本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種提高氟苯尼考抗菌藥效的小分子物質(zhì)。

背景技術：

嗜水氣單胞菌在河流、湖泊、池塘、食物、動物及人體等自然環(huán)境中廣泛存在。嗜水氣單胞菌屬于條件性致病菌，可引起多種水生動物和陸生動物患病，是一種典型的人-畜-魚共患病病原菌，當環(huán)境條件惡劣，機體抵抗力下降可導致魚類、兩棲類、爬行類等冷血動物和哺乳動物發(fā)病，引發(fā)水生動物細菌性出血病、體表潰瘍癥以及哺乳動物腹瀉等，是魚類、爬行類和人類的一種致命傳染源。鏈球菌為典型的條件致病菌，平常生存于養(yǎng)殖水體及底泥中。在富營養(yǎng)化或養(yǎng)殖自身污染較為嚴重的水域中，此菌能長期生存，當養(yǎng)殖魚體抵抗力降低時，易引起疾病。該病的發(fā)生與養(yǎng)殖密度大、換水率低、餌料鮮度差及投餌量大密切相關。鏈球菌不僅能影響海水養(yǎng)殖魚類，同時影響半咸水及淡水養(yǎng)殖鰻鱺、香魚、虹鱒斑點叉尾鮰和羅非魚等，其具有感染宿主廣、傳染性強和死亡率高等特點，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。為了預防和治療病原菌引起的疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治中多采用抗生素的治療方法，而長期大量使用或濫用抗生素導致養(yǎng)殖環(huán)境中細菌多重耐藥、交叉耐藥現(xiàn)象嚴重，這些耐藥菌的出現(xiàn)給水產(chǎn)動物疾病防治帶來極大的困難，也帶來了更大的生態(tài)風險。因此，針對水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中各種病原微生物的爆發(fā)，采用新的策略和方法控制水產(chǎn)動物病原菌的感染十分重要。面對這一形勢，開發(fā)一種新的藥物防治策略，以提高防治效果、降低嗜水氣單胞菌耐藥性和避免抗菌藥物的殘留問題，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展具有極大的應用前景。

氟苯尼考（florfenicol）為甲砜霉素的單氟衍生物，又稱氟甲砜霉素，是一種新型廣譜高效抗菌藥物，自20世紀90年代初開始應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。該藥抗菌譜類似于氯霉素，通過抑制肽?；D(zhuǎn)移酶活性而產(chǎn)生廣譜抑菌作用，抗菌譜廣，包括各種革蘭氏陽性、陰性菌和支原體等。氟苯尼考以其廣譜、高效、吸收迅速、分布廣泛、安全和動物專用等特點，在國內(nèi)外畜牧和水產(chǎn)上迅速獲得廣泛應用。

歐盟和美國應用CUAPM-Ⅱ及LC-MS確檢，對氯霉素類藥物（包括氟苯尼考及氟苯尼考胺）的多殘留檢測限可低至0.1ng/g。因此，在具有相同殺菌效果的情況下，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中提高氟苯尼考的抗菌活性，大幅減少藥物使用量，降低藥物殘留，對水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品安全和生態(tài)環(huán)境保護具有十分重要的意義。

半胱氨酸（Cys）是一種半必需氨基酸，是構(gòu)成體內(nèi)重要抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽（GSH）的主要成分，對機體抗氧化和自由基消除功能十分重要。組織中Cys的濃度通過調(diào)節(jié)Cys生成和有效移除巰基維持在較低水平。Cys在機體中免疫和抗氧化功能的作用主要是通過GSH實現(xiàn)的。Cys是GSH的前體物質(zhì)，它的合成受日糧Cys攝入量的影響，所以充足的日糧Cys供應對免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成十分重要。總的來說，半胱氨酸參與魚體免疫和抗氧化功能，但半胱氨酸作為抗菌藥物增效劑的研究尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種提高氟苯尼考抗菌藥效的小分子物質(zhì)，半胱氨酸與氟苯尼考聯(lián)合使用能夠大幅度增強氟苯尼考的殺菌效果，提高魚體感染細菌后的存活率，為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中氟苯尼考的使用提供了一種新方法，半胱氨酸與氟苯尼考的聯(lián)合使用能夠大幅度降低抗生素的使用量，同時提高魚體對細菌感染的防治水平。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的采用如下技術方案：

