本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及拉西地平在制備治療沙粒病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

沙粒病毒是一類由嚙齒動物為宿主、能夠以多種方式感染并引起人類不同程度病死率疾病的RNA病毒，近來在非洲及南美洲出現(xiàn)局部流行。沙粒病毒是具有包膜的雙節(jié)段負鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形或多樣形，直徑50～300nm，電鏡下可以觀察到沙粒病毒的橫截面包含許多從宿主細胞中獲取的粒狀的核糖體，沙粒病毒因此得名。

沙粒病毒根據(jù)基因型、血清型和出現(xiàn)地區(qū)可分為兩種類型:舊世界型(the Old World group)和新世界型(the New World group)。舊世界型的病毒包括拉沙熱病毒和淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒，主要分布在西非；新世界型病毒包括Tacaribe病毒、Junín病毒、Machupo病毒，主要分布在美洲。

沙粒病毒感染是由沙粒病毒引起的疾病，疾病例如淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎、拉沙熱、阿根廷出血熱和玻利維亞出血熱等。前二者呈亞臨床型和輕型，后二者多表現(xiàn)為典型病例。這四者共同癥狀是緩慢進行性發(fā)熱，伴頭痛、肌痛、乏力、和感覺遲鈍，嚴(yán)重者出現(xiàn)多臟器功能障礙、衰竭，從而導(dǎo)致死亡。

由于沙粒病毒膜蛋白上的糖鏈豐富等原因，在康復(fù)病人的血清中并不能得到有效的大量中和性抗體，而至今為止仍然沒有美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的治療沙粒病毒感染的疫苗。現(xiàn)在的治療方法主要局限于一種核酸類藥物利巴韋林，但是它沒有預(yù)防效果，只能在發(fā)病后起到部分治療效果，并且很有嚴(yán)重的副作用。因此，研究并開發(fā)有效的抗沙粒病毒感染的藥物有重要意義。

拉西地平(Lacidipine)，為人工合成小分子化合物，屬于特異、強效持久的二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，臨床上主要用于治療高血壓，其主要藥理作用包括選擇性的阻滯血管平滑肌的鈣通道，擴張周圍動脈，減小周圍血管阻力，降低血壓。目前為止，并未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于拉西地平抗拉沙病毒的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種拉西地平在制備治療沙粒病毒感染的藥物中的應(yīng)用，拉西地平在無毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制沙粒病毒侵入到宿主細胞，從而能夠有效預(yù)防和治療由沙粒病毒引起的病毒感染。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種拉西地平在制備治療由沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的病毒感染的藥物中的應(yīng)用，拉西地平能夠作用于沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物，從而有效的抑制由沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的病毒感染。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

拉西地平在制備治療沙粒病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

拉西地平在制備治療由沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供了一種化學(xué)小分子化合物拉西地平的新用途，即拉西地平除了降血壓的作用，還具有抗沙粒病毒感染的作用。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，拉西地平在無毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制沙粒病毒侵入到宿主細胞，從而能夠有效預(yù)防和治療由沙粒病毒引起的病毒感染；且拉西地平已經(jīng)在臨床上有數(shù)十年的應(yīng)用，安全性良好。因此，可進一步開發(fā)拉西地平為治療或預(yù)防沙粒病毒感染的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，拉西地平能夠作用于沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物，從而有效的抑制由沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的病毒感染，因此，所有通過沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的病毒感染都可以使用拉西地平來進行有效的治療和預(yù)防。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為實驗例1中拉西地平的細胞毒性檢測結(jié)果；

圖2為實驗例2中拉西地平對拉沙假型病毒的抗病毒活性以及特異性的檢測結(jié)果；其中，VSVΔG/LASV-GPC為包膜為拉沙病毒膜蛋白內(nèi)含水泡性口炎基因組的拉沙假病毒；VSVΔG/VSV-G為水泡性口炎病毒的假病毒。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本實施方式提供一種拉西地平在制備治療沙粒病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

沙粒病毒的基因組分為L片段(7.2-7.5kb)和S片段(3.3-3.5kb)，基因組采用雙義編碼策略從兩個方向指導(dǎo)兩條多肽的合成，兩個基因由一段非編碼的基因間區(qū)分隔開。S片段編碼病毒的核蛋白(NP)和包膜糖蛋白復(fù)合物(GPC)，L片段編碼病毒的RNA依賴性的RNA聚合酶(L蛋白)和基質(zhì)蛋白Z。NP和L蛋白與RNA結(jié)合組成核糖核蛋白,或者參與核衣殼的構(gòu)成。

