本發(fā)明屬于藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種基于介孔二氧化硅SBA-15的固體自乳化制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

口服給藥作為最常見、最簡單的給藥途徑，是大多數(shù)慢性疾病患者最容易接受的給藥方式。藥物經(jīng)口服進(jìn)入胃腸道之后首先需要通過溶解過程，釋放出藥物分子，才能透過胃腸道的上皮黏膜層被機(jī)體吸收，實(shí)現(xiàn)分布、代謝和排泄過程，進(jìn)而發(fā)揮藥效。因此，溶解度是新化學(xué)實(shí)體從發(fā)現(xiàn)到開發(fā)為活性藥物的重要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)溶解度與滲透性的不同，生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(Biopharmaceutical classification system,BCS)通常將藥物分為以下四類：I類，高溶解度、高滲透性；II類，低溶解度、高滲透性；III類，高溶解度、低滲透性；IV類，低溶解度、低滲透性。

其中，對(duì)于溶解度低、滲透性高的BCS II類藥物，其在消化道的溶出過程通常成為該類藥物吸收的限速環(huán)節(jié)。BCS II類藥物的溶解度差導(dǎo)致的生物利用度低是藥理活性物質(zhì)不能成為治療藥物的主要原因。研究表明，BCS II類藥物在上市藥物中所占比例為40％，而在研發(fā)中藥物這一比例達(dá)到了70％。因此，有效提高BCS II類藥物的溶解度和溶出速率是改善其口服生物利用度的關(guān)鍵步驟。

自乳化制劑(Self-emulsifying drug delivery system,SEDDS)作為一種脂質(zhì)藥物傳遞系統(tǒng)，由藥物、油相、表面活性劑和助表面活性劑組成，可在胃腸道蠕動(dòng)下可自發(fā)形成納米級(jí)別的O/W型乳滴，顯著增加難溶性藥物的溶出速率和吸收表面積，有效提高藥物的生物利用度，為實(shí)現(xiàn)難溶性藥物的有效傳遞提供了一種很好的解決方法。

傳統(tǒng)SEDDS通常以液體狀態(tài)包封于軟膠囊或可以填充液體的硬膠囊中，生產(chǎn)過程復(fù)雜，導(dǎo)致生產(chǎn)成本相對(duì)較高；同時(shí)脂質(zhì)成分與膠囊囊殼之間可能存在相容性問題，長期儲(chǔ)存后可能導(dǎo)致囊殼脆裂引起藥物的泄露；此外，傳統(tǒng)液體自乳化系統(tǒng)劑型單一，缺乏腸溶和緩控釋等方向的劑型，不能適用于胃刺激性大、胃液中不穩(wěn)定、給藥次數(shù)較多的難溶性藥物。

固體自乳化制劑(Solid self-emulsifying drug delivery system,SSEDDS)是通過在液態(tài)的SEDDS體系中加入適當(dāng)?shù)墓腆w吸收劑將其進(jìn)行固化得到的自乳化制劑，兼具固體制劑(穩(wěn)定性好、儲(chǔ)存方便、順應(yīng)性好)與液體自乳化制劑(提高溶出和生物利用度)的雙重優(yōu)勢，并克服了液體自乳化系統(tǒng)存在的諸多缺點(diǎn)。固化過程是制備SSEDDS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該過程的核心在于選擇合適的載體材料對(duì)液體自乳化各組分進(jìn)行有效地固化吸附。目前SSEDDS體系中常用的固化載體包括水不溶的硅基材料(200等)及水溶性聚合物、多糖等，這些應(yīng)用在一定程度上提高了固化效率，但最終形成的制劑中藥物的有效負(fù)載率依然較低，因此開發(fā)具有優(yōu)良固化能力的新型載體材料成為固體自乳化制劑研究中亟待解決的難題。

介孔二氧化硅作為一種新型的無機(jī)多孔材料，具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性及生理惰性，其具有較高的比表面積、孔容積、均一的孔道排列等顯著特征，孔道部分可容納大量的客體分子或大尺寸分子。SBA-15(Santa Barbara Amorphous-15)于1998年首次報(bào)道合成，其合成路線簡單、重復(fù)性好、孔徑分布較廣、孔壁較厚。SBA-15以兩親性三嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(PEO20-PPO70-PEO20,P123)為模板劑，正硅酸乙酯TEOS為無機(jī)硅源，在酸性條件下催化合成。SBA-15具有較寬的孔徑，對(duì)多種客體分子負(fù)載的限制因素較少，同時(shí)較厚的孔壁結(jié)構(gòu)使其具有更好的水熱穩(wěn)定性。介孔二氧化硅作為難溶性藥物載體，可顯著改善藥物的溶出速率，提高體內(nèi)生物利用度，其原理可分為以下幾點(diǎn)：

