本公開涉及生物醫(yī)藥領域，具體地涉及位點特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物。
背景技術：
：蛋白質(zhì)藥物(如抗體、干擾素)已經(jīng)廣泛用于生物醫(yī)藥領域，如靶向治療、臨床診斷等。相比于其他藥物，蛋白質(zhì)藥物特異性較好，見效快，毒性低。然而，其穩(wěn)定性差、血液循環(huán)時間短等缺點在一定程度上限制了此類藥物的藥效和應用。目前，研究較多的提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，延長其血液循環(huán)時間的體系是蛋白質(zhì)-高分子雜化體系。蛋白質(zhì)藥物往往由于體內(nèi)蛋白酶的降解致使其血液循環(huán)時間比較短暫，因此將水溶性較好的高分子材料接枝在蛋白質(zhì)表面，對蛋白質(zhì)有一定的保護作用，既可降低蛋白質(zhì)的免疫原性，也可以降低蛋白酶對蛋白質(zhì)類藥物的降解以延長其血液循環(huán)時間。舉例而言，干擾素-α2a是治療慢性丙型肝炎的藥物，在其表面接枝一條40kda的聚乙二醇鏈將會顯著延長其血液循環(huán)時間，干擾素-α2a-聚乙二醇雜化材料已應用于臨床。然而，目前臨床中已應用的蛋白質(zhì)-高分子雜化體系中主要使用聚乙二醇作為高分子片段。聚乙二醇具有免疫原性低、水溶性好等優(yōu)點，但隨著聚乙二醇在化妝品、食品、制藥等領域的廣泛應用，大部分人的體內(nèi)已產(chǎn)生聚乙二醇抗體，反而會加速聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)類藥物在血液中的清除。更嚴重的是聚乙二醇在人體內(nèi)不可降解，長期服用則會導致積累毒性。因此，尋找可降解、生物相容性好的高分子材料迫在眉睫。聚氨基酸是一類具有良好生物相容性的高分子材料，其主鏈的可降解性及側(cè)鏈的修飾便利性都使得它在蛋白質(zhì)改性方面具有廣泛的應用。更重要的是聚氨基酸具有多肽主鏈結構、生物相容性好、免疫原性低等特點，非常適合用于蛋白質(zhì)藥物的修飾。由此，本公開了提供了一種蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物及一種蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物以克服本領域尚存在的不足之處。技術實現(xiàn)要素：在本公開的一方面，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，其具有如通式1表示的結構：其中：ptn表示蛋白質(zhì)；et當與ptn的n端連接時，為而當與ptn的除n端之外的位點連接時，為r1每次出現(xiàn)時獨立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；n為選自1至300的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，ptn是蛋白質(zhì)類藥物，如多肽激素、單克隆抗體、基因工程抗體、干擾素、白介素、集落刺激因子、重組疫苗等。根據(jù)本公開的另一實施方案，ptn是干擾素α2b。根據(jù)本公開的一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示天然氨基酸側(cè)鏈，所述天然氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸。根據(jù)本公開的另一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)寡聚乙二醇修飾、磷酸酯修飾、丙烯氧基芐酯修飾、烯丙基二縮三乙二醇修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的側(cè)鏈。根據(jù)本公開的一實施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫或c1-c10烷基。根據(jù)本公開的另一實施方案，r2表示氫。本公開的另一方面，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，其具有如通式2表示的結構：其中：ptn表示蛋白質(zhì)；et當與ptn的n端連接時，為而當與ptn的除n端之外的位點連接時，為r1每次出現(xiàn)時獨立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；n為選自1至200的整數(shù)；以及m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一方面，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物，其具有如通式3表示的結構：其中：ptn表示蛋白質(zhì)，其具有n端處的半胱氨酸殘基和c端處的lpxat序列，其中xa表示一種或多種氨基酸；paa(gly)m為具有通式4表示的結構：其中：r1每次出現(xiàn)時獨立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；n為選自10至300的整數(shù)；以及m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，ptn是蛋白質(zhì)類藥物，如多肽激素、單克隆抗體、基因工程抗體、干擾素、白介素、集落刺激因子、重組疫苗等。根據(jù)本公開的另一實施方案，ptn是干擾素α2b。根據(jù)本公開的一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示天然氨基酸側(cè)鏈，所述天然氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸。根據(jù)本公開的另一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)寡聚乙二醇修飾、磷酸酯修飾、丙烯氧基芐酯修飾、烯丙基二縮三乙二醇修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的側(cè)鏈。根據(jù)本公開的一實施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫或c1-c10烷基。根據(jù)本公開的另一實施方案，r2表示氫。在本公開的另一方面，提供了上述蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物或蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物在制造蛋白質(zhì)類藥物中的用途。附圖說明在下文參考附圖來進一步描述本文所例示的實施方案，但是所述附圖僅僅是為了讓本領域技術人員更好地理解本公開內(nèi)容，而不旨在限定該公開內(nèi)容的范圍。圖1為根據(jù)本公開一實施方案的位點特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物示意圖；圖2為根據(jù)本公開一實施方案的蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)化反應示意圖；圖3為根據(jù)實施例1的聚氨基酸p1的maldi-tof譜圖；圖4為根據(jù)實施例15的環(huán)狀偶聯(lián)物maldi-tof譜圖，其中o表示l-谷氨酸(乙二醇)3酯鏈段，g表示甘氨酸鏈段，角標表示相應鏈段的聚合度；圖5為根據(jù)實施例16的enlyfq-cys-egfp蛋白的uplc-ms譜圖；圖6為根據(jù)實施例18的cys-egfp蛋白的uplc-ms譜圖；圖7為根據(jù)實施例19的聚氨基酸p1(n＝7)-增強型綠色熒光蛋白偶聯(lián)物的電泳圖，其示出變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(a)及非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)；圖8為根據(jù)實施例20的enlyfqc-增強型綠色熒光蛋白-聚乙二醇-聚甘氨酸偶聯(lián)物的電泳圖，其示出變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(a)及非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)；圖9為根據(jù)實施例21的聚氨基酸p1(n＝7)-增強型綠色熒光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇節(jié)點狀偶聯(lián)物的電泳圖，其示出變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(a)及非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)；圖10為根據(jù)實施例22的增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α啞鈴狀偶聯(lián)物的電泳圖，其示出變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(a)及非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)；圖11為根據(jù)實施例23的環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物的表征：maldi-tof(a)，變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(b)及免疫印跡分析(c)；圖12為根據(jù)實施例24的cys-增強型綠色熒光蛋白(a)、聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白(b)和環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物(c)酶穩(wěn)定性的表征：圖a、b和c內(nèi)的方框為蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物原料；圖13為根據(jù)實施例26的蛋白-干擾素的uplc-ms譜圖；圖14為根據(jù)實施例27和28的聚氨基酸偶聯(lián)物的電泳圖；圖15為根據(jù)實施例29的環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的表征：a.環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的變性膠凝膠電泳；b.環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的免疫印跡分析；c.環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的變性膠凝膠電泳；d.環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)偶聯(lián)物的免疫印跡分析；圖16為示出根據(jù)實施例30的各蛋白質(zhì)樣品的tm值的柱形圖；圖17為示出根據(jù)實施例31的胰蛋白酶耐受性測試的結果的圖表；圖18為根據(jù)實施例32的wt-ifnα，聚氨基酸p1(n＝100,l型)-ifnα偶聯(lián)物與聚氨基酸p1(n＝100,d,l型)-ifnα偶聯(lián)物的圓二色譜表征；圖19為示出根據(jù)實施例34的聚氨基酸-干擾素偶聯(lián)物的血藥濃度的圖表；圖20a和b為示出根據(jù)實施例35的聚氨基酸-偶聯(lián)物與環(huán)狀聚氨基酸-偶聯(lián)物的體內(nèi)抗腫瘤活性的圖表；圖21為根據(jù)實施例37的聚氨基酸-抗體偶聯(lián)物的電泳圖。具體實施方式在下文中，將根據(jù)具體實施方案來進一步闡述本公開的內(nèi)容。然而，所列舉的具體實施方案僅出于例示目的，而并不旨在限制本公開的內(nèi)容。本領域技術人員會認識到，以下任一實施方案中的具體特征可以用于任何其他實施方案，只要其不背離本公開的主旨即可。定義在下文中，除非另外定義，本文使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)均具有如本公開所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。