本發(fā)明具體涉及2-甲基丁酸乙酯在制備抗微小隱孢子蟲藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲(Cryptosporidium)呈世界性分布。感染人和大多數(shù)哺乳動(dòng)物的為微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)。隱孢子蟲是一種重要的引起人和動(dòng)物腹瀉的機(jī)會(huì)性致病原蟲。嚴(yán)重感染者，小腸絨毛表面可出現(xiàn)凹陷、萎縮，變短變粗，或融合、移位和脫落；可導(dǎo)致消化吸收障礙和腹瀉。
免疫功能正常者感染本蟲后，常表自限性腹瀉，糞便呈水樣，量大，可有腹部痙攣性疼痛，惡心、厭食、發(fā)熱和全身不適等癥狀。免疫功能異常的病人，疾病的發(fā)作多為漸進(jìn)性，但腹瀉的程度往往更為嚴(yán)重，糞便量可達(dá)5-10L。如果患者的免疫缺陷狀況得不到糾正，感染便不能夠清除。腹瀉可長期甚或終生持續(xù)下去。繼而導(dǎo)致營養(yǎng)吸收障礙，甚至出現(xiàn)腸道外組織器官，如肺臟和膽道系統(tǒng)感染。隱孢子蟲是艾滋病人合并腸道感染的常見病原體，感染后常常危及患者的生命。
目前，對(duì)于本病的治療尚無理想的有效藥物。文獻(xiàn)報(bào)道大蒜素、巴龍霉素治療，有一定療效。
2-甲基丁酸乙酯(化學(xué)名為：甲基-2-丁酸乙酯，二氫草莓酸乙酯；該化合物的分子式是C7H14O2，分子量130.19，CAS登錄號(hào)：7452-79-1，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示。
2-甲基丁酸乙酯是具有水果香氣(類似蘋果皮，菠蘿皮和未成熟的梅子皮香氣)的一種按照GB 2760-96規(guī)定為允許使用的食用香料，主要用以配制蘋果、草莓、葡萄、覆盆子、芒果等熱帶水果型香精，在最終加香食品中濃度約為0.5～5mg/kg，為美國香味料和萃取物制造者協(xié)會(huì)(FEMA)GRAS認(rèn)證目錄中化合物(一般公認(rèn)的安全類添加劑)。
目前為止尚未有2-甲基丁酸乙酯具有抗微小隱孢子蟲作用的報(bào)導(dǎo)，通過2-甲基丁酸乙酯已知的性質(zhì)無法推斷其是否具有抗微小隱孢子蟲的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供2-甲基丁酸乙酯在制備抗微小隱孢子蟲藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了2-甲基丁酸乙酯具有抑制抗微小隱孢子蟲的作用，可以利用2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯的立體異構(gòu)體、2-甲基丁酸乙酯的水合物、2-甲基丁酸乙酯的藥學(xué)上可接受的鹽等來制備治療和/或預(yù)防和/或輔助治療微小隱孢子蟲作用的增殖性疾病。由于2-甲基丁酸乙酯是食品級(jí)香精的組成成分，為美國香味料和萃取物制造者協(xié)會(huì)(FEMA)GRAS認(rèn)證目錄中化合物(一般公認(rèn)的安全類添加劑)，對(duì)人和動(dòng)物體無毒副作用，安全環(huán)保。
本發(fā)明通過將2-甲基丁酸乙酯與可接受的輔料，制成散劑，添加至飼料中，混勻，按日常飼料量喂食小白鼠，2-甲基丁酸乙酯的添加量為每100kg飼料中添加5g 2-甲基丁酸乙酯；或?qū)?-甲基丁酸乙酯制成2-甲基丁酸乙酯水溶性粉劑，溶于水中，按日常飲水量喂食小白鼠，2-甲基丁酸乙酯的添加量為每100kg水中溶于2.5g 2-甲基丁酸乙酯。通過動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)添加2-甲基丁酸乙酯可使抗微小隱孢子蟲排卵囊量降低89％以上，具有較好的抗隱孢子蟲作用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本說明作進(jìn)一步的說明，但并不局限如此。
實(shí)施例1
2-甲基丁酸乙酯散劑的制備：取5g 2-甲基丁酸乙酯(含量不低于99％)和95g淀粉混勻，即可。
散劑的用法用量：將上述100g散劑拌100kg飼料的比例添加，按日常食量喂食。