(1)介孔二氧化硅具有較大的比表面積和孔容積，對(duì)藥物分子具有極強(qiáng)的分散作用，可將難溶性藥物以分子狀態(tài)或無定型態(tài)吸附于孔道內(nèi)部，無定型藥物由于沒有晶格束縛，自由能較大，更易溶于介質(zhì)，從而提高藥物的溶解度及溶出速率；

(2)介孔二氧化硅的孔道結(jié)構(gòu)不易變形，當(dāng)難溶性藥物以高能量的無定型態(tài)裝載至孔道內(nèi)部后，分子的空間取向被納米尺寸的孔道所限制，使得孔道中藥物分子無法聚集成核，晶核無法長大，重結(jié)晶被有效抑制，使藥物的無定型狀態(tài)維持穩(wěn)定；

(3)介孔二氧化硅具有長程有序的孔道結(jié)構(gòu)，溶出介質(zhì)可通過毛細(xì)管作用進(jìn)入孔道內(nèi)部，SBA-15的孔徑較大，溶出介質(zhì)更易進(jìn)入孔道內(nèi)部，進(jìn)一步提高藥物分子在釋放介質(zhì)的擴(kuò)散。

目前，針對(duì)介孔二氧化硅在難溶性藥物傳遞系統(tǒng)的應(yīng)用僅局限于單一藥物分子的負(fù)載，如何深入開發(fā)介孔二氧化硅優(yōu)越的性能，并將其應(yīng)用于多組分共傳遞體系是開發(fā)新型難溶性藥物傳遞系統(tǒng)的過程中必須解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新型的難溶性藥物固體自乳化制劑及其制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

一種固體自乳化制劑，由介孔二氧化硅SBA-15與難溶性藥物液體自乳化傳遞系統(tǒng)(Self-emulsifying drug delivery system,SEDDS)制備而成，所述液體自乳化傳遞系統(tǒng)由質(zhì)量比為1～2:1～4:1～4:3～6的難溶性藥物、油相、乳化劑、和助乳化劑組成，所述難溶性藥物液體自乳化傳遞系統(tǒng)與介孔二氧化硅SBA-15的質(zhì)量比為1～4:1。

在其中一些實(shí)施例中，所述難溶性藥物液體自乳化傳遞系統(tǒng)與介孔二氧化硅SBA-15的質(zhì)量比為2～3:1。

在其中一些實(shí)施例中，所述液體自乳化傳遞系統(tǒng)與介孔二氧化硅SBA-15的質(zhì)量比為3:1。

在其中一些實(shí)施例中，所述難溶性藥物、油相、乳化劑、和助乳化劑的質(zhì)量比為1.5～2:2～3:2～3:3～4。

在其中一些實(shí)施例中，所述難溶性藥物、油相、乳化劑和助乳化劑的質(zhì)量比為1.5:2.55:2.55:3.4。

在其中一些實(shí)施例中，所述難溶性藥物為BCS II類藥物，其溶解度低，脂溶性高。

在其中一些實(shí)施例中，所述難溶性藥物為非諾貝特、塞來昔布、或卡馬西平。

在其中一些實(shí)施例中，所述油相為單辛酸甘油酯、油酸、油酸乙酯、中鏈甘油三酸酯、三甘油辛酸/癸酸酯、丙烯基乙二醇月癸酸酯中的一種或幾種。

在其中一些實(shí)施例中，所述乳化劑為Tween 80、聚氧乙烯油酸酯、乙氧基聚氧乙烯甘油酯、聚乙二醇甘油酯中的一種或幾種。

在其中一些實(shí)施例中，所述助乳化劑為乙醇、丙二醇、聚乙二醇(PEG)、異丙醇、甘油、乙二醇單乙基醚(Transcutol)、二甲基異山梨酯中的一種或幾種。

在其中一些實(shí)施例中，所述液體自乳化傳遞系統(tǒng)由難溶性藥物、油酸乙酯、Cremophor RH40和Transcutol HP組成。

本發(fā)明還提供了上述固體自乳化制劑的制備方法，采取了以下技術(shù)方案：

一種固體自乳化制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將油相、乳化劑、助乳化劑混合均勻，得到均一澄清的油狀溶液；將難溶性藥物加入上述油狀溶液中，混合均勻后，于30～40℃水浴平衡待藥物完全溶解，即得該難溶性藥物的液體自乳化傳遞系統(tǒng)，所述難溶性藥物、油相、乳化劑和助乳化劑的質(zhì)量比為1～2:1～4:1～4:3～6；

(2)以P123為模板劑，TEOS為硅源，在酸性條件下合成介孔二氧化硅SBA-15；

(3)將步驟(1)的難溶性藥物的液體自乳化傳遞系統(tǒng)，加入無水乙醇，室溫?cái)嚢柘?，加入介孔二氧化硅SBA-15，保持?jǐn)嚢?0～30h使其達(dá)到吸附平衡，于35～50℃烘干除去溶劑，即得所述固體自乳化制劑，所述難溶性藥物的液體自乳化傳遞系統(tǒng)與介孔二氧化硅SBA-15的質(zhì)量比為1～4:1。