術語，諸如在常用詞典中定義的那些術語，應解釋為具有與其在相關技術的上下文中的含義相符的含義，并且不會以理想化或過于正式的含義來解釋，除非本文明確如此定義。如本文所用，術語“c1-30”是指基團的主鏈中具有1至30的范圍內(nèi)的任意整數(shù)值的碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、30個碳原子。如本文所用，術語“烷基”是指具有直鏈或支鏈的飽和脂肪族烴基。其非限制性實例包括甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。如本文所用，術語“烯基”是指在沿著烷基的碳鏈的一個或多個位置處具有至少一個碳-碳雙鍵的烴基。其非限制性實例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基等。如本文所用，術語“炔基”是指在沿著烷基的碳鏈的一個或多個位置處具有至少一個碳-碳叁鍵的烴基。其非限制性實例包括乙炔基、丙炔基等。如本文所用，術語“雜烷基”、“雜烯基”、“雜炔基”分別是指包含至少一個選自n、o、si、p和s的雜原子的烷基、烯基、炔基。如本文所用，術語“環(huán)烷基”是指單環(huán)飽和烴基。其非限制性實例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。如本文所用，術語“雜環(huán)烷基”是指包含作為成環(huán)原子的至少一個選自n、o、si、p和s的雜原子的單碳環(huán)基團。其非限制性實例包括四氫呋喃基和四氫噻吩基。如本文所用，術語“環(huán)烯基”是指在其環(huán)中具有碳原子和至少一個雙鍵的單環(huán)基團，而且其不是芳香族的。其非限制性實例包括環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基和環(huán)庚烯基。如本文所用，術語“雜環(huán)烯基”是指在其環(huán)中包括作為成環(huán)原子的至少一個選自n、o、si、p和s的雜原子和至少一個雙鍵的單碳環(huán)基團。其非限制性實例包括4,5-二氫-1,2,3,4-噁三唑基、2,3-二氫呋喃基和2,3-二氫噻吩基。如本文所用，術語“芳基”是指包含碳環(huán)芳香族體系的基團。其非限制性實例包括苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基等。當芳基包括多個環(huán)時，各自的環(huán)可以彼此稠合。如本文所用，術語“雜芳基”是指具有包含作為成環(huán)原子的至少一個選自n、o、si、p和s的雜原子的碳環(huán)芳香族體系的基團。其非限制性實例包括吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三嗪基、喹啉基、異喹啉基等。當雜芳基包括多個環(huán)時，各自的環(huán)可以彼此稠合。蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物在本公開的一實施方案，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，其具有如通式1表示的結構：其中：ptn表示蛋白質(zhì)；et當與ptn的n端連接時，為而當與ptn的除n端之外的位點連接時，為r1每次出現(xiàn)時獨立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；n為選自1至300的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，ptn是選自酶、激素、細胞因子、單克隆抗體和/或蛋白質(zhì)疫苗的蛋白質(zhì)。根據(jù)本公開的另一實施方案，ptn是蛋白質(zhì)類藥物，如多肽激素、單克隆抗體、干擾素、白介素、集落刺激因子、重組疫苗等。根據(jù)本公開的另一實施方案，ptn是干擾素α2b。可適用于本文的蛋白類藥物不受特別的限制，只要其能夠與et連接基團連接即可。理論上，任何蛋白質(zhì)類藥物經(jīng)修飾后均可適用于本文。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的酶包括但不限于：蛋白水解酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈激酶、尿激酶、纖溶酶、凝血酶、谷氨酰胺酶、精氨酸酶、絲氨酸脫水酶、苯丙氨酸氨解酶、亮氨酸脫氫酶、青霉素酶、超氧化物歧化酶、葡聚糖酶和/或右旋糖酐酶。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的激素包括但不限于下丘腦激素、垂體激素、胃腸激素、胰島素、降鈣素。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的細胞因子包括但不限于白細胞介素、干擾素、集落刺激因子、趨化因子和/或生長因子。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的白細胞介素包括il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31和/或il-32。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的干擾素包括但不限于ifn-α、ifn-β、ifn-γα、ifn-λ及其亞型。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的集落刺激因子包括但不限于：粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、多能集落刺激因子、干細胞因子、白血病抑制因子和/或紅細胞生成素。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的生長因子包括但不限于表皮細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子和/或神經(jīng)生長因子。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的單克隆抗體包括但不限于：曲妥珠單抗、西妥昔單抗、達利珠單抗、他尼珠單抗、阿巴伏單抗、阿德木單抗、阿夫土珠單抗、阿侖單抗、培化阿珠單抗、阿麥妥昔單抗、阿泊珠單抗、巴維昔單抗、貝妥莫單抗、貝利木單抗、貝伐單抗、莫-比伐珠單抗、貝倫妥單抗-維多汀、莫-坎妥珠單抗、拉-坎妥珠單抗、卡羅單抗-噴地肽、卡妥索單抗、泊-西他珠單抗、西妥木單抗、可那木單抗、達西珠單抗、達洛珠單抗、地莫單抗、依美昔單抗、依決洛單抗、依洛珠單抗、恩司昔單抗、依帕珠單抗、厄馬索單抗、埃達珠單抗、法勒珠單抗、芬妥木單抗、加利昔單抗、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗、吉瑞昔單抗、格萊木單抗-維多汀、替-伊莫單抗、伊戈伏單抗、拉-英達西單抗、英妥木單抗、伊珠單抗-奧佐米星、伊匹木單抗、伊妥木單抗、拉貝珠單抗、來沙木單抗、林妥珠單抗、莫-洛伏珠單抗、魯卡木單抗、魯昔單抗、馬帕木單抗、馬妥珠單抗、米拉珠單抗、米妥莫單抗、莫加珠單抗、他那可單抗、他那莫單抗、奈昔木單抗、尼妥珠單抗、納武單抗、奧法木單抗、奧納珠單抗、莫-奧珠單抗、奧戈伏單抗、帕尼單抗、帕曲土單抗、培妥珠單抗、普立木單抗、雷妥莫單抗、雷莫蘆單抗、利妥木單抗、利妥昔單抗、羅妥木單抗、奧馬珠單抗、西羅珠單抗、司妥昔單抗、帕-他莫單抗、替妥莫單抗、替妥木單抗、替西木單抗、曲美木單抗、替加珠單抗、托西莫單抗、西莫白介素單抗、烏瑞魯單抗、維妥珠單抗、伏洛昔單抗、伏妥莫單抗和扎蘆木單抗，包括其抗原結合片段。根據(jù)本公開的一實施方案，可用于本公開的蛋白質(zhì)疫苗包括但不限于白喉類毒素、破傷風類毒素、炭疽分泌蛋白疫苗和/或乙型肝炎血源疫苗。根據(jù)本公開的一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示天然氨基酸側(cè)鏈，所述天然氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸。根據(jù)本公開的另一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示非天然氨基酸側(cè)鏈，如經(jīng)人工修飾的上述天然氨基酸。根據(jù)本公開的又一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)寡聚乙二醇(聚合度為2-10，如二縮三乙二醇，oeg3)修飾、磷酸酯修飾、丙烯氧基芐酯修飾、烯丙基二縮三乙二醇修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的側(cè)鏈。根據(jù)本公開的再一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)二縮三乙二醇(oeg3)修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的側(cè)鏈。本文對r1沒有特別的限制，理論上，任何天然氨基酸可以直接地用于本公開的偶聯(lián)物，或者經(jīng)修飾后，再用于本公開的偶聯(lián)物，以便改善穩(wěn)定性。根據(jù)本公開的一實施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫或c1-c10烷基。根據(jù)本公開的另一實施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基。根據(jù)本公開的又一實施方案，r2表示氫或甲基。根據(jù)本公開的一實施方案，n表示選自1至200的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實施方案，n表示選自1至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實施方案，n表示選自1至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的再一實施方案，n表示選自1至50的整數(shù)。在理論上，n可以為任何數(shù)值，只要所得的偶聯(lián)物穩(wěn)定存在即可，本領域技術人員可以根據(jù)實際應用，設定具體的n值，而且，這種選擇應在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。根據(jù)本公開的一實施方案，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，其具有如通式2表示的結構：其中：ptn、et、r1和r2如上文對通式1所定義；n為選自1至200的整數(shù)；以及m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，n表示選自1至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實施方案，n表示選自1至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實施方案，n表示選自1至50的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，m表示選自1至20的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實施方案，m表示選自1至10的整數(shù)。如上所述，n值和m值可以為任何數(shù)值，并不局限于本文所列舉的特定范圍，條件是所得的偶聯(lián)物可以穩(wěn)定存在。本領域技術人員可以根據(jù)實際應用，設定具體的n值和m值，而且，這種選擇應在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物根據(jù)本公開的一實施方案，提供了蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物，其具有如通式3表示的結構：其中：ptn表示蛋白質(zhì)，其具有n端處的半胱氨酸殘基和c端處的lpxat序列，其中xa表示一種或多種氨基酸；paa(gly)m為具有通式4表示的結構：其中：r1每次出現(xiàn)時獨立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；n為選自10至300的整數(shù)；以及m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，ptn是上文所述蛋白質(zhì)類藥物，其中所述蛋白質(zhì)類藥物具有n端處的半胱氨酸殘基和c端處的lpxat序列，或可以經(jīng)修飾而具有n端處的半胱氨酸殘基和c端處的lpxat序列。