一種提高氟苯尼考抗菌藥效的小分子物質(zhì)，其特征在于：該小分子物質(zhì)為半胱氨酸，通過半胱氨酸與氟苯尼考的聯(lián)合使用以增強水產(chǎn)養(yǎng)殖抗菌藥物氟苯尼考的藥效，進而減少氟苯尼考的用藥量。

進一步優(yōu)選，所述的半胱氨酸與氟苯尼考的重量比為0.076-24.23:1。

進一步優(yōu)選，所述的半胱氨酸作為增效劑用于增加氟苯尼考在體外殺滅細菌的能力。

進一步優(yōu)選，所述的半胱氨酸作為增效劑用于增加氟苯尼考在體內(nèi)清除細菌的能力。

進一步優(yōu)選，所述的半胱氨酸作為增效劑用于與氟苯尼考聯(lián)合使用以提高魚體感染細菌的存活率。

進一步優(yōu)選，所述的細菌為嗜水氣單胞菌或無乳鏈球菌。

本發(fā)明經(jīng)體外、體內(nèi)實驗證實，半胱氨酸能夠增強氟苯尼考的殺菌效果；其聯(lián)合運用能提高魚體嗜水氣單胞菌感染的治療效果，大幅增加魚體存活率。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病原菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴重的情況下，大幅度降低抗菌藥物氟苯尼考的使用量，同時提高抗菌藥物氟苯尼考的防治效果，有助于無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖技術的推廣。

附圖說明

圖1是半胱氨酸添加前后不同濃度氟苯尼考作用后的細菌存活率圖；

圖2是不同劑量半胱氨酸聯(lián)合氟苯尼考作用后的細菌存活率圖；

圖3是半胱氨酸協(xié)同氟苯尼考殺菌作用的時間依賴關系圖；

圖4是半胱氨酸聯(lián)合氟苯尼考作用后淇河鯽肝臟、脾和腎臟中嗜水氣單胞菌的含量圖；

圖5是半胱氨酸聯(lián)合氟苯尼考作用后淇河鯽肝臟、脾和腎臟中無乳鏈球菌的含量圖；

圖6是細菌攻毒后注射半胱氨酸或/和氟苯尼考對魚體的保護作用對比圖；

圖7是細菌攻毒后口服半胱氨酸或/和氟苯尼考對魚體的保護作用對比圖。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例1

半胱氨酸增加氟苯尼考在體外殺滅細菌的能力

1、細菌培養(yǎng)與生存率體外實驗方法

（1）挑取嗜水氣單胞菌或無乳鏈球菌單菌落接種于100mL LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；

（2）取適量的菌液于12000rpm、5min離心收集菌體，用質(zhì)量濃度為0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次，懸浮于含10mM 乙酸鈉的M9培養(yǎng)基中，調(diào)OD600值至0.6；

（3）加入相應的代謝物和適量的抗生素于試管中，加M9培養(yǎng)基至5mL體系，28℃培養(yǎng)6h；

（4）在特定的時間點，取100uL樣品，采用系列稀釋法，取10uL進行點板計數(shù)，計算細菌cfu/mL（菌落形成單位/毫升）。不經(jīng)過抗生素和代謝物處理的樣品作為起始細菌數(shù)，細菌菌落數(shù)在20-200的數(shù)據(jù)可用于統(tǒng)計分析。細菌存活率（percent survival）是抗生素和代謝物處理后的細菌cfu與起始細菌cfu的百分比。

2、半胱氨酸在提高氟苯尼考殺菌效果方面具有抗生素濃度依賴效應

將制備好的5mL細菌樣品，分成加或不加終濃度為4mM半胱氨酸2組，這2組分別加入不同濃度的氟苯尼考，加入終濃度分別為20、40、80、120、160、200μg/mL。然后于28℃恒溫培養(yǎng)6h，用平板檢測其活菌數(shù)，然后計算不同抗生素濃度下的生存率。計算公式為：生存率（%）=（加入抗生素后活菌數(shù)/不加抗生素活菌數(shù)）×100%。