本發(fā)明的基于介孔二氧化硅SBA-15的固體自乳化制劑是聯(lián)合介孔二氧化硅SBA-15和液體自乳化傳遞系統(tǒng)，采用介質(zhì)分散法制備得到的，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的固體自乳化制劑中的液體自乳化傳遞系統(tǒng)是通過三相圖的繪制，選擇合適的油相、乳化劑和助乳化劑及其特定的比例構(gòu)建而得的，該液體自乳化傳遞系統(tǒng)在口服進(jìn)入胃腸道后，在胃腸道的蠕動(dòng)下可在較短時(shí)間內(nèi)自發(fā)形成粒徑為100nm左右的O/W型乳滴，并將難溶性藥物包裹于其中，顯著提高了藥物的溶解度和吸收表面積，促進(jìn)難溶性藥物的吸收速度和程度，最終提高藥物的生物利用度，同時(shí)可有效避免水不穩(wěn)定藥物的水解破壞；

2、本發(fā)明的固體自乳化制劑選用介孔二氧化硅SBA-15作為固體載體裝載液體自乳化傳遞系統(tǒng)，SBA-15的合成路線簡單、重復(fù)性好、孔徑分布較廣、孔壁較厚，對(duì)多種客體分子負(fù)載的限制因素較少，同時(shí)較厚的孔壁結(jié)構(gòu)使其具有更好的水熱穩(wěn)定性，且具有更加優(yōu)良的固化能力；

3、本發(fā)明的固體自乳化制劑是采用介質(zhì)分散法對(duì)液體自乳化體系進(jìn)行固化得到的，固體自乳化制劑乳化能力好、穩(wěn)定性好，難溶性藥物以無定型態(tài)分布于載體材料中，與原料藥和商品制劑相比，固體自乳化制劑顯著提高藥物的釋放，提高藥物的體內(nèi)生物利用度，且在較長的時(shí)間內(nèi)可保持良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性；

4、本發(fā)明的固體自乳化制劑首次將介孔二氧化硅應(yīng)用于多組分系統(tǒng)的傳遞，拓寬了介孔二氧化硅在藥物傳遞領(lǐng)域的應(yīng)用。

附圖說明

圖1A-B分別為實(shí)施例1制備的介孔二氧化硅SBA-15的掃描電鏡圖(A)以及透射電鏡圖(B)；

圖2為實(shí)施例1制備的介孔二氧化硅SBA-15的小角X-射線粉末衍射圖；

圖3為實(shí)施例1制備的介孔二氧化硅SBA-15的N₂吸附-脫吸附等溫曲線及孔徑分布曲線圖；

圖4為實(shí)施例1中制備的非諾貝特固體自乳化體系的N₂吸附-脫吸附等溫曲線及孔徑分布曲線圖；

圖5A-C分別為實(shí)施例1中制備的空白SEDDS(A)、非諾貝特液體SEDDS(B)和非諾貝特固體SEDDS(C)重新乳化后的乳劑外觀；

圖6A-C分別為實(shí)施例1中制備的介孔二氧化硅SBA-15(A)、非諾貝特原料藥(B)、非諾貝特固體SEDDS(C)的掃描電鏡圖；

圖7為非諾貝特原料藥、SBA-15、非諾貝特與SBA-15的物理混合物、固體自乳化制劑的廣角XRD結(jié)果；

圖8為實(shí)施例1制備的介孔二氧化硅SBA-15及商品化的膠態(tài)二氧化硅200的N₂吸附-脫吸附等溫曲線及孔徑分布曲線圖；

圖9為非諾貝特原料藥、實(shí)施例1中制備的非諾貝特液體SEDDS、非諾貝特固體SEDDS及商品制劑的體外溶出情況(n＝3)；

圖10A-B分別為實(shí)施例1中制備的非諾貝特固體SEDDS和非諾貝特原料藥及商品制劑在AP→BL透過Caco-2細(xì)胞單層膜的累積透過量(A)，以及實(shí)施例1中制備的非諾貝特固體SEDDS和非諾貝特原料藥及商品制劑在BL→AP透過Caco-2細(xì)胞單層膜的累積透過量(B)；

圖11為各制劑跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中AP→BL方向TEER隨時(shí)間的變化結(jié)果(n＝3)；

圖12為實(shí)施例1中制備的非諾貝特固體SEDDS、非諾貝特原料藥和市售制劑在Beagle犬體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線；

圖13為實(shí)施例1中制備的非諾貝特固體SEDDS在加速穩(wěn)定條件下不同時(shí)間點(diǎn)的體外溶出結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步敘述本發(fā)明，本發(fā)明未述及之處適用于現(xiàn)有技術(shù)。下面給出本發(fā)明的具體實(shí)施例，但實(shí)施例僅是為了進(jìn)一步詳細(xì)敘述本說明，并不限制本發(fā)明的權(quán)利要求。