根據(jù)本公開的另一實施方案，ptn是n端處具有半胱氨酸殘基且c端處具有l(wèi)pxat序列的干擾素α2b。根據(jù)本公開的又一實施方案，ptn是具有氨基酸序列seqidno.1的蛋白質(zhì)。根據(jù)本公開的再一實施方案，ptn如上文關于通式1所述。根據(jù)本公開的一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示天然氨基酸側(cè)鏈，所述天然氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸。根據(jù)本公開的另一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示非天然氨基酸側(cè)鏈，如經(jīng)人工修飾的上述天然氨基酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的又一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)寡聚乙二醇(聚合度為2-10，如二縮三乙二醇，oeg3)修飾、磷酸酯修飾、丙烯氧基芐酯修飾、烯丙基二縮三乙二醇修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的再一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)二縮三乙二醇(oeg3)修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的一實施方案，xa可以是選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸中的一種或多種。根據(jù)本公開的一實施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫或c1-c10烷基。根據(jù)本公開的另一實施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基。根據(jù)本公開的又一實施方案，r2表示氫。根據(jù)本公開的一實施方案，n表示選自10至200的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實施方案，n表示選自10至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實施方案，n表示選自10至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的再一實施方案，n表示選自10至50的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，m表示選自1至20的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實施方案，m表示選自1至10的整數(shù)。如上所述，n值和m值可以為任何數(shù)值，并不局限于本文所列舉的特定范圍，條件是所得的偶聯(lián)物可以穩(wěn)定存在。本領域技術人員可以根據(jù)實際應用，設定具體的n值和m值，而且，這種選擇應在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。用于蛋白(環(huán)化)偶聯(lián)的聚氨基酸根據(jù)本公開的一實施方案，提供了用于蛋白(環(huán)化)偶聯(lián)的聚氨基酸，其具有如通式5所示的結構：其中：x表示硫或硒；r1每次出現(xiàn)時獨立地表示天然氨基酸側(cè)鏈或非天然氨基酸側(cè)鏈；r2每次出現(xiàn)時獨立地表示氫或c1-c10烷基、c2-c10烯基、c2-c10炔基；r5表示取代或未取代的c1-c30烷基、取代或未取代的c2-c30烯基、取代或未取代的c2-c30炔基、取代或未取代的c3-c30環(huán)烷基、取代或未取代的c3-c30環(huán)烯基、取代或未取代的c1-c30雜烷基、取代或未取代的c2-c30雜烯基、取代或未取代的c2-c30雜炔基、取代或未取代的c1-c30雜環(huán)烷基、取代或未取代的c2-c30雜環(huán)烯基、取代或未取代的c6-c30芳基、取代或未取代的c5-c30雜芳基；以及n為選自1至200的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示天然氨基酸側(cè)鏈，所述天然氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或組氨酸。根據(jù)本公開的另一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示非天然氨基酸側(cè)鏈，如經(jīng)人工修飾的上述天然氨基酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的又一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)寡聚乙二醇(聚合度為2-10，如二縮三乙二醇，oeg3)修飾、磷酸酯修飾、丙烯氧基芐酯修飾、烯丙基二縮三乙二醇修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的再一實施方案，r1每次出現(xiàn)時表示經(jīng)二縮三乙二醇(oeg3)修飾的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸側(cè)鏈。根據(jù)本公開的一實施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫或c1-c10烷基。根據(jù)本公開的另一實施方案，r2每次出現(xiàn)時表示氫、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基。根據(jù)本公開的又一實施方案，r2表示氫。根據(jù)本公開的一實施方案，r5表示取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c2-c10烯基、取代或未取代的c2-c10炔基、取代或未取代的c3-c10環(huán)烷基、取代或未取代的c3-c10環(huán)烯基、取代或未取代的c1-c10雜烷基、取代或未取代的c2-c10雜烯基、取代或未取代的c1-c10雜環(huán)烷基、取代或未取代的c2-c10雜環(huán)烯基、取代或未取代的c6-c18芳基、取代或未取代的c5-c18雜芳基。根據(jù)本公開的另一實施方案，r5表示取代或未取代的c1-c10烷基、取代或未取代的c3-c10環(huán)烷基、取代或未取代的c1-c10雜烷基、取代或未取代的c1-c10雜環(huán)烷基、取代或未取代的c6-c18芳基、取代或未取代的c5-c18雜芳基。根據(jù)本公開的一實施方案，用于取代r5的取代基選自鹵素、鹵代c1-3烷基、羥基、氨基、巰基、羰基、羧基、磺酸基、羧酸鹽、磺酸鹽、酯基、酰胺和/或鹵素。根據(jù)本公開的另一實施方案，r5選自以下結構式，但不限于此：根據(jù)本公開的又一實施方案，r5表示甲基、乙基、丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、苯基。根據(jù)本公開的再一實施方案，r5表示苯基。根據(jù)本公開的一實施方案，n表示選自1至200的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實施方案，n表示選自1至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實施方案，n表示選自1至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的再一實施方案，n表示選自1至50的整數(shù)。在理論上，n可以為任何數(shù)值，只要所得的聚氨基酸穩(wěn)定存在即可，本領域技術人員可以根據(jù)實際應用，設定具體的n值，而且，這種選擇應在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。根據(jù)本公開的一實施方案，提供了用于蛋白(環(huán)化)偶聯(lián)的聚氨基酸，其具有如通式6所示的結構：其中：x、r1、r2和r5如上文對通式5所定義；n為選自10至200的整數(shù)；m為選自1至30的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，n表示選自10至150的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實施方案，n表示選自10至120的整數(shù)。根據(jù)本公開的又一實施方案，n表示選自10至100的整數(shù)。根據(jù)本公開的再一實施方案，n表示選自10至80的整數(shù)。根據(jù)本公開的其他實施方案，n表示選自10至50的整數(shù)。根據(jù)本公開的一實施方案，m表示選自1至20的整數(shù)。根據(jù)本公開的另一實施方案，m表示選自1至10的整數(shù)。如上所述，n值和m值可以為任何數(shù)值，并不局限于本文所列舉的特定范圍，條件是所得的偶聯(lián)物可以穩(wěn)定存在。本領域技術人員可以根據(jù)實際應用，設定具體的n值和m值，而且，這種選擇應在本領域技術人員的能力范圍內(nèi)。制備蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物的方法根據(jù)本公開的一實施方案，提供了制備本文所述的位點特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物的方法，包括：(1)利用引發(fā)劑引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到具有碳結構的聚氨基酸；(2)將所得到的聚氨基酸與含有1,2-巰基乙胺結構的蛋白質(zhì)混合，發(fā)生自然化學連接反應，得到位點特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物。根據(jù)本公開的一實施方案，步驟(1)包括：利用引發(fā)劑(r5xy)引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到含有碳結構的聚氨基酸(paa-xr5)，如下所示：其中：x、r1、r5和n如上文對通式5所定義；y代表氫或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基優(yōu)選為c1-c10烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。根據(jù)本公開的另一實施方案，當y為三烷基硅基時，所得的聚氨基酸的氮端處的三烷基硅基氨基甲酸酯結構在遇到空氣中的水分時很容易脫去，因此最終得到的聚氨基酸氮端為氨基。根據(jù)本公開的又一實施方案，步驟(1)包括：利用引發(fā)劑(r5xy)引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到含有碳結構的聚氨基酸(paa-xr5)，如下所示：其中：x、r1、r2、r5和n如上文對通式5所定義；y代表氫或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基優(yōu)選為c1-c10烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。根據(jù)本公開的一實施方案，以r5xy為三甲基硅基苯硫酚或三甲基硅基苯硒酚為例，反應式為：其中x、r1和n如上文對通式5所定義。根據(jù)本公開的一實施方案，在步驟(1)中，于非質(zhì)子性溶劑，例如二甲基甲酰胺(dmf)、四氫呋喃(thf)、二氯甲烷(dcm)等溶劑中進行聚合。根據(jù)本公開的另一實施方案，反應溫度通常為室溫(25℃)，反應時間則視單體和所意欲的聚合度而定，從幾十分鐘到幾十小時不等，如20分鐘、40分鐘、1小時、10小時、15小時、20小時、25小時、30小時等。