本發(fā)明涉及化學(xué)藥物領(lǐng)域，具體地，涉及一種25-羥基膽固醇在抑制黃病毒中的用途。

背景技術(shù)：

寨卡病毒(zikavirus，zikv)，因以蚊媒、無(wú)癥狀攜帶者及性途徑傳播，傳播速度非?？欤o人們的健康帶來(lái)威脅。寨卡病毒最先在1947年從烏干達(dá)的寨卡叢林中一只被感染的恒河猴體內(nèi)分離得到。1952年報(bào)導(dǎo)第一例人感染患者(dick,1952；dick等人,1952)。之前，寨卡病毒感染人僅產(chǎn)生輕微癥狀如關(guān)節(jié)痛、乏力、皮疹和結(jié)膜炎。2015年寨卡病毒出現(xiàn)在巴西伴隨始料未及的先天性畸形大爆發(fā)例如小頭癥、格林巴利綜合征以及腦膜炎(araujo等人,2016；cao-lormeau等人,2016；carteaux等人,2016；musso和gubler,2016)。目前認(rèn)為這些嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)是由孕婦宮內(nèi)感染寨卡病毒從而偶然發(fā)生小頭癥、自然流產(chǎn)以及胎盤(pán)功能不全導(dǎo)致的胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限。最近有報(bào)道發(fā)現(xiàn)寨卡病毒感染小鼠睪丸后能導(dǎo)致雄性不育。因此，寨卡病毒感染對(duì)全球健康系統(tǒng)造成了巨大的挑戰(zhàn)。

不幸的是，目前沒(méi)有批準(zhǔn)的抗寨卡病毒的藥物或疫苗來(lái)保護(hù)寨卡病毒引起的各種疾病。寨卡病毒在一型干擾素受體敲除后的小鼠中能高效的復(fù)制，提示干擾素激活基因(isgs)可以降低感染水平(aliota等人,2016；lazear等人,2016)。之后，研究者發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞控制寨卡病毒感染是通過(guò)干擾素信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，宿主通過(guò)產(chǎn)生大量的isgs可以保護(hù)宿主細(xì)胞不被病毒感染(bayer等人,2016；hamel等人,2015；quicke等人,2016)。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在寨卡病毒生命周期的早期階段，isgs家族中的ifitm1和ifitm3能夠抑制病毒感染。另外ifitm3能抑制寨卡病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(savidis等人,2016)。但是，在天然免疫對(duì)抗寨卡病毒感染過(guò)程中起到關(guān)鍵作用的除ifitm1，ifitm3(interferon-inducedtransmembrane1and3proteins，干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白)外的其它isgs的作用還不明確。

膽固醇-25-羥化酶(cholesterol-25-hydroxylase)能夠催化膽固醇轉(zhuǎn)變成25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol，25hc)，25hc是在人體內(nèi)自然存在的氧化型甾體醇(holmes等人,2011；janowski等人,1999；kandutsch等人,1978)，其在抑制黃病毒方面的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種25hc的新用途，即在抑制黃病毒中的用途。

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，25hc能夠在體內(nèi)和體外有效抑制黃病毒的復(fù)制，因此，第一方面，本發(fā)明提供了25hc在制備用于預(yù)防和/或治療黃病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

第二方面，本發(fā)明提供了25hc在抑制黃病毒中的應(yīng)用。

第三方面，本發(fā)明提供了25hc在制備用于預(yù)防和/或治療寨卡病毒感染引起的小頭癥的藥物中的應(yīng)用。

第四方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有25hc、至少一種有利于抑制黃病毒的輔助藥劑，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。

第五方面，本發(fā)明提供了一種25-羥基膽固醇，該25-羥基膽固醇用于預(yù)防和/或治療黃病毒感染、抑制黃病毒、或預(yù)防和/或治療寨卡病毒感染引起的小頭癥。

