本發(fā)明涉及化合物(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚的應(yīng)用和藥物組合物。

背景技術(shù)：

丙肝也稱(chēng)為丙型肝炎，由丙型肝炎病毒(HCV)感染導(dǎo)致，呈全球性流行趨勢(shì)，約有1.8億人感染丙肝病毒，每年約有35萬(wàn)人死于HCV感染相關(guān)的疾病，據(jù)保守估計(jì)中國(guó)目前約有4000萬(wàn)人感染丙肝病毒。丙型肝炎可導(dǎo)致慢性肝壞死和肝組織纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。

HCV屬于黃病毒科，其基因組為9.6kb單股正鏈RNA，編碼一條含3000個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白，分別為核心蛋白C、囊膜糖蛋白E1、E2、膜整合蛋白p7以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。

HCV NS3絲氨酸蛋白酶屬于胰蛋白酶超家族，編碼631個(gè)氨基酸，從N端到C端分別為絲氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酸酶和RNA解旋酶。它是HCV非結(jié)構(gòu)蛋白加工和成熟過(guò)程的關(guān)鍵酶。NS4A作為輔助因子，與NS3絲氨酸蛋白酶形成非共價(jià)二聚體(NS3/4A)發(fā)揮作用。HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶是丙肝病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶，對(duì)病毒完成其生命周期具有不可替代的作用，它承擔(dān)了裂解產(chǎn)生NS4A/B，NS5A/B的功能，并能拮抗宿主體內(nèi)免疫信號(hào)分子介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)抗病毒反應(yīng)，從而抑制干擾素的產(chǎn)生。而目前已上市的NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制藥物(如奧司他韋、特拉匹韋、波西普韋)一方面具有副作用，如特拉匹韋具有疲勞、貧血、惡心、頭痛、味覺(jué)障礙等副作用，波西普韋具有皮疹、貧血、惡心、痔瘡等副作用；另一方面易出現(xiàn)耐藥性，出現(xiàn)耐藥后該藥療效顯著下降。因此開(kāi)發(fā)毒副作用小、價(jià)格低廉的新型HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制藥物十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于目前開(kāi)發(fā)毒副作用小、價(jià)格低廉的新型HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制藥物十分必要，因而提供了一類(lèi)靶向HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶的新型抑制劑——(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚，并為抗丙肝病毒新藥的研發(fā)提供了先導(dǎo)化合物。

本發(fā)明采用下述技術(shù)方案來(lái)解決上述技術(shù)問(wèn)題：

本發(fā)明提供一種如式I所示化合物，或其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、光學(xué)異構(gòu)體或多晶型物在制備N(xiāo)S3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用；其中，R為羥基或甲氧基；

其中，當(dāng)R為甲氧基時(shí)，如式I所示化合物為(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚，即為如式II所示的化合物。

其中，當(dāng)R為羥基時(shí)，如式I所示化合物為(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚，即為如式III所示的化合物。

其中，如式I所示化合物還可以作為先導(dǎo)化合物，在制備N(xiāo)S3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑中應(yīng)用。

本發(fā)明還提供如式I所示化合物，或其藥學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、光 學(xué)異構(gòu)體或多晶型物在制備抗丙肝病毒藥物中的應(yīng)用；其中，R為羥基或甲氧基。

本發(fā)明中，所述的抗丙肝病毒藥物為以NS3/4A絲氨酸蛋白酶為靶標(biāo)的抗丙肝病毒藥物。

其中，如式I所示化合物還可以作為先導(dǎo)化合物，在制備抗丙肝病毒藥物中應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包括如式I所示化合物和藥學(xué)可接受的載體；其中，R為羥基或甲氧基。

本發(fā)明中，所述的藥學(xué)可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，較佳的包括：稀釋劑、潤(rùn)滑劑、賦形劑、粘合劑、填充劑和崩裂劑中的一種或多種。

本發(fā)明中，根據(jù)治療目的，可將藥物組合物制成各種類(lèi)型的給藥單位劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體、乳液、懸浮液、顆粒劑、膠囊、栓劑和針劑(溶液和懸浮液)等。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明所述的(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物II)和(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚(化合物III)首次被發(fā)現(xiàn)具有HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制活性，且活力較強(qiáng)，對(duì)于新型HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑類(lèi)抗丙肝藥物的設(shè)計(jì)和研發(fā)具有一定指導(dǎo)意義，甚至可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行研究。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。