根據(jù)本公開的一實施方案，可以將由步驟(1)獲得的含有碳結構的聚氨基酸進行后修飾，包括：將所得的聚氨基酸與調(diào)節(jié)劑混合并反應，由此得到經(jīng)后修飾的聚氨基酸。根據(jù)本公開的另一實施方案，所述調(diào)節(jié)劑為巰基乙胺鹽酸鹽或巰基丙酸。根據(jù)本公開的又一實施方案，所述后修飾過程可在紫外燈照射下反應一段時間，例如1小時、3小時、5小時、10小時等，本領域技術人員可以根據(jù)具體反應進程而定。根據(jù)本公開的其他實施方案，后修飾在溶液中進行，例如含非質(zhì)子性溶劑的溶液，如二甲基甲酰胺(dmf)、四氫呋喃(thf)、二氯甲烷(dcm)等，而且，所述溶液還可以包含光敏劑，以促進反應進行，例如安息香二甲醚(dmpa)等。根據(jù)本公開的一實施方案，步驟(2)包括：將步驟(1)中得到的聚氨基酸與含有1,2-巰基乙胺結構(如n端半胱氨酸，或者在c端或其他任意位置插入含有1,2-巰基乙胺結構的非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)混合，室溫下發(fā)生自然化學連接(nativechemicalligation)反應，得到位點特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，如下所示：其中ptn、r1、r2和n如上文對通式1所定義。根據(jù)本公開的另一實施方案，步驟(2)包括：將步驟(1)中得到的聚氨基酸與含有1,2-巰基乙胺結構(如n端半胱氨酸，或者在c端或其他任意位置插入含有1,2-巰基乙胺結構的非天然氨基酸)的蛋白質(zhì)混合，室溫下發(fā)生自然化學連接反應，得到位點特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物，如下所示：其中ptn、r1和n如上文對通式1所定義。根據(jù)本公開的一實施方案，在步驟(2)中采用ph為6.5-7.0反應溶液，通常會加入還原劑tcep(三(2-羧乙基)膦)，但也不是必要的。上述方法利用r5xy引發(fā)一種n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到含有碳結構的聚氨基酸paa-xr5，paa-xr5再與含有1,2-巰基乙胺結構的蛋白質(zhì)混合，室溫下發(fā)生自然化學連接反應，得到位點特異的蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)物。以三甲基硅基苯硫酚引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐聚合為例，該過程如圖1所示。通過標準的分子克隆方法可以在蛋白質(zhì)的n端插入半胱氨酸-甘氨酸(n末端為半胱氨酸殘基，甘氨酸殘基作為連接增加n端的靈活性)，或者利用tag和琥珀酰氨酰合成酶/trna的方法(參見文獻nguyen,d.p.；elliott,t.；holt,m.；muir,t.w.；chin,j.w.,geneticallyencoded1,2-aminothiolsfacilitaterapidandsite-specificproteinlabelingviaabio-orthogonalcyanobenzothiazolecondensation.jamchemsoc2011,133(30),11418-21.)插入側(cè)鏈帶有1,2-巰基乙胺結構的非天然氨基酸，以進行后續(xù)的位點特異的蛋白質(zhì)-聚氨基酸偶聯(lián)反應。制備蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物的方法根據(jù)本公開的一實施方案，提供了制備本文所述的位點特異性蛋白質(zhì)-聚氨基酸環(huán)狀偶聯(lián)物的方法，包括：(1)利用引發(fā)劑引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和甘氨酸的n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結構、n端具有聚甘氨酸嵌段結構的嵌段聚氨基酸；(2)將所得到的嵌段聚氨基酸與n端半胱氨酸、c端具有l(wèi)pxatg序列的蛋白質(zhì)混合，連續(xù)發(fā)生自然化學連接反應和轉(zhuǎn)肽酶反應，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的環(huán)化。根據(jù)本公開的一實施方案，步驟(1)包括：利用引發(fā)劑(r5xy)引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和甘氨酸的n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結構、n端具有聚甘氨酸嵌段結構的嵌段聚氨基酸，如下所示：其中r1、r5、x、y、m和n如上文對通式6所定義。根據(jù)本公開的另一實施方案，步驟(1)包括：利用引發(fā)劑(r5xy)引發(fā)n-羧基內(nèi)酸酐和另一種n-羧基內(nèi)酸酐聚合，得到c端具有苯基硫酯結構、n端具有聚甘氨酸嵌段結構的嵌段聚氨基酸，如下所示：其中x、r1、r2、r5、n和m如上文對通式6所定義；y代表氫或三烷基硅基，其中三烷基硅基中的烷基優(yōu)選為c1-c10烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等。根據(jù)本公開的一實施方案，步驟(2)包括：將步驟(1)得到的嵌段聚氨基酸(以h-(gly)mpaa-xr5為例)與n端半胱氨酸、c端具有l(wèi)pxatg(xa為任一氨基酸)序列的蛋白質(zhì)混合，連續(xù)發(fā)生自然化學連接反應和轉(zhuǎn)肽酶反應，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的環(huán)化，如下所示：上述lpxatg序列是轉(zhuǎn)肽酶的識別位點，嵌段聚氨基酸與所述蛋白質(zhì)的氮端半胱氨酸發(fā)生連接反應，然后在轉(zhuǎn)肽酶的作用下實現(xiàn)環(huán)化。為便于蛋白質(zhì)的后續(xù)純化，可以在反應前的蛋白質(zhì)c末端加上多聚組氨酸標簽(his-tag)，環(huán)化后通過鎳親和層析的方法純化。根據(jù)本公開的一個實施方案，通過質(zhì)粒構建在egfp基因序列的n端插入煙草蝕紋病毒蛋白酶(tobaccoetchvirusprotease,tev)的酶切序列enlyfq，在其c端插入lpetg序列，以進行tev催化的偶聯(lián)反應，具體的蛋白質(zhì)氨基酸序列見序列表中seqidno：1。嵌段聚氨基酸c端通過自然化學連接與n端帶有半胱氨酸的蛋白質(zhì)進行偶聯(lián)，其n端在轉(zhuǎn)肽酶的作用下與蛋白質(zhì)c端的lpetg偶聯(lián)，其反應如圖2所示。根據(jù)本公開聚合而得的氨基酸序列可以由任意水溶性氨基酸組成，涵蓋天然、非天然、l型、d型氨基酸等，因此較生物表達的方式而言具有顯著的材料多樣性優(yōu)勢。同時，該聚合得到的α-聚氨基酸具有可控的分子量及分子量分布，因此可以根據(jù)實際需求來制備不同長度的多肽材料。根據(jù)本公開的方法可以原位賦予α-聚氨基酸c端的硫酯和n端的重復甘氨酸序列，它們可以通過非常高效的反應與蛋白質(zhì)相連，由此使得蛋白質(zhì)修飾成本大大降低，有著廣闊的應用前景。根據(jù)本公開的蛋白質(zhì)-高分子雜化材料不僅繼承了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-高分子雜化材料的優(yōu)點，如將具有特殊性質(zhì)(如熱響應性、光響應性等)的高分子于蛋白質(zhì)的連接，使得蛋白質(zhì)-高分子雜化材料具有一定的功能性和響應性。此外，蛋白質(zhì)的降解通常是在c端或者n端發(fā)生，通過高分鏈將其兩端連接進行環(huán)化可以降低蛋白質(zhì)被降解的速率，增加其穩(wěn)定性，延長其血液循環(huán)時間。因此，本公開為蛋白質(zhì)藥物提供了十分廣闊的應用前景。實施例以下的實施例便于更好的理解本公開的內(nèi)容，而不旨在對其作出任何限定。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到，所利用的質(zhì)粒均通過標準分子克隆的方法得到。實施例1：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p1的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,40.0mg,0.131mmol,20當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當量)，室溫攪拌25小時后將反應液倒入40ml乙醚溶液中，析出的白色沉淀即為產(chǎn)品。離心得到固體產(chǎn)品，傾倒出上清液并再次用40ml乙醚沖洗產(chǎn)品，離心得到固體后傾倒上清液并用真空烘箱干燥，得到無色透明膠狀固體30mg(產(chǎn)率72％)，其保存于-20℃冰箱中。以與上述方法類似的方法合成平均聚合度為7的聚l-谷氨酸(乙二醇)3酯，只需將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐投料量改為13mg即可，反應后加入乙酸酐(1.33mg,2.0當量)封端，按照上述方法后處理，maldi-tof質(zhì)譜表征如圖3所示。實施例2：用于蛋白環(huán)化的嵌段聚氨基酸p2的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,13.0mg,0.044mmol,7當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(13.1μl×0.5m，1.0當量)，在室溫下攪拌25小時后加入甘氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐(n2,2.0mg,0.0197mmol,3當量)，繼續(xù)在室溫攪拌2小時，后處理方式與實施例1相同。實施例3：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p4的合成在手套箱中將磷酸乙酯-l-酪氨酸n-羧基內(nèi)酸酐(n3,100mg,0.291mmol,20當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(29.1μl×0.5m，1.0當量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同。將上述聚氨基酸(p3,80mg,0.0133mmol,1.0當量)溶解于二氯甲烷(1.5ml)中，并依次加入三乙胺(300μl,2.1mmol)和三甲基溴硅烷(360μl,2.7mmol)。將反應液加熱至60℃并攪拌8小時，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干溶劑后將產(chǎn)物溶解于去離子水中(4ml)，并加入edta(10mg)，用氫氧化鈉水溶液(1m)將ph調(diào)至中性，并用氯化鈉水溶液透析(1000damwco,3次)。溶液凍干后得到淡黃色固體p460mg(產(chǎn)率83％)。實施例4：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p5的合成在手套箱中將l-谷氨酸-4-丙烯氧基芐酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n4,300mg,0.952mmol,50當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(3.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(38.0μl×0.5m，1.0當量)，室溫攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同。最終得到無色透明膠狀固體200mg(產(chǎn)率69％)。