通過(guò)使用25hc，本發(fā)明能夠抑制黃病毒，對(duì)宿主起到保護(hù)作用，具體地，25hc能在人細(xì)胞、小鼠和恒河猴模型中抑制黃病毒感染，并能預(yù)防和/或治療寨卡病毒引起的小頭癥。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為25hc在體外能有效的抑制寨卡病毒的復(fù)制，其中，圖1a為25hc的細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果，圖1b為空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的25hc對(duì)寨卡病毒的抑制效果，圖1c為rt-qpcr檢測(cè)結(jié)果，圖1d為免疫熒光檢測(cè)寨卡病毒e蛋白的結(jié)果圖，其中，nitd008為廣譜抗黃病毒的抑制劑；

圖2為25hc對(duì)其它黃病毒的抑制效果圖，其中，圖2a、2b、2c和2d分別為不同濃度的25hc對(duì)寨卡病毒(zikv)、登革病毒(denv)、黃熱病毒(yfv)和西尼羅河病毒(wnv)的抑制效果圖；

圖3為25hc在小鼠體內(nèi)抑制寨卡病毒復(fù)制的結(jié)果圖，其中，圖3a為25hc在balb/c小鼠體內(nèi)對(duì)寨卡病毒的抑制效果結(jié)果圖，圖3b為注射25hc后感染寨卡病毒的a129小鼠的存活情況結(jié)果圖，圖3c-3e分別為注射25hc(連續(xù)給藥7天)后，感染寨卡病毒的a129小鼠在第3天，第7天檢測(cè)病毒血癥結(jié)果圖以及在第7天檢測(cè)小鼠腦中病毒滴度結(jié)果圖；

圖4為25hc在恒河猴中對(duì)寨卡病毒的抑制效果圖，其中，圖4a為實(shí)驗(yàn)過(guò)程的示意圖，圖4b為注射25hc后感染寨卡病毒的恒河猴血中病毒的滴度檢測(cè)結(jié)果，圖4c為注射25hc后感染寨卡病毒的恒河猴尿中病毒的滴度檢測(cè)結(jié)果；

圖5為25hc對(duì)寨卡病毒引起的小頭癥的保護(hù)效果，其中，圖5a為胎鼠腦部免疫熒光檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，圖5b為用rt-qpcr分析胎鼠腦部病毒載量的結(jié)果圖，圖5c為胎鼠腦部縱切面nissl染色結(jié)果圖，圖5d為胎鼠腦部橫切面各皮層用nissl染色的結(jié)果圖，圖5e為胎鼠腦部neun⁺，tbr1⁺皮層厚度的結(jié)果圖，圖5f為p-h3檢測(cè)結(jié)果，圖5g為caspase3表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果；

圖6為25hc對(duì)孕鼠和乳鼠的安全性評(píng)價(jià)，其中，圖6a為孕鼠在出生前后體重檢測(cè)結(jié)果，圖6b為乳鼠生長(zhǎng)狀態(tài)觀察結(jié)果圖，圖6c為出生后第一天乳鼠體重檢測(cè)結(jié)果，圖6d為注射25hc的a129小鼠血清中alt活性檢測(cè)結(jié)果，圖6e為25hc在a129小鼠血清中的濃度隨時(shí)間變化情況圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

在本文中所披露的范圍的端點(diǎn)和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對(duì)于數(shù)值范圍來(lái)說(shuō)，各個(gè)范圍的端點(diǎn)值之間、各個(gè)范圍的端點(diǎn)值和單獨(dú)的點(diǎn)值之間，以及單獨(dú)的點(diǎn)值之間可以彼此組合而得到一個(gè)或多個(gè)新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開(kāi)。

在本發(fā)明中，在未作相反說(shuō)明的情況下，使用的術(shù)語(yǔ)如“抑制黃病毒”通常是指抑制黃病毒的復(fù)制，從而降低黃病毒的滴度。

本發(fā)明涉及25hc在預(yù)防和/或治療黃病毒感染中的應(yīng)用。同時(shí)，本發(fā)明還涉及一種預(yù)防和/或治療黃病毒感染的方法，其包括將(有效量的)25hc給藥至受試者。更具體地，本發(fā)明涉及25hc在制備用于預(yù)防和/或治療黃病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及25hc(在體內(nèi)或體外)抑制黃病毒中的應(yīng)用，特別是在體外抑制黃病毒中的應(yīng)用。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及一種抑制黃病毒的方法，其包括將(有效量的)25hc與黃病毒接觸(如將25hc給藥至受試者，或者給藥至黃病毒的攜帶者即吸血的節(jié)肢動(dòng)物(蚊、蜱、白蛉等)，或者給藥至其它可能存在黃病毒的器皿)。

