)水平的影響，從圖8可以看出：與空白組比(^#p＜0.01)，LPS組IL-12水平顯著增加，說明LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生IL-12水平明顯增加；與LPS組比較，大黃酸組IL-12表達水平明顯降低(^△p＜0.01)，大黃酸/殼聚糖水凝膠組IL-12表達水平也顯著下降(^*p＜0.01)，這說明大黃酸和大黃酸/殼聚糖水凝膠均能抑制IL-12的表達水平；與大黃酸組比，大黃酸/殼聚糖水凝膠組IL-12表達水平明顯下降(^□p＜0.01)，這說明大黃酸/殼聚糖水凝膠抑制IL-12的表達明顯優(yōu)于大黃酸。

因此，大黃酸/殼聚糖水凝膠運用于小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥性疾病中，可以發(fā)揮協(xié)同作用，很好地抑制活化的小膠質(zhì)細胞分泌的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和白介素12(IL-12)等多種炎癥因子的表達，從而發(fā)揮抗炎治療相關(guān)疾病的療效。對促進大黃酸應(yīng)用于臨床，成為臨床新藥具有積極意義。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護的范圍內(nèi)。