實施例5：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p6的合成將實施例4中制備的聚氨基酸(p5,50mg,0.173mmol,1.0當量按雙鍵的物質(zhì)的量計算)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中；將巰基乙胺鹽酸鹽(118mg,1.04mmol,6.0當量)溶解于去離子水中(200μl)；混合兩份溶液并加入安息香二甲醚(0.89mg,3.46×10-3mmol,0.02當量)，搖勻后置于365nm紫外燈下反應3小時。反應結束后將溶液倒入異丙醇中(40ml)，離心收集沉淀。真空烘箱干燥后得到無色透明粘稠膠狀固體32mg(產(chǎn)率53％)。實施例6：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p7的合成將實施例1中制備的聚氨基酸(p1,50mg,0.173mmol,1.0當量按雙鍵的物質(zhì)的量計算)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中；將巰基丙酸(110mg,1.04mmol,6.0當量)溶解于去離子水中(200μl)；混合兩份溶液并加入安息香二甲醚(0.89mg,3.46×10-3mmol,0.02當量)，搖勻后置于365nm紫外燈下反應3小時。后處理方式與實施例5相同，最終得到淡黃色透明膠狀固體33mg(產(chǎn)率51％)。實施例7：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p8的合成在手套箱中將l-谷氨酸-丙烯基(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n5,200mg,0.580mmol,50當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(23.2μl×0.5m，1.0當量)，室溫攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同，最終得到無色透明膠狀固體160mg(產(chǎn)率82％)。實施例8：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸的后修飾將實施例7中制備的聚氨基酸(p8,50mg,0.155mmol,1.0當量)按雙鍵的物質(zhì)的量計算)溶解于n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)中；將巰基乙胺鹽酸鹽(113mg,0.94mmol,6.0當量)溶解于去離子水中(200μl)；混合兩份溶液并加入安息香二甲醚(0.84mg,3.30×10-3mmol,0.02當量)，搖勻后置于365nm紫外燈下反應6小時。反應結束后將溶液用去離子水稀釋至5ml，用脫鹽柱pd10分兩次處理，凍干后無色透明膠狀固體25mg(產(chǎn)率46％)。實施例9：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p10的合成在手套箱中將n-甲基-n-羧基內(nèi)酸酐(n6,15.0mg,0.131mmol,20當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當量)，室溫攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同。最終得到白色固體7mg(產(chǎn)率78％)。實施例10：用于蛋白偶聯(lián)的嵌段聚氨基酸p11的合成在手套箱中將l-芐氧羰基賴氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐(n7,100.3mg,0.328mmol,50當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的dmf溶液(13.1μl×0.5m，1.0當量)，在室溫下攪拌25小時后加入l-谷氨酸芐酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n8,86.1mg,0.328mmol,50當量)，繼續(xù)在室溫攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同。實施例11：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p12的合成在手套箱中將l-芐氧羰基賴氨酸-n-羧基內(nèi)酸酐(n7,100.3mg,0.328mmol,50當量)溶解于無水四氫呋喃(1.0ml)中，并加入三甲基硅基苯硫酚的四氫呋喃溶液(13.1μl×0.5m，1.0當量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同。由于在四氫呋喃中引發(fā)劑引發(fā)效率低，因此實際得到的聚合物聚合度偏大，理論聚合度為300。實施例12：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p13的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,13.0mg,0.131mmol,20當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入三甲基錫基苯硒酚的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同。實施例13：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p14的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,13.0mg,0.131mmol,20當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入2-巰基乙烷磺酸鈉的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同。實施例14：用于蛋白偶聯(lián)的聚氨基酸p15的合成在手套箱中將l-谷氨酸(乙二醇)3酯-n-羧基內(nèi)酸酐(n1,13.0mg,0.131mmol,20當量)溶解于無水n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)中，并加入巰基丙酸的dmf溶液(13.6μl×0.5m，1.0當量)，在室溫下攪拌25小時，后處理方式與實施例1相同。在以下表1中示出上述實施例中制備的聚合物的表征參數(shù)，并且所示出的實際測量值均是至少三次測量所得的數(shù)值的平均值。詳言之，所有聚合物的分子量及分子量分布系數(shù)(pdi)都由凝膠排阻色譜(gpc)結合9角度激光光散射儀測得，所用流動相為添加0.1m溴化鋰的無水n,n-二甲基甲酰胺。表1聚合物分子量及分子量分布聚合物編號理論聚合度實際聚合度實際分子量pdip1202056001.12p210922001.03p3201947001.05p55052173001.08p85049135001.06p10202015001.07p1110099239001.03p12300305670001.14p135050139001.08p145048134001.15p155046130001.06由上表可見，所有聚合物的實際分子量都與理論分子量接近，并且分子量分布很窄，說明聚合過程的可控性優(yōu)異。實施例15：環(huán)狀(多肽-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)偶聯(lián)物的制備將實施例2中制備的聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)(3.8mg,1.72μmol,2.0當量)與n端帶有半胱氨酸的多肽(cys-pep,1.8mg,0.86μmol,1.0當量，序列為cgdakglpetghhhhhhk)溶解于超純水中，用氫氧化鈉水溶液(1.0m)調(diào)節(jié)ph至7.0，室溫反應12小時。經(jīng)過ninta親和純化后，用脫鹽柱pd10處理后凍干得到自然化學連接產(chǎn)物白色粉末2.6mg(產(chǎn)率74％)。將自然化學連接產(chǎn)物溶解于含有氯化鈉(150mm)和氯化鈣(10mm)的tris-hcl緩沖液中(50mm,5.0ml,ph～7.4)，并加入轉(zhuǎn)肽酶(sortase)a(150μl×227μm,0.05當量)，室溫反應0.5小時后，環(huán)狀多肽-聚氨基酸偶聯(lián)物的粗產(chǎn)品用ninta提純(用緩沖液b洗脫，含有20mmtris-hcl,500mm氯化鈉,20mm咪唑,ph～8.0)。收集洗脫下來的組分并用脫鹽柱pd10處理。凍干后得到白色粉末環(huán)狀(多肽-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物純品1.6mg，產(chǎn)率82％。產(chǎn)物經(jīng)過maldi-tof表征，分子量與理論值一致，如圖4所示。實施例16：enlyfqc-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6(enlyfq-cys-egfp-lpetgh6)的表達及純化將n端編碼有enlyfq和c端編碼有l(wèi)petghhhhhh的質(zhì)粒pet-tev-cys-egfp通過化學轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌(e.coli)bl21中。菌種在10ml添加有100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中復蘇10～12小時，然后1:100接種至1l添加有100μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，在250rpm，37℃的條件下?lián)u至od600＝0.8，加入終濃度為1mm的異丙基硫代半乳糖苷誘導細菌表達，培養(yǎng)條件改為250rpm，30℃。5小時后6500rpm，4℃離心40min收集菌體。用20ml的緩沖液a(20mmtris-hcl,500mmnacl,ph8.0)懸菌，在冰浴條件下超聲(130w,20khz,50％功率，超聲5秒，暫停10秒，超聲時間為10min)裂解。裂解液先后經(jīng)過6500rpm,40min和12000g,40min兩步4℃離心，收集上清液，用0.22μm濾膜過濾，經(jīng)ninta親和柱純化，其中，平衡緩沖液為50mmtris，500mmnacl，ph8.0，洗脫液為添加有300mmm咪唑的上述平衡液。最后得到48mg目的蛋白(其序列見序列表中seqidno：1)，并經(jīng)過uplc-ms進行確認(參見圖5)，計算值為31324，得到31333。分子量誤差(9道爾頓)在誤差允許范圍(10道爾頓)內(nèi)，因此可確認所得到的蛋白為目的蛋白tev-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6。實施例17：含有1,2-巰基乙胺結構位點特異的增強型綠色熒光蛋白(egfp)的表達步驟1：1,2-巰基乙胺非天然氨基酸的合成將化合物1(233mg,1.00mmol,1.0當量)溶解于無水四氫呋喃中(20ml)，加入n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc,206mg,1.00mmol,1.0當量)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs,115mg,1.00mmol,1.0當量)，在室溫下攪拌3小時后過濾除去固體，濾液旋干后，經(jīng)柱色譜分離，洗脫劑為二氯甲烷∶乙酸乙酯＝5∶1(體積比)到純乙酸乙酯。得到白色固體化合物2(264mg,產(chǎn)率80％)。將化合物2(264mg,0.80mmol,1.0當量)溶解于n,n-二甲基甲酰胺中(20ml)，加入boc-lys-oh(246mg,0.80mmol,1.0當量)和三乙胺(0.2ml)，室溫攪拌3小時后旋干溶劑，經(jīng)柱色譜分離，洗脫劑為二氯甲烷到二氯甲烷∶甲醇＝10∶1(體積比)。得到無色油狀液體化合物3(221mg，產(chǎn)率60％)。將化合物3(221mg,0.48mmol,1.0當量)溶解于氯化氫的二氧六環(huán)溶液中(10ml)，室溫攪拌過夜后產(chǎn)品析出，抽慮得到產(chǎn)品，即化合物4(1,2-巰基乙胺非天然氨基酸)，其經(jīng)ph調(diào)節(jié)后，用于后續(xù)實驗。