本發(fā)明還涉及25hc在預(yù)防和/或治療寨卡病毒感染引起的小頭癥中的應(yīng)用。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及一種預(yù)防和/或治療寨卡病毒感染引起的小頭癥的方法，其包括將(有效量的)25hc給藥至受試者(特別是雌性受試者，更優(yōu)選妊娠期受試者)。更具體地，本發(fā)明涉及25hc在制備用于預(yù)防和/或治療寨卡病毒感染引起的小頭癥的藥物中的應(yīng)用。

上述黃病毒(flavivirus)可以為本領(lǐng)域各種常見(jiàn)的通過(guò)吸血的節(jié)肢動(dòng)物傳播而引起感染的具有包膜的單正鏈rna病毒，優(yōu)選為寨卡病毒、登革病毒、黃熱病毒及西尼羅河病毒中的至少一種。

其中，上述受試者可以為常見(jiàn)的易受黃病毒感染的哺乳動(dòng)物，特別是靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如人或猴)或嚙齒類動(dòng)物(如鼠)。

其中，給藥的方法可以為常規(guī)的方式，如腹腔注射或靜脈注射等。給藥的劑量可以為本領(lǐng)域常規(guī)的劑量(有效量)，可以根據(jù)各種參數(shù)、尤其根據(jù)受試者的年齡、體重和性別來(lái)確定。例如，對(duì)于雌性，3-4周齡，體重15-20g的balb/c小鼠，25hc的用量可以為25-100mg/kg體重(腹腔注射)，優(yōu)選為50-75mg/kg體重。對(duì)于3年齡體重4kg的恒河猴，25hc的用量可以為2.5-10mg/kg體重(靜脈注射)，優(yōu)選為5-7.5mg/kg體重。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)給藥的具體方式將25hc制備成不同的劑型。因此，另一方面，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，該藥物組合物含有25hc、至少一種有利于抑制黃病毒的輔助藥劑，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。所述輔助藥劑可以為干擾素和/或索氟布韋，等。所述藥學(xué)上可接受的載體可以為存在于藥物組合物中的并非活性組分的任何成分，因此包括稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、填料、著色劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、ph緩沖劑、防腐劑等。

本發(fā)明還涉及一種25hc，如前所述，其用于預(yù)防和/或治療黃病毒感染、抑制黃病毒、或預(yù)防和/或治療寨卡病毒感染引起的小頭癥。

以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，室溫指“20℃”；25hc購(gòu)自sigma公司，貨號(hào)為h1015；寨卡病毒gz01株及其它黃病毒保存于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒種庫(kù)；vero細(xì)胞購(gòu)自atcc公司，貨號(hào)為ccl-81；bhk-21細(xì)胞購(gòu)自atcc公司，貨號(hào)為ccl-10；hela細(xì)胞購(gòu)自atcc公司，貨號(hào)為ccl-2；balb/c小鼠購(gòu)自jacksonlaboratory，a129小鼠來(lái)自上海巴斯德所，小鼠均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁育；icr小鼠購(gòu)自維通利華公司；恒河猴購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3歲，4kg；所有動(dòng)物試驗(yàn)均在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)中心完成，且獲得了軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)(iacuc-13-2016-001)的許可。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可以從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1

(一)25hc在體外能有效抑制寨卡病毒的復(fù)制。

用不同濃度的25hc預(yù)處理vero細(xì)胞36小時(shí)，溶劑乙醇(etoh)作為陰性對(duì)照，然后用mtt實(shí)驗(yàn)檢測(cè)25hc對(duì)細(xì)胞的毒性。結(jié)果如圖1a所示：10μm的25hc對(duì)vero細(xì)胞都沒(méi)有毒性(圖1a)。