以下實(shí)施例中，如無特殊說明，原料均來源于市售。

實(shí)施例1基于介孔二氧化硅SBA-15的非諾貝特固體自乳化制劑

本實(shí)施例的非諾貝特固體自乳化制劑的構(gòu)建方法包括如下步驟：

1、非諾貝特液體自乳化體系的構(gòu)建

精密稱取油相(油酸乙酯)2.5502g、乳化劑(Cremophor RH40)2.5499g、助乳化劑(Transcutol HP)3.4000g渦旋混合均勻，得到均一澄清的油狀溶液；精密稱取1.5001g的非諾貝特，加入上述制備好的油狀溶液(空白自乳化溶液)中，渦旋混合均勻后，于37℃水浴平衡待藥物完全溶解，即得非諾貝特液體自乳化體系。

2、介孔二氧化硅SBA-15的制備

精密稱取8.0g模板劑P123，加入365mL鹽酸溶液(2mol/L)，40℃攪拌12h待其形成均一的體系。保持?jǐn)嚢杷俾屎愣?300rpm)，逐滴加入17.53gTEOS，水解反應(yīng)24h。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至單頸圓底燒瓶，密封，100℃下靜置晶化48h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)5000rpm離心后得到白色固體，用大量的水離心洗滌至中性后，再用無水乙醇洗滌兩次，所得產(chǎn)物在60℃真空干燥。干燥后樣品置于電阻爐，以10℃/min的速率升溫至550℃，煅燒10h除去模板劑，最后得到介孔二氧化硅SBA-15產(chǎn)品。

采用掃描電鏡以及透射電鏡分別對(duì)合成的介孔二氧化硅SBA-15的表面形貌以及孔道結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。方法如下：將該步驟制備的介孔二氧化硅SBA-15樣品分散置于導(dǎo)電膠一側(cè)，導(dǎo)電膠另一側(cè)粘在金屬臺(tái)板上，樣品固定噴金涂膜后在掃描電鏡下觀察，加速電壓為20-30Kv。測試樣品研細(xì)后用無水乙醇，超聲分散后得到懸浮液。取少量樣品液滴加在銅網(wǎng)上，室溫?fù)]干溶劑后，在透射電鏡下觀察，電子束加速電壓為100Kv。結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，所制備的介孔二氧化硅SBA-15呈蠕蟲狀條狀分布，相互粘附生長在一起，其長條粒子尺寸均一，平均長度約為1μm。透射電鏡可見在垂直于孔軸方向上具有明顯的蜂窩狀二維六方孔道結(jié)構(gòu)，孔道分布均勻且高度整齊有序。

采用小角X-射線粉末衍射對(duì)合成的介孔二氧化硅SBA-15的孔道規(guī)整度進(jìn)行表征，采用Cu靶Kα射線，光管電壓40Kv，掃描范圍0.5-6°，掃描速率為0.5°/min，步長0.02。結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示，在低衍射角處(2θ約為0.84°)出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的衍射峰，對(duì)應(yīng)衍射晶面(100)；在高衍射角處(2θ約為1.50°、1.72°)出現(xiàn)兩個(gè)較弱的衍射峰，分別對(duì)應(yīng)衍射晶面(110)、(200)。該三個(gè)衍射峰的出現(xiàn)表明合成的SBA-15具有典型的六方介孔結(jié)構(gòu)，圖中衍射晶面為(100)的衍射峰峰型尖銳峰值較高，表明合成的SBA-15的孔道高度有序。

采用N₂吸附-脫吸附進(jìn)一步對(duì)合成的介孔二氧化硅SBA-15表征孔道結(jié)構(gòu)特征。將本實(shí)施例制備的介孔二氧化硅SBA-15樣品在60℃脫氣12h后，在77K下獲得吸附-脫附等溫線，通過BET(Brunauer-Emmett-Teller)方程計(jì)算比表面積，BJH(Barrett-Joyner-Halenda)方程根據(jù)吸附-脫附等溫線脫附分支計(jì)算平均孔徑，t-plot方法計(jì)算孔容積。結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示，樣品呈現(xiàn)典型的Ⅳ型氮?dú)馕?脫附等溫線，兩條曲線互不重合形成了滯留回環(huán)，表明合成樣品具有介孔結(jié)構(gòu)。SBA-15的氮?dú)馕降葴鼐€突越明顯，說明所得介孔二氧化硅SBA-15的孔徑分布窄，孔容較大。SBA-15的孔徑分布結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)介孔二氧化硅的孔徑分布較窄，集中分布于9nm左右。

3、非諾貝特固體自乳化體系的構(gòu)建

稱取3.0g步驟1的非諾貝特液體自乳化體系，加入10mL無水乙醇，室溫?cái)嚢柘拢尤?.0g的介孔二氧化硅SBA-15，保持?jǐn)嚢?4h使其達(dá)到吸附平衡，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，于40℃烘干除去溶劑，即得非諾貝特固體自乳化制劑。