步驟2：增強型綠色熒光蛋白的表達將蛋白質(zhì)基因序列的特定位點突變?yōu)閠ag的質(zhì)粒(原蛋白序列詳見序列表seqidno：2(c端帶有his6標簽)，其第149位的天冬氨酸n對應的密碼子突變?yōu)閠ag，得到特定位點突變的基因序列)和攜帶有琥珀酰氨酰合成酶/trna的質(zhì)粒通過化學轉(zhuǎn)化的方法同時轉(zhuǎn)入大腸桿菌(e.coli)bl21中。菌種在10ml添加有100μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)基中復蘇10～12小時，然后接種至1l添加有100μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素的lb培養(yǎng)基中，在250rpm，37℃的條件下培養(yǎng)2小時后加入終濃度為2mm的非天然氨基酸4，搖至od600＝0.8，加入終濃度為1mm的異丙基硫代半乳糖苷誘導細菌表達，培養(yǎng)條件改為250rpm，30℃。12小時后6500rpm，4℃離心40min收集菌體。用20ml的緩沖液a(20mmtris-hcl,500mmnacl,ph8.0)懸菌，在冰浴條件下超聲裂解。裂解液先后經(jīng)過6500rpm,40min和12000g,40min兩步4℃離心，收集上清液，用0.22μm濾膜過濾，ninta純化方法同實施例16。實施例18enlyfqc-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6(enlyfq-cys-egfp-lpetgh6)的酶切在透析袋(mwco3000)中加入1ml蛋白質(zhì)溶液(12mg/ml)、5μl煙草蝕紋病毒蛋白酶(0.2mg/ml)和10μl10x緩沖液b(500mm磷酸鈉、5mmedta和10mmdtt)。將透析袋置于1l緩沖液b(50mm磷酸鈉、0.5mmedta和1mmdtt)中在室溫下透析酶切。酶切3小時后得到蛋白cys-egfp-lpetgh6(其氨基酸序列即序列表中seqidno：1去除n端的“menlyfq”后的序列)并經(jīng)過uplc-ms確認(參見圖6)，計算值為30398，得到30404。分子量誤差(6道爾頓)在誤差允許范圍(10道爾頓)內(nèi)，因此可確認所得到的酶切后的蛋白為目的蛋白cys-綠色熒光蛋白-lpetgh6。實施例19：cys-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6與聚氨基酸p1(n＝7)的自然化學連接反應(蛋白質(zhì)n端偶聯(lián))1當量的cys-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6與2當量的聚氨基酸p1(n＝7)在50mmtris-hcl,2mm三(2-羧乙基)膦的溶液(ph～6.5)中進行自然化學連接反應，反應10h后經(jīng)過快速蛋白液相色譜(fplc)純化，得到位點特異的蛋白質(zhì)高分子雜化材料，并經(jīng)過變性蛋白質(zhì)凝膠電泳(sds-pagegel)表征其分子量變化和非變性蛋白質(zhì)凝膠電泳(nativesds-pagegel)表征其純度。如圖7所示，在sds-pagegel中，聚氨基酸-增強型綠色熒光蛋白偶聯(lián)物條帶相對于原料蛋白質(zhì)向分子量大處遷移，說明聚氨基酸接枝成功，而變性和非變性凝膠電泳中聚氨基酸-增強型綠色熒光蛋白偶聯(lián)物都為均一的單條帶(二聚體為相同的單體蛋白在天然狀態(tài)下通過物理相互作用形成的)，說明產(chǎn)物純度較高，其中產(chǎn)率為50％～65％。實施例20：enlyfqc-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6與聚乙二醇-聚甘氨酸在轉(zhuǎn)肽酶介導下的偶聯(lián)(sortasemediatedligation，蛋白質(zhì)c端偶聯(lián))1當量的enlyfqc-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6(1mg/ml，300μl)、5當量的聚乙二醇-聚甘氨酸(10mm,53μl)和0.1當量的轉(zhuǎn)肽酶(4.9mg/ml,52μl)加入到200μl含有150mmnacl和10mmcacl2的50mmtris-hclph7.4緩沖液中。室溫反應30min,經(jīng)ninta親和純化，分離得到產(chǎn)物enlyfqc-增強型綠色熒光蛋白-聚乙二醇-聚甘氨酸偶聯(lián)物。平衡緩沖液為50mmtris，500mmnacl，ph8.0,上樣即開始收集流脫緩沖液，繼而用50mmtris，500mmnacl，20mm咪唑，ph8.0洗脫，得到溶解有產(chǎn)物的洗脫液，再用50mmtris，500mmnacl，300mm咪唑，ph8.0的緩沖液清洗樹脂，洗脫未反應的蛋白質(zhì)原料。enlyfqc-增強型綠色熒光蛋白-聚乙二醇-聚甘氨酸偶聯(lián)物通過變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(sds-pagegel)表征其分子量，非變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(nativesds-pagegel)表征其純度。如圖8所示，在sds-pagegel中，enlyfqc-增強型綠色熒光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇偶聯(lián)物條帶相對于原料蛋白質(zhì)向分子量大處遷移，說明聚氨基酸接枝成功，而在變性和非變性凝膠電泳中聚氨基酸-增強型綠色熒光蛋白偶聯(lián)物為均一的單條帶，說明產(chǎn)物純度較高，其中產(chǎn)率為56％。實施例21：聚氨基酸p1(n＝7)-增強型綠色熒光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇節(jié)點狀偶聯(lián)物的制備以兩步驟，依次根據(jù)實施例19和20所述的反應和純化方法，制備聚氨基酸p1(n＝7)-增強型綠色熒光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇節(jié)點狀偶聯(lián)物。中間產(chǎn)物聚氨基酸p1(n＝7)-增強型綠色熒光蛋白和節(jié)點狀偶聯(lián)物均經(jīng)過變性和非變性蛋白質(zhì)凝膠電泳表征(參見圖9)。產(chǎn)物的分子量逐步向蛋白質(zhì)分子量高出位移說明高分子先后均接枝成功，且單一條帶表明產(chǎn)物純度較高。兩步產(chǎn)率分別為65％和50％。實施例22：增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α啞鈴狀偶聯(lián)物的制備1當量的增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6(6.5mg)、10當量的聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)(6.6mg)和0.1當量的轉(zhuǎn)肽酶(0.5mg)加入到1ml含有150mm氯化鈉和10mm氯化鈣的tris-hcl緩沖液(50mm,ph7.5)中,室溫反應30min。參照實施例21的純化方法純化得到增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)偶聯(lián)物，產(chǎn)率為55％。繼而將增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)偶聯(lián)物與cys-干擾素α參照實施例21進行自然化學連接得到增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-干擾素α啞鈴狀偶聯(lián)物，產(chǎn)率為50％。中間產(chǎn)物和啞鈴狀偶聯(lián)物均經(jīng)過變性和非變性蛋白質(zhì)凝膠電泳進行分子量和純度的表征(參見圖10)。偶聯(lián)物分子量逐步向高分子量處位移，且增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸-干擾素α啞鈴狀偶聯(lián)物分子量根據(jù)蛋白質(zhì)分子量標尺分布在43kda～55kda之間，符合預期的增強型綠色熒光蛋白(～31kda)和干擾素α(～21kda)異質(zhì)雙蛋白分子量加和范圍(～52kda)，因此可確認得到的是增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸-干擾素α異質(zhì)雙蛋白啞鈴狀偶聯(lián)物。通過單一條帶可確認產(chǎn)物純度較高。實施例23：環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物的制備參照實施例19利用自然化學連接制備聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物。將1當量的聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物(0.42mg)與0.1當量的轉(zhuǎn)肽酶混合在含有150mm氯化鈉和10mm氯化鈣的50mmtris-hcl,ph7.5的緩沖液中，控制聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物的終濃度為50mm，室溫反應30min，反應結束后參照實施例22進行分離純化，產(chǎn)率約為42％。利用基質(zhì)輔助激光解離-飛行時間質(zhì)量分析器(maldi-tof)、變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳和免疫印跡分析(westernblot)來表征環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物。聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物的碳端比環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物多出7個氨基酸(即，ghhhhhh)。因此利用maldi-tof分析，聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白-lpetgh6偶聯(lián)物環(huán)化后的分子量整體低于環(huán)化前(理論是1160da，實際算的～1206da)，直接表明增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)形成環(huán)狀偶聯(lián)物。此外，變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(sds-pagegel)中，環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))由于分子量減小和拓撲結構的變化，條帶位置會向分子量低處位移，免疫印跡分析表明組氨酸標簽(his-tag)消失，進一步表明成功得到了環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物，具體分析結果參見圖11。實施例24：cys-增強型綠色熒光蛋白、聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白、環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物的羧肽酶穩(wěn)定性測試控制cys-增強型綠色熒光蛋白、聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白和環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物在50mmph7.4的tris-hcl緩沖液中終濃度為4.0mg/ml，羧肽酶的終濃度為80μg/ml，當量比為egfp的0.01當量，37℃孵育。在設定的時間點，取樣(5μl)與上樣緩沖液混合，95℃煮樣10min，終止酶切反應。待最后一個時間點完成取樣后，所有樣品同時跑膠，利用蛋白質(zhì)凝膠電泳進行表征?？捡R斯亮藍染色和脫色完成后，利用typhoonflalaserscanner對蛋白質(zhì)進行定量。