為了檢測(cè)25hc對(duì)寨卡病毒的抑制效果，用不同濃度的25hc預(yù)處理vero細(xì)胞12小時(shí)后，用寨卡病毒gz01株感染細(xì)胞(moi0.1)。48小時(shí)后，取細(xì)胞的上清做空斑實(shí)驗(yàn)，或者取細(xì)胞裂解液做rt-qpcr檢測(cè)病毒滴度，溶劑etoh作為對(duì)照。具體步驟如下：

(1)空斑實(shí)驗(yàn)：鋪2×10⁵個(gè)bhk-21細(xì)胞于12孔板里過(guò)夜孵育。然后用pbs清洗細(xì)胞一次，用待檢測(cè)的細(xì)胞上清樣品孵育1小時(shí)；然后細(xì)胞在含有1％低熔點(diǎn)瓊脂糖和含2％fbs的dmem培養(yǎng)基里再孵育4天。用結(jié)晶紫染色后對(duì)空斑進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(2)rna分離、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量pcr：用purelinkrna提取試劑盒(thermofisher)提取細(xì)胞、組織或病毒的總rna。用onestepprimescriptrt-pcr試劑盒(takara，北京)，通過(guò)rt-qrcr技術(shù)檢測(cè)病毒rna復(fù)制量(下同)。所用正向引物：5’-ggtcagcgtcctctctaataaacg-3’(seqidno：1)；反向引物：5’-gcaccctagtgtccactttttcc-3’(seqidno：2)；探針：5’-fam-agccatgaccgacaccacaccgt-bq1-3’(seqidno：3)。

空斑實(shí)驗(yàn)和rt-qpcr檢測(cè)結(jié)果分別如圖1b和1c所示，0.4μm的25hc即能非常有效地抑制寨卡病毒的感染。

最后，用5μm的25hc預(yù)處理hela細(xì)胞12小時(shí)，然后用寨卡病毒gz01株感染細(xì)胞(moi0.1)。48小時(shí)后，用免疫熒光檢測(cè)寨卡病毒e蛋白的量(抗體為4g2，atcc：hb-112)，其中，使用溶劑etoh作為陰性對(duì)照，廣譜抗黃病毒的抑制劑nitd008作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示，25hc能有效抑制寨卡病毒在hela細(xì)胞的感染(圖1d)。

(二)25hc對(duì)其它黃病毒(包括登革病毒、黃熱病毒及西尼羅河病毒)的抑制效果。

用rt-qpcr的方法檢測(cè)了25hc對(duì)其它黃病毒(包括登革病毒、黃熱病毒及西尼羅河病毒)的抑制效果。即，用不同濃度的25hc預(yù)處理vero細(xì)胞12小時(shí)后，分別用寨卡病毒gz01株、登革病毒2-43株、黃熱病毒17d株及西尼羅河病毒chin-01株感染細(xì)胞(moi0.1)。48小時(shí)后，取細(xì)胞裂解液做實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)病毒滴度。結(jié)果顯示，25hc抑制寨卡病毒、登革病毒、黃熱病毒及西尼羅河病毒的ic50分別為188nm、406nm、526nm和1109nm(如圖2a-2d所示)，說(shuō)明25hc對(duì)黃病毒有廣譜抑制效果。

(三)25hc能在小鼠體內(nèi)抑制寨卡病毒的復(fù)制。

用25hc(50mg/kg)或等量溶劑(vehicle，hβcd，羥丙基環(huán)糊精)對(duì)balb/c小鼠或a129小鼠(3-4周大小的雌鼠)進(jìn)行預(yù)處理，然后用寨卡病毒gz01株(10⁵pfu/只小鼠)腹腔注射感染這些小鼠。感染12小時(shí)后，這些小鼠繼續(xù)每天腹腔注射25hc(50mg/kg)或溶劑1天(balb/c)或達(dá)7天(a129小鼠)。每天觀察小鼠的病征和死亡情況直到感染后21天。用rt-qpcr檢測(cè)溶劑或25hc處理的寨卡病毒感染小鼠4天和7天后血清或腦中病毒rna量。用log-rank(mantel-cox)檢驗(yàn)比較溶劑或25hc處理過(guò)的寨卡病毒感染小鼠的存活情況。結(jié)果顯示，25hc能有效抑制寨卡病毒在balb/c或a129小鼠中的復(fù)制(圖3a、3c-3d)，并能在a129小鼠中有效保護(hù)寨卡病毒引起的小鼠死亡(圖3b)；同時(shí)25hc能有效抑制小鼠腦中病毒的復(fù)制(圖3e)。