發(fā)明人在多年的創(chuàng)造性勞動的基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)，拉西地平能夠作用于沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物(GPC)，而GPC是沙粒病毒在侵染宿主細胞的過程中關(guān)鍵蛋白。GPC被信號肽酶和SKI-1/S1P酶翻譯后修飾加工為穩(wěn)定的信號肽(SSP)、GP1和GP2，其中GP1負責(zé)病毒與宿主細胞之間的吸附和受體識別，GP2負責(zé)病毒與宿主細胞之間的膜融合，三者形成三聚復(fù)合物存在于成熟的沙粒病毒的粒子表面，共同介導(dǎo)病毒與宿主細胞的侵染。因此，拉西地平能夠通過與GPC相互作用，來有效的抑制由GPC介導(dǎo)的細胞侵染，從而具有抗沙粒病毒感 染的作用。

其中，GPC的氨基酸序列為：

MGQIVTFFQEVPHVIEEVMNIVLIALSVLAVLKGLYNFATCGLVGLVTFLLLCGRSCTTSLYKGVYELQTLELNMETLNMTMPLSCTKNNSHHYIMVGNETGLELTLTNTSIINHKFCNLSDAHKKNLYDHALMSIISTFHLSIPNFNQYEAMSCDFNGGKISVQYNLSHSYAGDAANHCGTVANGVLQTFMRMAWGGSYIALDSGRGNWDCIMTSYQYLIIQNTTWEDHCQFSRPSPIGYLGLLSQRTRDIYISRRLLGTFTWTLSDSEGEDTPGGYCLTRWMLIEAELKCFGNTAVAKCNEKHDEEFCDMLRLFDFNKQAIQRLKAEAQMSIQLINKAVNALINDQLIMKNHLRDIMGIPYCNYSKYWYLNHTTTGRTSLPKCWLVSNGSYLNETHFSDDIEQQADNMITEMLQKEYMERQGKTPLGLVDLFVFSTSFYLISIFLHLVKIPTHRHIVGKSCPKPHRLNHMGICSCGLYKQPGVPVKWKR。

拉西地平，化學(xué)名為(E)-4-{2-[3-(羧叔丁基)-3-氧代-1-丙烯基]苯基}-1，4-二氫-2，6-二甲基-3，5-吡啶-二甲酸二乙酯，其結(jié)構(gòu)式如式I所示為：

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，拉西地平在無毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制沙粒 病毒侵入到宿主細胞，從而能夠有效預(yù)防和治療由沙粒病毒引起的病毒感染；且拉西地平已經(jīng)在臨床上有數(shù)十年的應(yīng)用，安全性良好。因此，可進一步開發(fā)拉西地平為治療或預(yù)防沙粒病毒感染的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。

在本發(fā)明較佳的實施例中，沙粒病毒為舊世界型沙粒病毒。沙粒病毒根據(jù)基因型、血清型和出現(xiàn)地區(qū)分為舊世界型和新世界型，舊世界型沙粒病毒包括拉沙熱病毒和淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒。研究發(fā)現(xiàn)，拉西地平對舊世界型沙粒病毒的抗感染能力更強。

在本發(fā)明較佳的實施例中，舊世界型沙粒病毒為淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒。這種淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒在侵入人體時，首先侵入呼吸道，且可在上皮細胞內(nèi)大量繁殖，故不少患者表現(xiàn)為上呼吸道感染或“流感樣”癥狀；病毒入血后導(dǎo)致病毒血癥，可通過血腦屏障而感染腦膜細胞，引起淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎。淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎為急性傳染病，危害力巨大，而目前還沒有能夠有效治療淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎的藥物或疫苗。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，拉西地平能夠有效的抑制淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒侵入宿主細胞，從而能夠預(yù)防和治療該病毒感染引起的淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎。

在本發(fā)明較佳的實施例中，舊世界型沙粒病毒為拉沙病毒。拉沙病毒性出血熱的病原為拉沙病毒，拉沙病毒是沙粒病毒科沙粒病毒屬成員。拉沙病毒的天然宿主是嚙齒類的納塔爾種多乳頭鼠，有非常廣泛的感染性，人類通過粘膜接觸含病毒的氣溶膠或者擦傷的皮膚接觸感染了病毒的物質(zhì)而感染。拉沙熱主要在尼日利亞、利比亞、塞拉里昂、幾內(nèi)亞等西非國家中流行，引起相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率，美洲、歐洲也曾發(fā)現(xiàn)輸入性病例。人感染拉沙病毒后，臨床表現(xiàn)差異很大， 可能是不發(fā)病的無癥狀感染，也可能是致命的發(fā)病。大多數(shù)病人癥狀較輕，表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、咽炎等癥狀，嚴(yán)重者出現(xiàn)多臟器功能障礙、衰竭，從而導(dǎo)致死亡。在世界范圍內(nèi)，拉沙熱具有嚴(yán)重的公共安全隱患。