實(shí)施例2基于介孔二氧化硅SBA-15的非諾貝特固體自乳化制劑的構(gòu)建

本實(shí)施例的非諾貝特固體自乳化制劑的構(gòu)建方法包括如下步驟：

1、非諾貝特液體自乳化體系的構(gòu)建

精密稱取油相(油酸乙酯)2.5502g、乳化劑(Cremophor RH40)2.5501g、助乳化劑(Transcutol HP)3.4000g渦旋混合均勻，得到均一澄清的油狀溶液。精密稱取1.5000g的非諾貝特，加入上述制備好的空白自乳化溶液(即油狀溶液)，渦旋混合均勻后，于37℃水浴平衡待藥物完全溶解，即得非諾貝特液體自乳化體系。

2、介孔二氧化硅SBA-15的制備

按照實(shí)施例1的方法制備介孔二氧化硅SBA-15。

3、非諾貝特固體自乳化制劑的構(gòu)建

稱取2.0g非諾貝特液體SEDDS，加入10mL無水乙醇，室溫?cái)嚢柘?，加?.0g的SBA-15。保持?jǐn)嚢?4h使其達(dá)到吸附平衡，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，于40℃烘干除去溶劑，即得非諾貝特固體自乳化制劑。

實(shí)施例3基于介孔二氧化硅SBA-15的塞來昔布固體自乳化制劑的構(gòu)建

本實(shí)施例的塞來昔布固體自乳化制劑的構(gòu)建方法包括如下步驟：

1、塞來昔布液體自乳化體系的構(gòu)建

精密稱取油相(油酸乙酯)2.0005g、乳化劑(Cremophor RH40)2.0003g、助乳化劑(Transcutol HP)4.0001g渦旋混合均勻，得到均一澄清的油狀溶液。精密稱取2.0000g的塞來昔布，加入上述制備好的空白自乳化溶液(即油狀溶液)，渦旋混合均勻后，于37℃水浴平衡待藥物完全溶解，即得塞來昔布液體自乳化體系。

2、介孔二氧化硅SBA-15的制備

按照實(shí)施例1的方法制備介孔二氧化硅SBA-15。

3、塞來昔布固體自乳化制劑的構(gòu)建

稱取2.0g塞來昔布液體SEDDS，加入10mL無水乙醇，室溫?cái)嚢柘?，加?.0g的SBA-15。保持?jǐn)嚢?4h使其達(dá)到吸附平衡，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，于40℃烘干除去溶劑，即得塞來昔布固體自乳化制劑。

對(duì)比例1基于膠態(tài)二氧化硅200的非諾貝特固體自乳化制劑的構(gòu)建

本對(duì)比例的非諾貝特固體自乳化制劑的構(gòu)建方法包括如下步驟：

1、非諾貝特液體自乳化體系的構(gòu)建

按照實(shí)施例1的方法構(gòu)建非諾貝特液體自乳化體系。

2、基于膠態(tài)二氧化硅200的非諾貝特固體自乳化制劑的構(gòu)建

稱取2.0g非諾貝特液體SEDDS，加入10mL無水乙醇，室溫?cái)嚢柘?，加?.0g的200。保持?jǐn)嚢?4h使其達(dá)到吸附平衡，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，于40℃烘干除去溶劑，即得非諾貝特固體自乳化制劑。

試驗(yàn)例1實(shí)施例1～2和對(duì)比例1的非諾貝特固體自乳化制劑的表征

取4g實(shí)施例1的非諾貝特固體自乳化制劑，加入200mL水，轉(zhuǎn)速為50rpm，待其完全乳化，所得樣品靜置過夜，取上清液進(jìn)行粒徑測定。重新乳化后，樣品呈澄清淡藍(lán)色乳劑，在用紅色激光束照射時(shí)，乳劑表現(xiàn)出明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象，表明其粒度均一(圖5)。實(shí)施例1中所制備的固化自乳化制劑重新分散后形成的乳劑粒徑為117.35±2.33nm。

對(duì)實(shí)施例1所制備的非諾貝特固體自乳化制劑進(jìn)行氮?dú)馕?脫附分析，根據(jù)全自動(dòng)比表面積分析儀獲得材料的孔道類型、比表面積、孔徑和孔容積等詳細(xì)信息。固體自乳化制劑樣品在60℃脫氣12h后，在77K下獲得吸附-脫附等溫線，通過BET(Brunauer-Emmett-Teller)方程計(jì)算比表面積，BJH(Barrett-Joyner-Halenda)方程根據(jù)吸附-脫附等溫線脫附分支計(jì)算平均孔徑，t-plot方法計(jì)算孔容積。由圖4可見，液體自乳化體系經(jīng)SBA-15固化后，氮?dú)馕搅考眲∠陆担?脫附等溫線類型發(fā)生變化。SBA-15的孔徑集中分布于6-9nm，負(fù)載自乳化體系后，孔徑分布減小至2-4nm。進(jìn)一步采用BET、BJH等方程計(jì)算SBA-15的比表面積、孔容積和平均孔徑分別為595.01m²/g、1.02cm³/g、9.19nm，而SBA-15負(fù)載液體自乳化體系后，比表面積、孔容積和平均孔徑分別下降至27.47m²/g、0.05cm³/g、3.40nm。以上結(jié)果表明，藥物及液體自乳化成分被固化吸附至SBA-15的孔道內(nèi)部。