(四)25hc在恒河猴中對(duì)寨卡病毒的抑制效果。

用25hc(1.5mg/kg)(n＝2)或溶劑etoh(control，n＝3)對(duì)恒河猴進(jìn)行靜脈注射預(yù)處理，1天后將寨卡病毒gz01株(10³pfu/只猴)肌肉注射到恒河猴體內(nèi)。感染6小時(shí)后，將恒河猴繼續(xù)每天靜脈注射25hc(5mg/kg)或溶劑達(dá)7天(具體操作流程見(jiàn)圖4a)。每天觀察猴子的病征，并取血，尿，用rt-qpcr檢測(cè)血清或尿中病毒rna量。結(jié)果顯示，25hc能有效降低寨卡病毒在恒河猴血和尿中病毒的滴度(圖4b-4c)。

(五)25hc對(duì)寨卡病毒引起的小頭癥的保護(hù)效果。

用實(shí)驗(yàn)室建立的寨卡病毒在小鼠中引起小頭癥的模型(參見(jiàn)li等人,2016)，檢測(cè)25hc對(duì)小頭癥的保護(hù)效果。在病毒感染前對(duì)icr小鼠腹腔注射25hc(50mg/kg)或溶劑對(duì)照(vehicle，hβcd，羥丙基環(huán)糊精)進(jìn)行預(yù)處理6小時(shí)。向icr小鼠右側(cè)腦室注射1μl寨卡病毒sz01株(6.5×10⁵pfu/ml)，另一半胎鼠注射培養(yǎng)基作為對(duì)照。6小時(shí)后，孕鼠繼續(xù)每天注射25hc或溶劑。5天后，取胎鼠腦部進(jìn)行免疫熒光或染色檢測(cè)，操作如下：

免疫熒光染色和共聚焦成像定量：對(duì)于冰凍切片，將組織固定在4％多聚甲醛里，然后在30％蔗糖中脫水并在組織冷凍液中冷凍。厚度為40μm組織切片在10％馬血清，0.3％tritonx-100以及含5％bsa的pbs里室溫封閉1小時(shí)。用以下成分的一抗phospho-histone3(p-h3)(cst,9701s,1:1000),activated-caspase3(cst,9664s,1:500),tbr1(abcam,ab31940,1:500)、及來(lái)自一名感染寨卡病毒患者的血清(1:100)孵育過(guò)夜。寨卡病毒的對(duì)照血清(1：100)來(lái)自于一名健康人，同時(shí)對(duì)照鼠血清(1：500)。細(xì)胞核用dapi(thermofisher)染色。將切片放在lsm700(carlzeiss)共聚焦顯微鏡上拍照，同時(shí)圖像用imaris和imagej進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)都用prism軟件(graphpad)進(jìn)行分析。用不配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。得出的數(shù)據(jù)為平均數(shù)±sem。結(jié)果如圖5所示。

如圖5a-5b所示，分別用免疫熒光和rt-qpcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，25hc能有效降低胎鼠腦部病毒的含量。用nissl染色發(fā)現(xiàn)，25hc能有效的保護(hù)寨卡病毒感染引起的胎鼠大腦皮層變薄和腦室的變大(圖5c)。對(duì)于腦皮層的各個(gè)分區(qū)，nissl染色結(jié)果也顯示，25hc能有效阻止由寨卡病毒感染引起的皮層分區(qū)的變薄，如圖5d所示，其中，mz:邊緣帶(marginalzone)；cp:皮質(zhì)板(corticalplate)；sp:底板(sub-plate)；iz:中間帶(intermediatezone)。尤其是sp區(qū)域，在寨卡病毒感染的胎鼠腦部已經(jīng)檢測(cè)不到，而在25hc處理的胎鼠腦部能夠檢測(cè)到sp區(qū)域(圖5d-5e)。