實(shí)施例2
2-甲基丁酸乙酯水溶性粉劑的制備：由于2-甲基丁酸乙酯不溶于水，利用藥用輔料2羥丙基-β-環(huán)糊精制備可溶性粉。取2.5g 2-甲基丁酸乙酯(含量不低于99％)，按照1:2摩爾比稱取2羥丙基-β-環(huán)糊精50g，加入200ml無水乙醇，攪拌6小時(shí)，減壓蒸發(fā)至干，即可。
水溶性粉劑的用法用量：將上述52.5g粉劑溶于100升水的比例添加，按正常飲水量喂食。
下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)說明2-甲基丁酸乙酯的抗微小隱孢子蟲中的效果。
實(shí)驗(yàn)材料：
對(duì)照藥物：文獻(xiàn)報(bào)道的具有抗微小隱孢子蟲效果的巴龍霉素(98％，上海撫生生物技術(shù)有限公司，批號(hào)001010)，使用量為5mg/kg體重。
2-甲基丁酸乙酯組：實(shí)施例1的2-甲基丁酸乙酯散劑，實(shí)施例2的2-甲基丁酸乙酯水溶性粉劑。
微小隱孢子蟲卵囊：微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)廣東株卵囊，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所保存，使用前在SPF級(jí)昆明鼠體內(nèi)復(fù)壯。
小鼠：SPF級(jí)昆明鼠，6周齡，雄性；由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物舍內(nèi)；自由采食和飲用純凈水；試驗(yàn)前觀察小鼠有無隱孢子蟲病臨床癥狀及連續(xù)2d檢查糞便有無隱孢子蟲卵囊，備用。
飼料：由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
實(shí)驗(yàn)方法：
分組：按試驗(yàn)分組及處理將50只SPF級(jí)昆明鼠，隨機(jī)分成5組，每組10只，并適當(dāng)調(diào)整使每組小鼠總體重大致相等。
處理：除第I(空白對(duì)照)組外，其余各組小鼠均經(jīng)口灌服微小隱孢子蟲卵囊l×105個(gè)/只；除第I組和第Ⅱ(陽性對(duì)照)組外，其余各組小鼠均于感染后立即飼喂或飲用含抗隱孢子蟲藥物的飼料或水，其中，第Ⅲ組飼喂含巴龍霉素的飼料，第Ⅳ組飼喂實(shí)施例1的2-甲基丁酸乙酯散劑與飼料制成的2-甲基丁酸乙酯拌料，第Ⅴ組飲用實(shí)施例2的2-甲基丁酸乙酯水溶性粉劑與飲水制成的2-甲基丁酸乙酯飲水，各組飲水和飼料的用量均相同。試驗(yàn)小鼠的分組情況見表1。
表1試驗(yàn)小鼠分組
每天觀察并記錄小鼠的精神狀況、糞便情況等；對(duì)死亡小鼠稱重，剖檢。
藥效判定方法主要依據(jù)感染后卵囊減少率；如下進(jìn)行：感染后第3天開始每日收集糞便，連續(xù)監(jiān)測(cè)15天。每日取糞便淘洗，260目篩過濾，濾液經(jīng)3000r/min離心10min，棄上清加15mL飽和蔗糖溶液，搖勻，1200/min離心10min；離心后立即小心沾取上層清夜20uL于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，顯微鏡(10×40倍)觀察卵囊并計(jì)數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
臨床癥狀觀察：
接種微小隱孢子蟲卵囊的對(duì)照組第3天，小鼠出現(xiàn)精神沉郁，被毛粗亂，第4天起腹瀉癥狀明顯，期間未見小鼠死亡。
分別計(jì)算各組的平均每只小鼠排卵囊數(shù)及卵囊減少率，結(jié)果見表2所示。
表2各組抗隱孢子蟲效果
由表2可知，第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組的平均每只小鼠排卵囊數(shù)均低于第Ⅱ組，第Ⅳ、Ⅴ組的平均每只小鼠排卵囊數(shù)明顯低于第Ⅲ組，故實(shí)驗(yàn)證實(shí)2-甲基丁酸乙酯可使微小隱孢子蟲感染后的卵囊數(shù)減少86％以上，飲水組效果好于飼料添加組，具有較好的抗微小隱孢子蟲作用，且明顯優(yōu)于巴龍霉素。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。