如圖12所示，圖a、b、c分別為cys-增強型綠色熒光蛋白、聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白和環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))偶聯(lián)物在羧肽酶的作用下隨時間延長的降解情況。通過typhoonflalaserscanner根據(jù)染色后條帶的強度對蛋白進行定量，在相同的羧肽酶比例下，野生型增強型綠色熒光蛋白在1小時內(nèi)基本全部降解，而聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)-增強型綠色熒光蛋白在3小時處只剩20％左右完整的偶聯(lián)物，相比之下，環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3)偶聯(lián)物)則在7小時才開始觀察到一定程度的降解。因此，相比于線狀的拓撲結構，環(huán)狀(增強型綠色熒光蛋白-聚氨基酸p2(n＝7,m＝3))在酶耐受性上表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢。實施例25：藥物蛋白enlyfqcg-干擾素-lpetgleh6(tev-cys-ifnα-lpetgh6)的表達及純化將n端編碼有menlyfqcg和c端編碼lpetglehhhhhh的質(zhì)粒pet-tev-cys-ifnα-lpetgleh6通過化學轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌(e.coli)origamib(de3)中。菌種在10ml添加有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中復蘇10～12小時，然后接種至1l添加有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，在250rpm，37℃的條件下?lián)u至od600＝0.8，加入終濃度為1.0mm的異丙基硫代半乳糖苷誘導細菌表達，培養(yǎng)條件改為200rpm，30℃。過夜培養(yǎng)后6500rpm，4℃離心30min收集菌體。用20ml的緩沖液a(20mmtris-hcl,500mmnacl,ph8.0)重懸菌體，在冰浴條件下超聲裂解。裂解液先后經(jīng)過6500rpm,40min和12000g,40min兩步4℃離心，收集上清液，用0.22μm濾膜過濾，經(jīng)ninta親和柱純化得到98mg目標蛋白，并經(jīng)過uplc-ms進行確認，計算的理論分子量為21918,得到21914。分子量誤差(4道爾頓)在誤差允許范圍(10道爾頓)內(nèi)，因此可確認所得到的蛋白為目的蛋白tev-cys-ifnα-lpetgh6。實施例26：藥物蛋白enlyfqcg-干擾素-lpetgleh6(tev-cys-ifnα-lpetgleh6)的酶切在透析袋(mwco3000)中加入1ml蛋白質(zhì)溶液(12mg/ml)、5μl煙草蝕紋病毒蛋白酶(0.2mg/ml)和10μl10x緩沖液b(500mm磷酸鈉、5mmedta和10mmdtt)。將透析袋置于1l緩沖液b(50mm磷酸鈉、0.5mmedta和1mmdtt)中在室溫下透析酶切。酶切3小時后得到蛋白cys-egfp-lpetgh6并經(jīng)過uplc-ms確認(參見圖13)，計算值為20991，得到20987。分子量誤差(6道爾頓)在誤差允許范圍(10道爾頓)內(nèi)，因此可確認所得到的酶切后的蛋白為目的蛋白cys-干擾素α-lpetgh6。實施例27：藥物蛋白cys-干擾素-lpetgleh6與不同長度聚氨基酸的自然化學連接反應1當量的目的蛋白cys-ifnα-lpetgleh6與3當量的聚氨基酸phs-p(oeg3-glu)100(l型，p1(n＝100))在50mmtris-hcl,2mmdtt的溶液(ph～7.4)中進行自然化學連接反應，反應10小時后經(jīng)過快速蛋白液相色譜(fplc)純化，得到位點特異的p(oeg3-l-glu)100-ifnα偶聯(lián)物。聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α偶聯(lián)物通過15％變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳(sds-pagegel)表征其分子量和純度。如圖14所示，在sds-pagegel中，聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α偶聯(lián)物條帶相對于原料蛋白質(zhì)向分子量大處遷移，說明聚氨基酸接枝成功，且偶聯(lián)物為均一的單條帶，說明產(chǎn)物純度較高，其中產(chǎn)率為70％。或者，以與上述相同的方法和條件，進行藥物蛋白cys-干擾素α-lpetgleh6與聚氨基酸phs-p(oeg3-glu)100(d,l型氨基酸)和聚氨基酸p2(phs-p(oeg3-glu)n-gly3(n＝7或20,m＝3))自然化學連接反應，得到的偶聯(lián)物經(jīng)fplc純化后，通過15％變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳表征。如圖14所示，聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物條帶相對于原料蛋白質(zhì)均向分子量大處遷移，說明聚氨基酸接枝成功，其中產(chǎn)率為70％～80％。實施例28：cys-干擾素α-lpetg的n,c兩端分別與不同長度聚氨基酸的位點特異性偶聯(lián)采用實施例27中的產(chǎn)物聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α-lpetgleh6和聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)在轉(zhuǎn)肽酶的作用下，在20mmtris-hcl,150mmnacl,10mmcacl2的緩沖液中進行轉(zhuǎn)肽酶介導的轉(zhuǎn)肽反應，反應體系經(jīng)過ninta柱分離純化得到n,c兩端都位點特異偶聯(lián)聚氨基酸的產(chǎn)物聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α-lpet-聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)。產(chǎn)物經(jīng)過15％變性膠蛋白質(zhì)凝膠電泳和免疫印跡分析表征。在免疫印跡分析中，如圖14所示，由于標簽his-tag的離去，產(chǎn)物的抗his標簽信號消失表明干擾素α的n,c兩均成功接枝聚氨基酸。實施例29：聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6偶聯(lián)物的環(huán)化反應聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6偶聯(lián)物在轉(zhuǎn)肽酶的作用下，在20mmtris-hcl,150mmnacl,10mmcacl2的緩沖液中進行環(huán)化反應，經(jīng)過ninta柱分離純化得到環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α-lpetgleh6)。如圖15所示，干擾素α與聚氨基酸的環(huán)狀拓撲結構的形成可通過sds-page膠中條帶相對與環(huán)化前的偶聯(lián)物像分子量低處位移，且其相對應的免疫印跡分析中anti-his信號的消失來確認。實施例30：聚氨基酸p1(n＝100)-ifnα與環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-ifnα)的熱穩(wěn)定性測試本實施例中，所采用的目的蛋白為重組人干擾素α，可以通過染料syproorange來測定蛋白質(zhì)融化溫度(tm值)，該種染料會結合隨溫度升高引起的蛋白構象變化而暴露的疏水區(qū)，從而熒光發(fā)射強度有較大變化。野生型ifnα及各種與聚氨基酸的偶聯(lián)物的tm值。5μl200×寶石橙蛋白染料(thermo)和45μl(5μm)的待測蛋白混合在1×pbs緩沖液中，共50μl反應體系，加到96孔板中，平行三個孔加樣，在熒光定量pcr儀中檢測，從37度以2.2℃/min的速度加熱到98℃，根據(jù)所得曲線計算各蛋白質(zhì)樣品的tm值。如圖16所示為各蛋白質(zhì)樣品的tm值，從中可判斷各種偶聯(lián)物的熱穩(wěn)定性，tm值越高則其熱穩(wěn)定性越好。其中聚氨基酸p1(n＝100)-干擾素α偶聯(lián)物和環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α)表現(xiàn)出十分優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，尤其環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝7或20,m＝3)-干擾素α)的熱穩(wěn)定性相比于目前各文獻和專利報道中最好的。實施例31：各種聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的胰蛋白酶耐受性測試本實施例中，以野生型重組人干擾素α為對照，對本公開的聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的胰蛋白酶耐受性進行測試。37℃下，加入0.01當量的胰蛋白酶處理樣品，在不同時間點取樣檢測剩余的完整蛋白比例，結果如圖17所示，根據(jù)蛋白條帶的強度進行定量，得到的數(shù)據(jù)繪制成曲線圖(如圖17所示)，從曲線圖b、c中，可以發(fā)現(xiàn)隨著偶聯(lián)物所采用的聚氨基酸的分子量增大，所得到的偶聯(lián)物對胰蛋白酶的耐受性也隨之增強，且根據(jù)圖a所示，在相近分子量的偶聯(lián)物中，拓撲結構為環(huán)狀的偶聯(lián)物的胰蛋白酶耐受性要明顯強于未環(huán)化的偶聯(lián)物。實施例32：野生型干擾素wt-ifnα與聚氨基酸p1(n＝100l型或n＝100d,l型)-ifnα偶聯(lián)物的圓二色譜測試本實施例中，使用的聚氨基酸p(oeg3-glu)n(l型)單獨具有明顯的以α螺旋為主的二級結構，所以將其與ifnα偶聯(lián)后會對ifnα的二級結構造成一定的影響。配成0.35mg/mlpbs蛋白溶液通過圓二色譜監(jiān)測二級結構的變化，測試證明，ifnα-聚氨基酸偶聯(lián)物明顯增強了ifnα的二級結構，結果如圖18所示。實施例33：野生型干擾素α與各種聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的體外活性測試本實施例中，采用對daudi細胞的生長抑制及其誘導a549細胞抗腦心肌炎病毒(emcv)的活性兩方面來分別判斷各種聚氨基酸-干擾素α的體外抗腫瘤及抗病毒活性的保留。采用對ifnα敏感的人b淋巴瘤細胞系daudi來作為實驗細胞系，檢測各種聚氨基酸-干擾素α的體外抗腫瘤活性。具體實驗步驟為：5000個細胞/孔鋪板至96孔板中，將蛋白質(zhì)及其與聚氨基酸的偶聯(lián)物稀釋至合適梯度加入到鋪有細胞的96孔板中，培養(yǎng)72小時之后，利用celltitercellviabilityassay(普洛麥格)檢測細胞活力，利用graphpadprism處理相關數(shù)據(jù)得到各樣品的半數(shù)抑制量ic50。實驗證明，不同拓撲結構的聚氨基酸-ifnα偶聯(lián)物抗腫瘤活性有較大不同，具體數(shù)據(jù)表2所示。表2中，具有二級結構的聚氨基酸與干擾素α偶聯(lián)后對其活性影響最小，且優(yōu)于已經(jīng)在臨床應用中的干擾素α-聚乙二醇偶聯(lián)物佩樂能(peg-intron)，環(huán)狀偶聯(lián)物次之。由此可見，通過調(diào)整干擾素α-聚氨基酸偶聯(lián)物的二級結構或者拓撲結構可在增強其熱穩(wěn)定及酶耐受性的同時最大程度的保留其活性。本實驗通過檢測聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物刺激后的a549細胞抵抗腦心肌炎病毒(emcv)的活性來判斷其體外的抗病毒活性。