莪術(shù)中抗癌活性單體的提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從中藥莪術(shù)塊莖中提取抗癌活性單 體的方法，以及該提取得到的抗癌活性單體在制備抗肝癌、抗肺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥莪術(shù)是姜科姜黃屬植物的根莖，莪術(shù)有行氣破血、消積止痛的功效。現(xiàn)代藥理 學(xué)研究表明莪術(shù)揮發(fā)油有抗腫瘤、抗菌作用；莪術(shù)醇有抑瘤作用、抗早孕作用。另外莪術(shù)對 心血管、胃腸平滑肌、急性腎功能衰竭作用顯著，還具有保肝作用。
[0003]目前對中藥莪術(shù)的的應(yīng)用主要是以其揮發(fā)油注射液和復(fù)方莪術(shù)油用于抗癌作用， 制成抗癌藥物，相對比較局限。另外，莪術(shù)揮發(fā)油成分復(fù)雜，不同成分的抗癌作用也存在很 大差別，缺乏必要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效研究，缺乏合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，難以確保臨床用 藥的有效性、安全性、可持續(xù)性?？梢姡瑢g(shù)的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步提取和研究非常有必 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種莪術(shù)中抗癌活 性單體的提取方法，該方法采用二維高效液相色譜進(jìn)行分離純化，得到具有生物活性新酮 類單體化合物，分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，操作簡單省時，成本低，提取率高。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0006] (1)以莪術(shù)塊莖為原料，磨成粉末狀后用乙酸乙酯浸泡或者回流提取，最終所得 濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得粗提物，粗提物溶于正己烷-乙醇二元混合溶劑中，配成濃度為 50-500mg/mL的提取液；
[0007] (2)對提取液進(jìn)行一維液相色譜分離：采用的色譜柱為正相硅膠色譜柱，采用 的流動相為A相正己烷、B相乙醇的二元流動相，進(jìn)樣量為50-150mL/針，流動相流速為 500-700mL/min，洗脫方式為B相濃度0-50 %梯度洗脫30min，檢測器為紫外檢測器、檢測波 長210nm，根據(jù)紫外吸收光譜收集15. 5-17分鐘洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干， 得到一維液相組分；
[0008] (3)使用正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解至濃度為100mg/ mL ；
[0009] (4)進(jìn)行二維液相色譜分離：采用的色譜柱為Acchrom X-Amide色譜柱，采用的流 動相為A相正己烷、B相乙醇的二元流動相，進(jìn)樣量為l-2mL/針，流動相流速為12-16mL/ min，洗脫方式為B相濃度0-30 %梯度洗脫30min，檢測器為紫外檢測器、檢測波長210nm，根 據(jù)紫外吸收光譜收集17-18分鐘洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到目的產(chǎn)物。 經(jīng)分析型色譜分析，該目的產(chǎn)物純度達(dá)到99%，為單體化合物。
[0010] 經(jīng)核磁共振分析，并經(jīng)系統(tǒng)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)該單體化合物為一未見報(bào)道的新化合 物，化合物母核為吉馬烷型骨架結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步解析其結(jié)構(gòu)，得到分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0011]
[0012] 該化合物分子式為C15H2Q03，分子量為248,屬于酮類單體化合物，我們將其命名為 8-羥基-吉馬-1，7-二烯-5酮-8, 12-內(nèi)酯。
[0013] 作為優(yōu)選，所述步驟（1)、（3)中正己烷-乙醇二元混合溶劑中正己烷體積分?jǐn)?shù)為 70%〇
[0014] 作為優(yōu)選，所述步驟（2)中正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑150mm、長度250mm，其中 填料粒徑為10 μ m，使用時柱溫為室溫。
[0015] 作為優(yōu)選，所述步驟（4)中Acchrom X-Amide色譜柱的尺寸為直徑20mm、長度 250_，其中填料粒徑為10 μ m，使用時柱溫為室溫。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述提取得到的酮類單體化合物8-羥基-吉馬-1，7-二烯-5 酮-8, 12-內(nèi)酯在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。該酮類單體化合物作為有效成分，按常規(guī)方 法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的劑型， 如：片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注射劑、 軟膏劑、栓劑、吸入劑等多種劑型。
[0017] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述提取得到的酮類單體化合物8-羥基-吉馬-1，7-二 烯-5酮-8, 12-內(nèi)酯在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。該酮類單體化合物作為有效成分，按常 規(guī)方法如口服、注射，與藥學(xué)上的可接受載體或賦形劑，制成適合口服、注射等給藥方式的 劑型，如：片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、懸浮液、糖漿、口腔含片、舌下含片、注 射劑、軟膏劑、栓劑、吸入劑等多種劑型。
[0018] 本發(fā)明采用二維液相色譜技術(shù)進(jìn)行從莪術(shù)中分離純化活性成分：
[0019] 首先，在一維分離的條件選擇上：多次試驗(yàn)結(jié)果顯示，正相硅膠色譜柱對所提物質(zhì) 分離效果較好，而通過考察不同流動相組成和不同洗脫方式、流速及進(jìn)樣量后，結(jié)果顯示采 用本發(fā)明乙醇-正己烷0% -50%梯度洗脫分離效果最佳，且重復(fù)性良好，得到的一維液相 組分中目的組分純度高，峰容量較大，與其他峰之間分離良好，非常有利于分離操作和后續(xù) 進(jìn)一步提純；
[0020] 其次，在二維分離的條件選擇上：使用Acchrom X-Amide色譜柱，在洗脫條件選擇 為B相濃度0-30 %梯度洗脫時能將少部分極性接近的雜質(zhì)分離開，得到純度高達(dá)99 %的目 的單體化合物。