對(duì)實(shí)施例1所制備的非諾貝特固體自乳化制劑采用掃描電鏡對(duì)其表面形貌進(jìn)行表征，將少量樣品分散置于導(dǎo)電膠一側(cè)，導(dǎo)電膠另一側(cè)粘在金屬臺(tái)上，樣品固定噴金涂膜后在掃描電鏡下觀察，加速電壓為20-30Kv。掃描電鏡結(jié)果(圖6)顯示，對(duì)比SBA-15的蠕蟲狀條狀和非諾貝特原料藥的不規(guī)則塊狀晶體，固體自乳化制劑呈不規(guī)則顆粒，在固體自乳化制劑樣品中未見到非諾貝特晶體存在，表明非諾貝特以無定形態(tài)分布于固化載體中。

對(duì)實(shí)施例1所制備的非諾貝特固體自乳化制劑采用廣角X射線粉末衍射對(duì)固體自乳化體系中藥物結(jié)晶形態(tài)進(jìn)行表征。采用Cu靶Kα射線，光管電壓40Kv，掃描范圍5-40°，掃描速率為5°/min，步長0.02。結(jié)果顯示(圖7)，SBA-15為無定型態(tài)，在5-40°范圍內(nèi)無明顯特征峰；非諾貝特原料藥在10-40°范圍內(nèi)出現(xiàn)晶體特征峰；物理混合物在10-40°內(nèi)出現(xiàn)了非諾貝特晶體特征峰，但由于非諾貝特的含量較低，峰值相對(duì)較?。还腆w自乳化制劑在5-40°范圍內(nèi)均未出現(xiàn)非諾貝特晶體特征峰，進(jìn)一步證實(shí)非諾貝特以無定型態(tài)分布于固體自乳化制劑中。

取4g實(shí)施例2的非諾貝特固體自乳化制劑，加入200mL水，轉(zhuǎn)速為50rpm，待其完全乳化，所得樣品靜置過夜，取上清液進(jìn)行粒徑測定。重新乳化后，樣品呈澄清淡藍(lán)色乳劑，在用紅色激光束照射時(shí)，乳劑表現(xiàn)出較明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象，表明其粒度均一。實(shí)施例2中所制備的固化自乳化制劑重新分散后形成的乳劑粒徑為138.17±2.42nm。

當(dāng)液體SEDDS與200的質(zhì)量比為2:1時(shí)，只能得到粘稠狀SEDDS，表明此時(shí)200不能將液體SEDDS完全固化。

試驗(yàn)例2實(shí)施例1和對(duì)比例1的介孔二氧化硅SBA-15和膠態(tài)二氧化硅200的表征

根據(jù)全自動(dòng)比表面積分析儀獲得材料的孔道類型、比表面積、孔徑和孔容積等詳細(xì)信息。介孔二氧化硅SBA-15和膠態(tài)二氧化硅200在60℃脫氣12h后，在77K下獲得吸附-脫附等溫線，通過BET(Brunauer-Emmett-Teller)方程計(jì)算比表面積，BJH(Barrett-Joyner-Halenda)方程根據(jù)吸附-脫附等溫線脫附分支計(jì)算平均孔徑，t-plot方法計(jì)算孔容積。SBA-15與200的氮?dú)馕?脫附曲線如圖8所示，SBA-15呈現(xiàn)典型的Ⅳ型氮?dú)馕?脫附等溫線，兩條曲線互不重合形成了滯留回環(huán)，表明合成樣品具有介孔結(jié)構(gòu)。200呈現(xiàn)出Ⅲ型吸附-脫附曲線，該類型曲線表明樣品具有非孔或大孔結(jié)構(gòu)。由孔徑分布結(jié)果可知(圖8)，SBA-15孔徑集中分布于6-9nm，而200在2-50nm內(nèi)均未見峰值出現(xiàn)，表明200無孔道結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步比較兩種材料的比表面積、孔容積及平均孔徑(表1)，SBA-15的比表面積為595.01m²/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于200(155.93m²/g)，因200無孔道結(jié)構(gòu)，故不能獲得具體的孔容積和孔徑數(shù)據(jù)。結(jié)合載體固化結(jié)果(試驗(yàn)例3)表明，SBA-15的孔道結(jié)構(gòu)在液體自乳化的固化過程發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

表1 SBA-15及200的結(jié)構(gòu)參數(shù)