實(shí)施例中所述的底物P06221是一條多肽(Ac-Asp-Glu-Glu-Glu-Glu-Alg-Ala-Ser-Lys)，并用熒光劑EDANS和猝滅劑DABCUL標(biāo)記(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)

1)化合物獲得

分離自香榧樹(shù)枝葉的4種化合物：香榧酯、異海松酸、(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物II)、(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物IV)。

經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚具有顯著的HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制活性；而(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚、香榧酯、異海松酸均不具有HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制活性。

我們以(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚作為母體，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚(化合物III)，同樣通過(guò)HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑篩選模型的測(cè)定，其抑制活性為128μM。

具體技術(shù)細(xì)節(jié)如下：

1)從香榧樹(shù)枝葉的乙醇浸提物中分離得到了四種化合物香榧酯、異海松酸、(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚。

香榧枝葉(10kg)用80％乙醇浸泡10天，期間不時(shí)攪拌，過(guò)濾枝葉后即得乙醇浸提液。乙醇浸液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)干燥后獲得乙醇浸提物(1000g)，之后用4L水溶解，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，每種溶劑各萃取5次，并將萃取液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥得到石油醚(200g)、乙酸乙酯(250 g)萃取物。用甲醇溶解石油醚、乙酸乙酯萃取物備用。

香榧酯和異海松酸分離：

①以反相硅膠柱層析法對(duì)石油醚萃取物進(jìn)行初步分離純化，洗脫流動(dòng)相為水-甲醇混合液，洗脫梯度為水、60％、80％、85％、90％、100％的甲醇水溶液，檢測(cè)光波長(zhǎng)為210nm。收集80％、85％洗脫液并減壓蒸發(fā)干燥即得分離物1和分離物2。硅膠柱填料為ODS-C18，品牌YMC，柱體積為80g，每次進(jìn)樣10mL，洗脫流速15mL/min。

②采用正相硅膠柱層析對(duì)分離物1進(jìn)行分離純化，洗脫流動(dòng)相為石油醚-丙酮混合液，洗脫濃度為100:1(石油醚：丙酮)，收集洗脫液，令其自然揮發(fā)，在容器底部會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶，該結(jié)晶即為香榧酯。硅膠柱填料為C18，品牌YMC，柱體積為40g，洗脫流速15mL/min。

③采用正相硅膠柱層析對(duì)分離物2進(jìn)行分離純化，洗脫流動(dòng)相為石油醚-丙酮混合液，洗脫梯度為：100％、99％、98％、96％、92％、84％的丙酮石油醚溶液，收集98％洗脫液經(jīng)減壓蒸發(fā)干燥獲得組分2-2。將組分2-2用甲醇溶解，使用反相柱層析進(jìn)一步分離，流動(dòng)相為80％甲醇水溶液，收集洗脫液，經(jīng)減壓蒸發(fā)干燥即得異海松酸。硅膠柱填料為C18，品牌YMC，柱體積為40g，洗脫流速15mL/min。

(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚和(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚分離：

以反相硅膠柱層析法對(duì)石油醚萃取物進(jìn)行初步分離純化，洗脫流動(dòng)相為水-甲醇混合液，洗脫梯度為水、20％、40％、60％、80％、100％的甲醇水溶液，檢測(cè)波光長(zhǎng)為210nm和254nm。收集60％洗脫液并減壓蒸發(fā)干燥即得分離物3，將分離物3溶于甲醇備用。硅膠柱填料為ODS-C18，品牌YMC，柱體積為80g，每次進(jìn)樣10mL，洗脫流速15mL/min。