[0021] 在液相色譜的溶劑選擇上，一維色譜分離、二維色譜分離以及中間提取物的溶解， 均采用正己烷、乙醇兩種溶劑混合液，可以通過改變乙醇的比例來調(diào)節(jié)有效成分的溶解能 力和流動相的洗脫能力，且整個色譜分離僅使用兩種溶劑，有利于提取溶劑的回收再利用。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)中相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和顯著效果：
[0023] (1)本發(fā)明提供了一種未報(bào)道過的新化合物；
[0024] (2)提取方法工藝簡單，成本低，試劑耗費(fèi)量小，制備量大，穩(wěn)定可控，重復(fù)性好，批 次間一致性高，經(jīng)工藝放大后可以運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)；
[0025] (3)得到的單體化合物純度高，穩(wěn)定性好，且具備良好的生物活性，通過細(xì)胞在線 實(shí)時監(jiān)測的方法觀測其在體外的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)其對肺癌A549細(xì)胞和肝癌Η印-G2細(xì)胞 具有抑制作用，具有抗腫瘤藥物開發(fā)潛力，拓寬了抗腫瘤藥物的原料來源；
[0026] (4)由于產(chǎn)物為高純度且具生物活性的單體化合物，質(zhì)量品質(zhì)和用藥更為可控，能 夠確保臨床用藥的有效性、安全性、可持續(xù)性；
[0027] (5)本發(fā)明首次在中藥莪術(shù)中發(fā)現(xiàn)了未曾報(bào)道過的新化合物，拓展了中藥莪術(shù)的 有效成分種類，拓展了莪術(shù)的研究領(lǐng)域和開發(fā)價值。
【附圖說明】
[0028] 圖1所示的是本發(fā)明實(shí)施例1莪術(shù)中抗癌活性單體提取的一維色譜圖；
[0029] 圖2所示的是本發(fā)明實(shí)施例1莪術(shù)中抗癌活性單體提取的二維色譜圖；
[0030] 圖3所示的是本發(fā)明實(shí)施例1得到的目的組分的分析型高效液相色譜圖；
[0031] 圖4所示的是本發(fā)明實(shí)施例1得到的目的組分的CNMR譜（CDC13, 400MHz)的核磁 共振數(shù)據(jù)圖譜；
[0032] 圖5所示的是本發(fā)明實(shí)施例1得到的目的組分的HNMR譜（CDC13, 400MHz)的核磁 共振數(shù)據(jù)圖譜；
[0033] 圖6所示的是本發(fā)明得到目的成分對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用；
[0034] 圖7所示的是本發(fā)明得到目的成分對肝癌Hep_G2細(xì)胞的抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示 性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語 具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0036] 1.原料、材料：
[0037] 莪術(shù)采摘自河北并經(jīng)過鑒定；人肺癌A549細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院提 供；人肝腫瘤Hep_G2細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院提供。
[0038] 2.試劑：
[0039] 無水乙醇購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；色譜級正己烷購自Honeywell公司； F-12K 培養(yǎng)基購自 Life Technologies Corporation ;MEM 培養(yǎng)基購自 Life Technologies Corporation ;DMS0購自天津康科德科技有限公司。
[0040] 3.儀器設(shè)備：
[0041] 超微粉碎機(jī)購自山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司；臺式冷凍離心機(jī)購自Thermo公 司；30升中藥提取罐購自上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海一恒科學(xué) 儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞容生化儀器廠；色譜柱購自博納艾吉爾有限公司；制備 型高效液相色譜儀購自江蘇漢邦科技有限公司；iCELLigence實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀 購自艾森生物（杭州）有限公司。
[0042] 實(shí)施例1 :
[0043] 以莪術(shù)為原料，磨成粉末狀后稱取4kg，溶于25L 98 %的乙醇溶液，進(jìn)行回流提 取，最終所得濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，然后溶于正己烷體積分?jǐn)?shù)為70 %的正己烷-乙醇二 元混合溶劑中，配制成濃度為100mg/mL的提取液，過0. 45 μ m微孔濾膜，進(jìn)行一維液相色譜 制備。
[0044] 一維液相色譜采用Silica 150X250mm，10 μπι，100 A,流動相采用有機(jī)相的混合， 其中有機(jī)相Α相是正己烷、Β相是乙醇，梯度洗脫方式：Β相濃度0-50%梯度洗脫30分鐘。 采用紫外檢測器210nm選擇吸收波長，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為100mL/針，流動相流速為 600mL/min，收集15. 5-17分鐘（8號峰）的組分，如圖1所示。進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得 一維液相組分。
[0045] -維液相組分使用正己烷體積分?jǐn)?shù)為70 %的正己烷-乙醇二元混合溶劑復(fù)溶，溶 解至濃度為100mg/mL，用于二維液相色譜分離。
[0046] 二維色譜分離采用X_Amide20 X 250_，10 μ m，1.00.美，流動相采用有機(jī)相的混合， 其中有機(jī)相A相是正己烷，B相是乙醇，梯度洗脫方式：B相濃度0-30%梯度洗脫30分鐘， 采用紫外檢測器210nm選擇吸收波長，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為lmL/針，流動相流速為 14mL/min，收集17-18分鐘（3號峰）的組分，如圖2所示。進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干得到白 色晶體狀目的組分，稱重為〇. 724g，計(jì)算產(chǎn)率為0. 0181 %。
[0047] 實(shí)施例2 :
[0048] 將實(shí)施例1得到的目的組分利用分析型色譜柱進(jìn)行純度檢驗(yàn)，如圖3所示，純度達(dá)