通過(guò)免疫熒光檢測(cè)成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物分子neun和不成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物分子tbr1，發(fā)現(xiàn)25hc也能提高neun/tbr1的比例，即能提高神經(jīng)元的發(fā)育和成熟水平，保護(hù)由寨卡病毒感染引起的神經(jīng)元發(fā)育受阻(圖5e)。通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)元前體細(xì)胞(neuronalprogenitorcells，npc)增殖的標(biāo)志物p-h3，這是一個(gè)npc處在減數(shù)分裂m期的標(biāo)志物。結(jié)果顯示寨卡病毒感染能降低p-h3在npc中的量，而25hc能恢復(fù)這一現(xiàn)象，提高p-h3的表達(dá)量(圖5f)。另外寨卡病毒感染能導(dǎo)致caspase3表達(dá)量增高，伴隨著細(xì)胞的凋亡的增強(qiáng)。而25hc能夠減少caspase3蛋白的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生(圖5g)。

(六)25hc對(duì)孕鼠和乳鼠的安全性評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)25hc在孕鼠及普通小鼠體內(nèi)的安全性，在icr孕鼠e14.5天時(shí)，腹腔注射25hc(50mg/kg)，溶劑對(duì)照(vehicle，hβcd)，連續(xù)給藥5天，并連續(xù)觀察孕鼠的體重變化，及是否有流產(chǎn)或早產(chǎn)現(xiàn)象。如圖6a所示，注射25hc的組和溶劑組的孕鼠體重變化趨勢(shì)抑制，并且都沒(méi)有流產(chǎn)或早產(chǎn)，產(chǎn)后3周體重都恢復(fù)到正常水平。出生的乳鼠體重和發(fā)育都不受影響(圖6b-6c)。

同時(shí)，還檢測(cè)了25hc對(duì)血清中轉(zhuǎn)氨酶(alt)活性的影響，結(jié)果如圖6d所示，在a129小鼠中連續(xù)給藥7天后，血清中alt活性和對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明該劑量下，25hc對(duì)孕鼠及正常小鼠是安全的。血清中25hc的濃度在給藥后4小時(shí)升到最高，之后逐漸降低，到24小時(shí)后，25hc的濃度降低到正常水平(圖6e)。說(shuō)明注射的25hc在血里經(jīng)過(guò)代謝會(huì)恢復(fù)到生理水平。

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，使用25hc能有效抑制黃病毒，從而可以用于預(yù)防和/或治療黃病毒感染。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說(shuō)明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容。

參考文獻(xiàn)：

aliota,m.t.,caine,e.a.,walker,e.c.,larkin,k.e.,camacho,e.,andosorio,j.e.(2016).characterizationoflethalzikavirusinfectioninag129mice.plosnegltropdis10,e0004682.

araujo,l.m.,ferreira,m.l.,andnascimento,o.j.(2016).guillain-barresyndromeassociatedwiththezikavirusoutbreakinbrazil.arquivosdeneuro-psiquiatria74,253-255.

bayer,a.,lennemann,n.j.,ouyang,y.,bramley,j.c.,morosky,s.,marques,e.t.,jr.,cherry,s.,sadovsky,y.,andcoyne,c.b.(2016).typeiiiinterferonsproducedbyhumanplacentaltrophoblastsconferprotectionagainstzikavirusinfection.cellhost&microbe19,705-712.

blanc,m.,hsieh,w.y.,robertson,k.a.,kropp,k.a.,forster,t.,shui,g.,lacaze,p.,watterson,s.,griffiths,s.j.,spann,n.j.,etal.(2013).thetranscriptionfactorstat-1couplesmacrophagesynthesisof25-hydroxycholesteroltotheinterferonantiviralresponse.immunity38,106-118.

cao-lormeau,v.m.,blake,a.,mons,s.,lastere,s.,roche,c.,vanhomwegen,j.,dub,t.,baudouin,l.,teissier,a.,larre,p.,etal.(2016).guillain-barresyndromeoutbreakassociatedwithzikavirusinfectioninfrenchpolynesia:acase-controlstudy.lancet387,1531-1539.