使用正相硅膠柱層析對(duì)分離物3進(jìn)行分離純化，流動(dòng)相為石油醚-乙酸乙酯混合液，洗脫梯度為5％、15％、25％、35％的乙酸乙酯石油醚溶液。分別收集15％和35％洗脫液，經(jīng)減壓蒸發(fā)干燥即得(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2- 甲氧基苯酚和(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚。硅膠柱填料為C18，品牌YMC，柱體積為40g，洗脫流速15mL/min。其中，(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚為略帶黃色的透明油狀液體，具有濃郁的香味，易溶于甲醇、乙醇、氯仿，微溶于水，其核磁共振氫譜數(shù)據(jù)為：¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ6.98(d,J＝1.8Hz,1H),6.83(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),6.73(d,J＝8.1Hz,1H),6.49(d,J＝15.8Hz,1H),6.18(dt,J＝15.8,5.9Hz,1H),4.18(dd,J＝5.9,1.4Hz,2H),3.84(s,3H).(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)為：¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ7.01(d,J＝1.9Hz,1H),6.85(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),6.74(d,J＝8.1Hz,1H),6.53(d,J＝15.9Hz,1H),6.13(dt,J＝15.8,6.3Hz,1H),4.06(dd,J＝6.3,1.3Hz,2H),3.86(s,3H),3.36(s,3H)。

2)采用HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑篩選模型測(cè)定上述的四種化合物以及(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚對(duì)HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶的抑制活性

化合物(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚市售可得，具體來(lái)源為香港先進(jìn)技術(shù)工業(yè)有限公司深圳分公司，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可通過(guò)對(duì)(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚進(jìn)行常規(guī)的脫甲基化反應(yīng)制得此化合物。

其中，HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶的抑制活性測(cè)定具體步驟為：

取2mg待測(cè)化合物分別溶于100μL甲醇中制成濃度為20mg/mL的母液。將母液倍比稀釋?zhuān)@得濃度為10、5、2.5、1.25mg/mL的甲醇溶液。取2μL各濃度待測(cè)化合物溶液分別與95μL HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶(蛋白酶濃度為：0.1mg/mL，緩沖液濃度為：25mM Hepes，150mM NaCl，10％丙三醇，10mM DTT)、3μL底物P06221(濃度為：5μM)一同加入到96孔板內(nèi)，檢測(cè)反應(yīng)體系的初始熒光值(a)，以緩沖液作為陰性對(duì)照，以特拉匹韋作為陽(yáng)性對(duì)照。37℃溫育2小時(shí)后，以相同條件再次檢測(cè)反應(yīng)體系的終點(diǎn)熒光值(b)。終點(diǎn)熒光值減初始熒光值即得反應(yīng)體系熒光值的變化量，以陰性對(duì)照的變化量(c)為基準(zhǔn)(抑制率為0)計(jì)算(計(jì)算公式為：I＝(c-c_n) /c，其中I為抑制率，c＝b-a，c_n為熒光值變化量)各待測(cè)化合物對(duì)HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶的抑制活性，以陽(yáng)性對(duì)照(特拉匹韋，分子量為679.8)作為抑制活性參考。根據(jù)抑制劑的濃度和抑制率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算抑制劑的IC₅₀。抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1：HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶的抑制活性表

最終測(cè)得化合物(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚對(duì)HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶的IC₅₀為330μM；化合物(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚對(duì)HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶的IC₅₀為128μM；特拉匹韋的IC₅₀為10μM；而香榧酯、異海松酸和化合物(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚對(duì)HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶均無(wú)抑制活性。

以上結(jié)果顯示：(E)-4-(3-甲氧基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物IV)作為(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物II)的甲氧基化衍生物，其活性明顯變?nèi)?；而?dāng)(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚(化合物II)苯環(huán)上的甲氧基以羥基替換，衍生物得到的(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)鄰苯二酚(化合物III)則對(duì)NS3/4A絲氨酸蛋白酶的抑制活性顯著提高，達(dá)到128μM。我們可以從中得到構(gòu)效關(guān)系的啟示：化合物(E)-4-(3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚中苯環(huán)和丙烯基上的羥基對(duì)于發(fā)揮NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制活性具有重要作用。

其中，HCV NS3/4A絲氨酸蛋白酶的制備方法參考專(zhuān)利申請(qǐng)文件記載內(nèi)容(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?01510098364.2)，具體為：