圖1結(jié)果表明，在不加半胱氨酸的情況下，即使使用最高濃度的氟苯尼考也只能殺死少量嗜水氣單胞菌，而加入半胱氨酸后，最低濃度的氟苯尼考即可明顯殺死這些嗜水氣單胞菌，并且隨著加入抗生素量的增多，其活菌數(shù)越少，即對抗生素敏感性越高。此結(jié)果表明半胱氨酸可提高嗜水氣單胞菌對氟苯尼考的敏感性，而且敏感性與抗生素濃度相關：抗生素濃度越高，嗜水氣單胞菌敏感性越高。對于嗜水氣單胞菌，在40μg/mL氟苯尼考時可提高約1.8倍，在80μg/mL氟苯尼考時可提高約2倍。

3、半胱氨酸在提高氟苯尼考殺菌效果方面具有物質(zhì)劑量依賴效應

在制備好的3mL菌液中加入終濃度分別為40μg/mL或80μg/mL（嗜水氣單胞菌）氟苯尼考的同時，不加或加入不同濃度的半胱氨酸，使半胱氨酸的終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4mM，于28℃恒溫培養(yǎng)6h，用平板檢測其活菌數(shù)，計算不同代謝物濃度下的生存率。

由圖2可知，即使加入最低濃度的半胱氨酸，與對照只加入抗生素相比，嗜水氣單胞菌存活細菌數(shù)明顯減少，且隨著加入物質(zhì)濃度提高，其活菌數(shù)越少。這些結(jié)果說明不同濃度的半胱氨酸都可以提高嗜水氣單胞菌對氟苯尼考敏感性。對于嗜水氣單胞菌，在40μg/mL氟苯尼考時可提高約3倍，在80μg/mL氟苯尼考時可提高約5倍。

4、半胱氨酸在提高氟苯尼考殺菌效果方面具有作用時間依賴效應

進一步研究了半胱氨酸協(xié)同氟苯尼考殺菌作用與時間的關系。用時間梯度試驗進行研究，設置時梯度為2-10h，4mM半胱氨酸分別與40μg/mL和80μg/mL氟苯尼考協(xié)同殺菌，每隔2h取樣并點板計數(shù)。

結(jié)果見圖3，與對照只加入抗生素相比，加入半胱氨酸2h后，細菌存活數(shù)開始減少，且隨著時間延長活菌數(shù)越低。在6h分別提高氟苯尼考殺菌作用為1.9倍和3.2倍，在10h可達2.7倍和7倍，說明即使在較低的抗生素作用下，半胱氨酸聯(lián)合氟苯尼考即可取得較好的殺菌作用。同時，從圖中也可以看出，隨著兩種物質(zhì)作用時間的延長，其協(xié)同作用越來越明顯。

實施例2

半胱氨酸增加氟苯尼考在體內(nèi)清除細菌的能力

1、魚體感染與細菌清除實驗：嗜水氣單胞菌Ah-479為高毒力菌株，淇河鯽腹腔注射100μL 1.0×10⁷CFU/mL的細菌懸液，24h后，隨機分為4組，每組10尾，分別為：生理鹽水對照組、代謝物組、抗生素組和相應濃度的抗生素與代謝物組。半胱氨酸的劑量為50mg/kg，氟苯尼考的使用劑量為40mg/kg。治療24h后，取魚體肝臟、腎臟、脾等組織并稱重，加入1mL生理鹽水充分研磨勻漿，進行梯度稀釋并平板計數(shù)檢測組織中的細菌含量（CFU/g）。

2、半胱氨酸聯(lián)合氟苯尼考能顯著清除魚體組織中的嗜水氣單胞菌

嗜水氣單胞菌感染后，肝臟組織中的細菌量為1.05×10⁸cfu/g，半胱氨酸組中細菌量為9×10⁶cfu/g，表明半胱氨酸清除細菌的效率提高了約11倍；氟苯尼考組中的細菌量為7×10⁷cfu/g，表明氟苯尼考單獨清除效果不如半胱氨酸；半胱氨酸＋氟苯尼考組中細菌量為4×10⁶cfu/g，組織內(nèi)的細菌量極大減少，較對照組減少了16倍。