試驗(yàn)例3實(shí)施例1的非諾貝特固體自乳化體系的體外溶出

根據(jù)中國藥典2010版(二部)附錄X C漿法規(guī)定，對(duì)實(shí)施例1所制備的非諾貝特固體自乳化制劑進(jìn)行藥物溶出試驗(yàn)，精密稱取約相當(dāng)于50mg非諾貝特的固體自乳化制劑樣品，平行三份以消除誤差。溶出介質(zhì)為經(jīng)脫氣處理的0.5％SDS溶液，介質(zhì)體積900mL，溫度37±0.5℃，轉(zhuǎn)速100rpm。取樣時(shí)間點(diǎn)分別為5、10、20、30、60、90、120min。每次取樣5mL，并補(bǔ)加5mL溶出介質(zhì)，樣品經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液在286nm處測定紫外吸收，并計(jì)算非諾貝特的累積釋放百分率。體外藥物溶出如圖9所示，固體自乳化制劑在30min藥物的累積釋放量即達(dá)到83.41％，而非諾貝特原料藥、非諾貝特商品制劑的2h后藥物的累積釋放量分別僅為43.95％和83.09％。

試驗(yàn)例4實(shí)施例1的非諾貝特固體自乳化體系的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)

對(duì)實(shí)施例1的非諾貝特固體自乳化體系的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞單層膜作為模擬胃腸道吸收以及藥物滲透轉(zhuǎn)運(yùn)研究的模型。

Caco-2細(xì)胞置于高糖培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10％的FBS、1％的青霉素-鏈霉素(100U/mL)以及5％非必需氨基酸，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基。在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部達(dá)到80-90％時(shí)，依據(jù)細(xì)胞密度通常按照1:4的比例進(jìn)行傳代。

采取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，建立Caco-2細(xì)胞單分子層模型，具體操作步驟如下：

(1)取鼠尾膠原工作液適量，加入4倍體積的甲醇混合均勻。取800μL上述溶液加至AP面，置于超凈工作臺(tái)室溫晾干，紫外照射過夜。

(2)分別加入500μL及1.5mL完全培養(yǎng)基至Transwell小室AP面及BL面，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育1h，以除去殘留有機(jī)溶劑。

(3)吸棄培養(yǎng)基，在AP面加入500μL的Caco-2細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2×10⁵個(gè)/孔。空白對(duì)照組僅加入完全培養(yǎng)基。置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育21天左右，第一周隔天更換培養(yǎng)基，從第二周開始每天更換培養(yǎng)基。

(4)從18天開始，采用EVOM²跨膜電阻儀測定細(xì)胞跨膜電阻(Transendothelial electrical resistance,TEER)，測量前先將STX2電極置于75％乙醇溶液浸泡約15min以除去細(xì)菌，取出待乙醇揮干后測定。若跨膜電阻值高于300Ω·cm²，表明細(xì)胞已完全融合成單層膜，單層膜具有良好的完整性和緊密性，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

將非諾貝特原料藥、實(shí)施例1制得的液體自乳化制劑及實(shí)施例1制得的固體自乳化制劑分別分散于Hank’s緩沖液，配置成藥物濃度為100μg/mL的供試品溶液。于Caco-2細(xì)胞單層模型進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)研究，具體操作步驟如下：

(1)取出Transwell板，用預(yù)熱至37℃的Hank’s緩沖液清洗細(xì)胞三次，分別在AP面及BL面加入500μL及1.5mL的Hank’s緩沖液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育半小時(shí)。

(2)對(duì)于頂層至底層(即AP→BL)的轉(zhuǎn)運(yùn)研究，AP面加入500μL測試樣品溶液，于BL面中加入1.5mL空白Hank’s緩沖液作為接收液。分別在10、20、30、60、90、120min時(shí)于BL面取樣1.0mL，并立即在BL面補(bǔ)加1.0mL的空白Hank’s液，以維持接收液體積恒定。采用HPLC測定FNB的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量，測定并記錄各時(shí)間點(diǎn)的跨膜電阻值。

(3)對(duì)于底層到頂層(即BL→AP)的轉(zhuǎn)運(yùn)研究，在AP面加入500μL空白Hank’s緩沖液，于BL面加入1.5mL測試樣品液，分別在上述時(shí)間點(diǎn)于AP面中取樣300μL，取樣之后立即補(bǔ)加相同體積的空白Hank’s緩沖液。采用HPLC測定FNB的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量，測定并記錄各時(shí)間點(diǎn)的跨膜電阻值。

當(dāng)受試樣品加于AP側(cè)時(shí)，藥物的累積過膜量如圖10A所示，隨著孵育時(shí)間的延長，非諾貝特原料藥、液體自乳化制劑、固體自乳化制劑中藥物的累積過膜量均呈現(xiàn)逐漸增加趨勢。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩種自乳化制劑的藥物累積過膜量均超過原料藥，固體自乳化制劑的累積過膜量略低于液體自乳化制劑。當(dāng)受試樣品加于BL側(cè)時(shí)，藥物的累積過膜量如圖10B所示，各制劑中藥物累積過膜量與AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)趨勢一致。