1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-NS3

1)從NCBI網(wǎng)站獲得所有報(bào)道的丙型肝炎1b亞型的全基因序列共計(jì)164 條，利用http://www.drive5.com/uclust軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，選擇相似度達(dá)到90％以上的、最具有代表性的序列作為研究對(duì)象，即序列HCV-1b/US/BID-V130/1994(GenBank：EU155330.2)。選取其中的編碼NS3/4A的全部序列，該序列的核酸全長(zhǎng)為2055bp，編碼685個(gè)氨基酸。為了增加NS3/4A蛋白酶的體外活性及穩(wěn)定性，對(duì)基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。對(duì)優(yōu)化后的基因采用化學(xué)合成的方法進(jìn)行全基因合成(由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，把合成的全長(zhǎng)基因連接到載體pGH(購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司)上，獲得克隆載體pGH-NS3，測(cè)序驗(yàn)證序列完全正確(由上海捷瑞生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證)。

2)設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增NS3/4A蛋白酶基因的引物，上游引物S3-up的序列為5’-AAACATATGGCGCCTATCACGGCTTACTC-3’，下游引物S4A-down的序列為5’-AAAGGATCCTTATTACTTCTTCTTTCC-3’。

3)以含有密碼子優(yōu)化的NS3/4A蛋白酶序列的克隆載體pGH-NS3為模板，利用引物S3-up和S4A-down在LA(TaKaRa)的催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得2.1Kb的NS3/4A蛋白酶序列。擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，共30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5min。

4)用BamH I和Nde I分別對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列和大腸桿菌表達(dá)載體pET28a(購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，利用T4連接酶(購(gòu)自TaKaRa)于4℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，利用含有30μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h。

5)挑取抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落接種5mL含有30μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm 37℃下過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行BamHI和NdeI雙酶切鑒定，得到含有NS3/4A蛋白酶基因的核苷酸序列的重組質(zhì)粒pET28a-NS3。對(duì)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2、構(gòu)建重組菌株、誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化。

1)將重組質(zhì)粒pET28a-NS3轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，涂布含有30μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12h。挑取抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落接種于5mL含有30μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm 37℃下過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行Bam HI和NdeI雙酶切鑒定，即獲得重組菌株。保存驗(yàn)證正確的菌株。

2)接50μL步驟1)所述驗(yàn)證正確的單菌落于5mL LB中，200rpm 37℃下震蕩過(guò)夜，得過(guò)夜培養(yǎng)物。接500μL過(guò)夜培養(yǎng)物于50mL LB中，200rpm 37℃下震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6時(shí)，添加0.5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，18℃，200rpm下誘導(dǎo)培養(yǎng)22h后收集菌液。

3)將步驟2)獲得的收集菌液4℃7000～8000g離心10min，收集沉淀的菌體。將1g菌體加20mL裂解緩沖液(包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)25mM、NaCl 300mM、咪唑(Imidazole)10mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)，在冰上混合，渦旋震蕩混勻。將細(xì)胞懸浮起來(lái)，加入溶菌酶(0.3mg/mL)，混勻，冰上靜置30min。加入10％TritonX-100，使Triton的終濃度為0.05％，所述的百分比為體積百分比，充分混勻，超聲破碎細(xì)胞，4℃8000g離心30min，取上清。在上清中加入1mL Resin(上海生工)4℃震蕩過(guò)夜，充分結(jié)合，過(guò)親和層析柱空柱，依次用15mL緩沖液(包括Hepes25mM、NaCl 300mM、Imidazole 10mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)、15mL沖洗緩沖液(包括Hepes 25mM、NaCl 300mM、Imidazole 20mM、EDTA 1mM、甘油10％和Triton X-100)洗脫，得洗脫液。洗脫液中含有目的蛋白NS3/4A蛋白酶，將目的蛋白進(jìn)行透析，用1L的透析液(包括Hepes25mM、NaCl 150mM、甘油10％、Triton X-100 0.1％和二硫蘇糖醇(DTT)10mM，PH7.5)4℃透析過(guò)夜后得純化的目的蛋白，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)純化的目的蛋白的大小及純度。后在純化的目的蛋白中加入10mM的DTT，分裝，-70℃保存。