同樣，在脾和腎臟中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。在脾中，半胱氨酸＋氟苯尼考組中細菌量為2.5×10⁷cfu/g，組織內(nèi)的細菌量極大減少，較對照組減少了約10倍；在腎臟中，半胱氨酸＋氟苯尼考組中細菌量為3×10⁷cfu/g，組織內(nèi)的細菌量較對照組減少了約4倍，表明半胱氨酸與氟苯尼考的協(xié)同作用十分顯著。

3、半胱氨酸聯(lián)合氟苯尼考能顯著清除魚體組織中的無乳鏈球菌的體內(nèi)實驗（感染細菌后24h治療）

無乳鏈球菌感染后，肝臟組織中的細菌量為6×10⁹cfu/g，半胱氨酸組中細菌量為5×10⁸cfu/g，表明半胱氨酸清除細菌的效率提高了約11倍；氟苯尼考組中的細菌量為9×10⁸cfu/g，表明氟苯尼考單獨清除效果不如半胱氨酸；半胱氨酸＋氟苯尼考組中細菌量為7×10⁷cfu/g，組織內(nèi)的細菌量極大減少，較對照組減少了19倍。

同樣，在脾和腎臟中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。在脾中，半胱氨酸＋氟苯尼考組中細菌量為6×10⁸cfu/g，組織內(nèi)的細菌量極大減少，較對照組減少了約14倍；在腎臟中，半胱氨酸＋氟苯尼考組中細菌量為2×10⁸cfu/g，組織內(nèi)的細菌量較對照組減少了約17倍，表明半胱氨酸與氟苯尼考的協(xié)同作用十分顯著。

實施例3

1、半胱氨酸聯(lián)合氟苯尼考提高魚體治療效果

嗜水氣單胞菌為高毒力菌株，選取120尾健康淇河鯽進行攻毒，細菌攻毒1h后，用注射或口服兩種給藥方式進行治療。每種給藥方式分為4個組：對照組注射生理鹽水、半胱氨酸組注射劑量為10mg/kg，氟苯尼考組注射劑量為25mg/kg，半胱氨酸+氟苯尼考組同時注射10mg/kg物質(zhì)和25mg/kg氟苯尼考，所有注射體積均為100μL/尾。藥物保護率=[1-(給藥組死亡率/對照組死亡率)]×100%。

從注射實驗結(jié)果可以看出，當注射劑量為100μL 5.0×10⁷cfu/mL的細菌時，魚體死亡率可達90%；單獨的抗生素治療效果并不明顯，魚體的累積死亡率仍達60%；單獨注射半胱氨酸的保護作用明顯，魚體的累積死亡率為30%；半胱氨酸+氟苯尼考聯(lián)合運用時，魚體的累積死亡率為16.7%（圖6）。

口服實驗結(jié)果顯示，對照組72h的累積死亡率90%；單獨的口服抗生素效果并不明顯，72h的累積死亡率63.3%；口服半胱氨酸72h的累積死亡率46.7%；半胱氨酸+氟苯尼考組72h的累積死亡率23.3%，即口服聯(lián)合用藥對魚體的保護率達74.1%（圖7）。

以上結(jié)果表明，不論注射和口服半胱氨酸+氟苯尼考，都能極明顯的保護淇河鯽抵抗嗜水氣單胞菌的感染，即半胱氨酸能作為氟苯尼考增效劑進行魚體疾病預防與治療。

從實驗結(jié)果可以看出，當注射劑量為100μL 5.0×10⁷cfu/mL細菌時，魚體死亡率可達90%。單獨的抗生素治療效果并不明顯，魚體累積死亡率仍達60%，半胱氨酸的保護作用明顯，特別是半胱氨酸+氟苯尼考組死亡率只有為13.3%（見圖6）。

從以上結(jié)果可以看出，氟苯尼考的免疫保護率為33.3%；半胱氨酸的免疫保護率為63.3%，特別是半胱氨酸＋氟苯尼考的免疫保護率為85.2%，表明半胱氨酸聯(lián)合氟苯尼考提高魚體感染病原菌的存活率作用極為顯著。

以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。