carteaux,g.,maquart,m.,bedet,a.,contou,d.,brugieres,p.,fourati,s.,cleretdelangavant,l.,debroucker,t.,brun-buisson,c.,leparc-goffart,i.,andmekontsodessap,a.(2016).zikavirusassociatedwithmeningoencephalitis.thenewenglandjournalofmedicine374,1595-1596.

dick,g.w.(1952).zikavirus.ii.pathogenicityandphysicalproperties.transactionsoftheroyalsocietyoftropicalmedicineandhygiene46,521-534.

dick,g.w.,kitchen,s.f.,andhaddow,a.j.(1952).zikavirus.i.isolationsandserologicalspecificity.transactionsoftheroyalsocietyoftropicalmedicineandhygiene46,509-520.

hamel,r.,dejarnac,o.,wichit,s.,ekchariyawat,p.,neyret,a.,luplertlop,n.,perera-lecoin,m.,surasombatpattana,p.,talignani,l.,thomas,f.,etal.(2015).biologyofzikavirusinfectioninhumanskincells.journalofvirology89,8880-8896.

holmes,r.s.,vandeberg,j.l.,andcox,l.a.(2011).genomicsandproteomicsofvertebratecholesterolesterlipase(lipa)andcholesterol25-hydroxylase(ch25h).3biotech1,99-109.

janowski,b.a.,grogan,m.j.,jones,s.a.,wisely,g.b.,kliewer,s.a.,corey,e.j.,andmangelsdorf,d.j.(1999).structuralrequirementsofligandsfortheoxysterolliverxreceptorslxralphaandlxrbeta.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica96,266-271.

kandutsch,a.a.,chen,h.w.,andheiniger,h.j.(1978).biologicalactivityofsomeoxygenatedsterols.science201,498-501.

lazear,h.m.,govero,j.,smith,a.m.,platt,d.j.,fernandez,e.,miner,j.j.,anddiamond,m.s.(2016).amousemodelofzikaviruspathogenesis.cellhost&microbe.

li,c.,xu,d.,ye,q.,hong,s.,jiang,y.,liu,x.,zhang,n.,shi,l.,qin,c.f.,andxu,z.(2016).zikavirusdisruptsneuralprogenitordevelopmentandleadstomicrocephalyinmice.cellstemcell19,120-126.

liu,s.y.,aliyari,r.,chikere,k.,li,g.,marsden,m.d.,smith,j.k.,pernet,o.,guo,h.,nusbaum,r.,zack,j.a.,etal.(2013).interferon-induciblecholesterol-25-hydroxylasebroadlyinhibitsviralentrybyproductionof25-hydroxycholesterol.immunity38,92-105.

liu,s.y.,sanchez,d.j.,aliyari,r.,lu,s.,andcheng,g.(2012).systematicidentificationoftypeiandtypeiiinterferon-inducedantiviralfactors.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica109,4239-4244.

musso,d.,andgubler,d.j.(2016).zikavirus.clinicalmicrobiologyreviews29,487-524.

quicke,k.m.,bowen,j.r.,johnson,e.l.,mcdonald,c.e.,ma,h.,o'neal,j.t.,rajakumar,a.,wrammert,j.,rimawi,b.h.,pulendran,b.,etal.(2016).zikavirusinfectshumanplacentalmacrophages.cellhost&microbe.

savidis,g.,perreira,j.m.,portmann,j.m.,meraner,p.,guo,z.,green,s.,andbrass,a.l.(2016).theifitmsinhibitzikavirusreplication.cellreports15,2323-2330.

sequencelisting

<110>蘇州系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所

中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所

中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所

<120>25-羥基膽固醇在抑制黃病毒中的用途

<130>i43495pumc

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>thesequenceissynthesized

<400>1

ggtcagcgtcctctctaataaacg24

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>thesequenceissynthesized

<400>2

gcaccctagtgtccactttttcc23

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>thesequenceissynthesized

<400>3

agccatgaccgacaccacaccgt23