具體測定步驟為：將a549細胞儀8000～10000個細胞/孔的密度鋪板至黑色不透明的96孔板中，24小時后，待細胞完全貼壁，加入梯度稀釋于10％fbs，dmem培養(yǎng)基中(10μg/ml,3倍比稀釋，共14個濃度點)的聚氨基酸-干擾素偶聯(lián)物(100μl/孔)，與細胞共孵育24小時后，吸走蛋白液，加入一定濃度的emcv病毒液(稀釋至2％fbs，dmem培養(yǎng)基中，加入病毒的量須確保未加蛋白的細胞48小時后全部病變)，以未加蛋白和病毒的孔為細胞存活100％的對照，以未加蛋白只加病毒的孔為細胞存活0％的對照，48小時后利用celltiterluminescentcellviabilityassay(普洛麥格)檢測細胞活力，以判斷各種偶聯(lián)物的抗病毒活性。表2實施例34：wt-ifnα與各聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的血藥濃度測定本實施例中，采用sd雌性大鼠作為動物活體實驗對象，對sd大鼠進行頸靜脈插管手術，恢復48小時后，按150μg/kg的劑量通過靜脈插管注射待測樣品，每種藥物實驗數(shù)量為3只，分別在1min,15min,30min,1h,3h,6h,9h,12h,24h,48h,72h小時取血。冰上保存半小時后，4000g離心取上清保存于-80℃。血清通過elisa方法檢測其中的ifnα含量，各蛋白質(zhì)樣品在血液中的濃度變化曲線如圖19所示，其中血藥濃度半衰期(t1/2)如表2所示。蛋白聚氨基酸偶聯(lián)物表現(xiàn)出遠高于wt-ifnα2b的血藥濃度半衰期，并且偶聯(lián)有l(wèi)型聚氨基酸的偶聯(lián)物效果強(t1/2＝9.6h)與已在臨床應用的佩樂能幾乎一致(t1/2＝9.8h)，強于與偶聯(lián)有d,l型聚氨基酸的偶聯(lián)物(t1/2＝7.8h)，證明聚氨基酸的二級結構會調(diào)整蛋白聚氨基酸偶聯(lián)物整體的二級結構從而改善其的各種生物學性質(zhì)與功能。而環(huán)狀的聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的血液循環(huán)時間(t1/2＝7.5h)長于其環(huán)化前的血液循環(huán)時間(t1/2＝6.5h)，說明聚氨基酸-干擾素α偶聯(lián)物的拓撲結構對其血液循環(huán)同樣具有較大影響。實施例35：wt-ifnα,聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-ifnα偶聯(lián)物與環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-ifnα)偶聯(lián)物的體內(nèi)抗腫瘤活性本實施例中，以人卵巢癌腫瘤細胞ovcar-3為研究的腫瘤細胞系，在六周齡的balb/c雌性裸鼠體內(nèi)構建腫瘤模型。將細胞以107/200μl的密度懸浮在1640/基質(zhì)膠(1：1混合)中，200μl/只裸鼠注射入裸鼠右側(cè)前胸部皮下，三周后，腫瘤大小約為30mm3，將老鼠隨機分為四組，每組5只，分別注射pbs,wt-ifnα，聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-ifnα偶聯(lián)物與環(huán)狀(聚氨基酸p2(n＝20,m＝3)-ifnα)偶聯(lián)物，劑量為20μg干擾素α/只裸鼠，注射體積為100μl，給藥頻率為每周一次，每隔3天監(jiān)測一次腫瘤大小和裸鼠體重。實施例36：cys-人表皮生長因子受體2結合片段(cys-her2fab抗體)的表達及純化將攜帶有cys-her2fab(半胱氨酸插入到輕鏈的n端)抗體的質(zhì)粒通過化學轉(zhuǎn)化至top10大腸桿菌感受態(tài)細胞中，在10mllb培養(yǎng)基中37℃，250rpm活化過夜，按照1:100的比例接種至1ltb培養(yǎng)基中，在37℃,250rpm的條件下?lián)u至od600＝0.8左右，加入終濃度為0.2％的阿拉伯糖誘導蛋白表達，30℃，200rpm表達16～20h。表達結束后，6500rpm離心30min,收集菌體。加入150ml裂解液(30mmtris,1mmedta,ph8.0,20％蔗糖)，室溫下輕輕攪拌半個小時，使菌體均勻分散在裂解液中，加入終濃度為0.2mg/ml的溶菌酶,2.5u/l全能核酸酶，37℃，250rpm搖30min，裂解液先后經(jīng)過6500rpm和12000g離心各30min，每次都保留上清液。將上清液過0.22μm濾膜，經(jīng)過proteing樹脂純化，上樣后用醋酸鈉緩沖液(ph4.5)沖洗4～5個柱體積，50mm,ph2.8甘氨酸溶液(5～8個柱體積)洗脫抗體，得到cys-her2fab抗體。經(jīng)二硫蘇糖醇還原后利用uplc-ms確認蛋白的分子量。理論值抗體重鏈分子量為24305，輕鏈分子量為23674。經(jīng)儀器確認所得抗體重鏈分子量為24310，輕鏈分子量為23682，分子量與理論計算值相符合(誤差在允許范圍內(nèi))。因此可確認所得抗體為目標抗體。實施例37：聚氨基酸p1(n＝7)與cys-her2fab抗體通過自然化學連接的偶聯(lián)反應cys-her2fab(5mg/ml，50μl，1.0當量)與聚氨基酸p1(n＝7)(30當量)混合，室溫反應10～12小時?；旌衔锝?jīng)過fplc純化，得到聚氨基酸p1(n＝7)-her2fab抗體偶聯(lián)物，經(jīng)過蛋白質(zhì)凝膠電泳表征其純度和分子量。經(jīng)二硫蘇糖醇還原后抗體的重鏈和輕鏈解開，得到分子量約減半的條帶，如圖21所示。純化后得到的產(chǎn)物相對于反應前的抗體均向高分子量處位移且還原前條帶均一，說明聚氨基酸接枝成功，且產(chǎn)物純度較高，其中產(chǎn)物產(chǎn)率為26％。由上可見，本公開的蛋白質(zhì)-高分子雜化材料具有制備工藝簡單、可控性高等特點，從而大幅降低蛋白質(zhì)類藥物的修飾成本，并且使其體內(nèi)性質(zhì)變得更加穩(wěn)定，進一步改善血液循環(huán)時間并有效地發(fā)揮生物學和藥理學效應。盡管參考特定的實施例來描述本文所述的實施方案，但是應當理解，本領域技術人員會對其作出多種調(diào)整和改變，只要其不違背本公開的范圍和主旨即可。sequencelisting<110>北京大學<120>聚氨基酸偶聯(lián)物<130>16c12155cn<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>275<212>prt<213>人工序列<400>1metgluasnleutyrpheglncysleuasnaspilepheglualagln151015lysileglutrphisglumetvalserlysglyglugluleuphethr202530glyvalvalproileleuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhis354045lyspheservalserglygluglygluglyaspalathrtyrglylys505560leuthrleulyspheilecysthrthrglylysleuprovalprotrp65707580prothrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncyspheserarg859095tyrproasphismetlysglnhisaspphephelysseralametpro100105110gluglytyrvalglngluargthrilephephelysaspaspglyasn115120125tyrlysthrargalagluvallysphegluglyaspthrleuvalasn130135140argilegluleulysglyileaspphelysgluaspglyasnileleu145150155160glyhislysleuglutyrasntyrasnserhisasnvaltyrilemet165170175alaasplysglnlysasnglyilelysvalasnphelysilearghis180185190asnilegluaspglyservalglnleualaasphistyrglnglnasn195200205thrproileglyaspglyprovalleuleuproaspasnhistyrleu210215220serthrglnseralaleuserlysaspproasnglulysargasphis225230235240metvalleuleugluphevalthralaalaglyilethrleuglymet245250255aspgluleutyrlysleuprogluthrglyglyleugluhishishis260265270hishishis275<210>2<211>246<212>prt<213>人工序列<400>2metglylysglyglugluleuphethrglyvalvalproileleuval151015gluleuaspglyaspvalasnglyhislyspheservalserglyglu202530glygluglyaspalathrtyrglylysleuthrleulyspheilecys354045thrthrglylysleuprovalprotrpprothrleuvalthrthrphe505560sertyrglyvalglncyspheserargtyrproasphismetlysarg65707580hisaspphephelysseralametprogluglytyrvalglngluarg859095thrileserphelysaspaspglyasntyrlysthrargalagluval100105110lysphegluglyaspthrleuvalasnargilegluleulysglyile115120125aspphelysgluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasn130135140tyrasnserhisasnvaltyrilethralaasplysglnlysasngly145150155160ilelysalaasnphelysilearghisasnilegluaspglyserval165170175glnleualaasphistyrglnglnasnthrproileglyaspglypro180185190valleuleuproaspasnhistyrleuserthrglnseralaleuser195200205lysaspproasnglulysargasphismetvalleuleuglupheval210215220thralaalaglyilethrhisglymetaspgluleutyrlysglypro225230235240hishishishishishis245<210>3<211>187<212>prt<213>人工序列<400>3metgluasnleutyrpheglncysglycysaspleuproglnthrhis151015serleuglyserargargthrleumetleuleualaglnmetargarg202530ileserleuphesercysleulysasparghisasppheglyphepro354045glngluglupheglyasnglnpheglnlysalagluthrileproval505560leuhisglumetileglnglnilepheasnleupheserthrlysasp65707580serseralaalatrpaspgluthrleuleuasplysphetyrthrglu859095leutyrglnglnleuasnaspleuglualacysvalileglnglyval100105110glyvalthrgluthrproleumetlysgluaspserileleualaval115120125arglystyrpheglnargilethrleutyrleulysglulyslystyr130135140serprocysalatrpgluvalvalargalagluilemetargserphe145150155160serleuserthrasnleuglngluserleuargserlysgluleupro165170175gluthrglyleugluhishishishishishis180185當前第1頁12