跨膜電阻(Transendothelial electrical resistance,TEER)的測定結(jié)果(圖11)顯示，以空白Hank’s緩沖液作為陰性對(duì)照，以能夠?qū)螌幽ぞo密連接產(chǎn)生破壞效應(yīng)的表面活性劑Triton X-100(1％PBS溶液)作為陽性對(duì)照，在單層膜頂端面加入Triton X-100之后，陽性對(duì)照組的TEER值急劇下降，而加入三種制劑之后，2h內(nèi)所測得的TEER值均未出現(xiàn)明顯的改變。由此推測三種待測樣品均沒有破壞Caco-2細(xì)胞單層膜的緊密連接，非諾貝特主要經(jīng)跨細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)而非細(xì)胞旁路途徑，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。

結(jié)果表明，在體外標(biāo)準(zhǔn)可控的Caco-2細(xì)胞單層模型試驗(yàn)中，一同濃度的FNB原料藥為對(duì)照，實(shí)施例1所制備的非諾貝特液體自乳化制劑和非諾貝特固體自乳化制劑均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的效果，三種制劑中的藥物均以跨細(xì)胞被動(dòng)擴(kuò)散方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。

試驗(yàn)例5實(shí)施例1的非諾貝特固體自乳化體系Beagle犬體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

實(shí)驗(yàn)方法：Beagle犬六只，普通級(jí)，雌雄各半，體重10±0.5kg，實(shí)驗(yàn)前未服用其它任何藥物。參比制劑為微粉化商品制劑膠囊(法國利博福尼制藥有限公司)，受試制劑為實(shí)施例1中制備的非諾貝特液體自乳化制劑和非諾貝特固體自乳化制劑。采取三制劑三交叉實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)。6只Beagle犬隨機(jī)分為三組，每組兩只，用于體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)前禁食(不禁水)12h，清洗期為兩周。每只Beagle犬分別給予相當(dāng)于100mg非諾貝特的膠囊、液體自乳化制劑和固體自乳化制劑。給藥后在固定時(shí)間點(diǎn)(0、0.25、0.50、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、24h)于后肢股靜脈取血4mL于含肝素鈉的負(fù)壓取血管中，混合均勻后5000rpm，離心5min，取上層血漿，于-20℃冰箱保存以待分析。取含藥血漿樣品0.5mL，精密加入50μL的內(nèi)標(biāo)吲哚美辛工作液(50μg/mL)，200μL濃度為1mol/L的鹽酸溶液，于渦旋器上振蕩混勻5min。再加入4mL無水乙醚，渦旋5min，8000rpm離心5min，取上清液，經(jīng)氮吹儀濃縮揮干溶劑。加入200μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋5min，經(jīng)16000rpm離心5min，取上清液，采用高效液相色譜分析非諾貝特酸的血液濃度。

色譜條件：色譜柱：Phenomenex C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈：0.1％醋酸＝65:35；檢測波長：286nm；流速：1mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：50μL。

不同的非諾貝特制劑在Beagle犬體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間變化曲線如圖12所示，由圖可知，自乳化制劑的血藥濃度顯著高于商品微粉化膠囊。在6h左右，三種制劑的血藥濃度輕微升高，推測部分藥物吸收后經(jīng)膽汁排泄進(jìn)入腸道，在腸道中又重新被吸收。此外，部分在胃腸道未被吸收的藥物，被增溶于O/W乳劑進(jìn)入空腸和回腸段，經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)途徑被吸收，進(jìn)而引起血藥濃度的輕微升高。

試驗(yàn)例6實(shí)施例1的非諾貝特固體自乳化體系的穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)實(shí)施例1制備的非諾貝特固體自乳化體系進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，考察條件：溫度30±2℃，相對(duì)濕度65±5％。考察指標(biāo)：外觀性狀、含量、自乳化行為、藥物溶出度。試驗(yàn)方法：取三批樣品，置于封口密閉的西林瓶中，放入恒溫(30±2)℃，相對(duì)濕度為(65±5)％的穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中6個(gè)月，于0、1、2、3個(gè)月取樣，按照規(guī)定考察項(xiàng)目檢查。

將樣品置于密閉的西林瓶中，于30℃RH 65％的條件下貯存3個(gè)月后，樣品仍維持白色疏松粉末狀，未出現(xiàn)任何異常的結(jié)塊等現(xiàn)象。兩種制劑在加速試驗(yàn)條件下放置3個(gè)月后，與0月相比，含量變化較小，表明所得制劑在此條件下穩(wěn)定。固體自乳化制劑在30℃RH 65％的條件下貯存3個(gè)月后，重新乳化后的粒徑、PDI、zeta電位存在輕微的波動(dòng)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無顯著性差異(P>0.05)。表明其在加速試驗(yàn)條件下放置3個(gè)月后，自乳化行為保持穩(wěn)定。固體自乳化制劑在30℃RH 65％的條件下貯存3個(gè)月后的體外溶出曲線(圖13)表明兩種制劑在加速試驗(yàn)條件下放置3個(gè)月后，與0月相比，累積釋放量變化較小，滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。