拉沙病毒的整個生活周期需要在細胞質(zhì)內(nèi)完成。沙粒病毒感染的起始是病毒粒子表面的GPC復(fù)合體的GP1亞基識別并結(jié)合宿主細胞表面的病毒受體α-營養(yǎng)不良聚糖(α-DG)，α-DG的O-甘露糖基化翻譯后修飾對于GP1的識別與結(jié)合是至關(guān)重要的。在不同的宿主細胞中拉沙病毒也有其它的細胞表面受體比如硫酸乙酰肝素等。拉沙病毒與受體結(jié)合后通過一種目前尚未知曉的網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白非依賴的巨胞飲途徑進入細胞，之后在內(nèi)體中進行運輸；當(dāng)內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體時pH值下降至5.0左右，GP1亞基與內(nèi)體溶酶體的標(biāo)志分子溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP1)結(jié)合并從GPC復(fù)合體脫落，暴露出GP2亞基的融合肽，引起病毒囊膜與細胞膜融合，從而將病毒的核糖核蛋白(RNP)釋放到細胞質(zhì)中，完成病毒的細胞進入過程。RNP被釋放到細胞質(zhì)中后，開始轉(zhuǎn)錄形成沙粒病毒的基因組RNA。

然后，通過RNA的復(fù)制和翻譯，形成具有Z蛋白和GPC的可感染的子代沙粒病毒，且GPC被SKI-1/S1P酶切割為GP1(40–46kDa)亞基和GP2(35kDa)亞基。GP1亞基和GP2亞基形成低聚復(fù)合物裝飾在病毒表面，GP1位于復(fù)合物的頂端，通過離子相互作用與GP2跨膜區(qū)的N端連接，GP2與其它病毒膜蛋白的融合活性區(qū)是相似的。GPC還包含一段含有58個氨基酸的信號肽，它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被信號肽酶切割后并沒有被降解，而是仍舊與GP復(fù)合體相聯(lián)系，SSP在病毒的轉(zhuǎn)運和GP2介導(dǎo)的pH依賴性的膜融合過程中都有重要作用。

在拉西地平對非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)的細胞毒性試驗中，發(fā)現(xiàn)拉西地平對Vero細胞的CC50(半數(shù)致死濃度)為144μM。而在拉西地平對Vero細胞的抗沙粒病毒活性的評價中發(fā)現(xiàn)，拉西地平能夠劑量依賴性地抑制拉沙病毒的細胞進入，其EC50(半數(shù)有效濃度)為2.6μM。在人肺癌細胞A549上重復(fù)以上實驗，得到其EC50為9～10μM。

拉西地平是小分子化合物，其CC50(半數(shù)致死濃度)為144μM，拉西地平能夠劑量依賴性地抑制拉沙病毒的細胞進入，其EC50(半數(shù)有效濃度)為2.6μM，選擇指數(shù)(SI)為55.4，說明拉西地平的安全范圍非常大；而且拉西地平已經(jīng)在臨床上有數(shù)十年的應(yīng)用，安全性良好。這說明拉西地平是安全有效的抗拉沙病毒的藥物。

進一步的，藥物包括拉西地平及藥學(xué)上可接受的載體。此處，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指當(dāng)拉西地平給人類施用時拉西地平是生理上可接受的，包含胃腸道紊亂、頭暈等過敏反應(yīng)或者類似這些過敏反應(yīng)的全身過敏反應(yīng)是不包括在內(nèi)的。在本發(fā)明中，“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體”包括但不限于：粘合劑(如微晶纖維素、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(如淀粉、蔗糖、葡萄糖和無水乳酸)、崩解劑(如交聯(lián)PVP、交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、和低取代羥丙基纖維素)、潤滑劑(硬脂酸鎂、硬脂酸鋁、滑石、聚乙二醇、苯甲酸鈉)、潤濕劑(如甘油)、表面活性劑(如十六烷醇)以及吸收促進劑、矯味劑、甜味劑、稀釋劑、包衣劑等。

為了使該藥物能夠快速、連續(xù)并在很長一段時間里釋放活性成分，本發(fā)明的藥物可以根據(jù)公開在那些本技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)方法制造。本發(fā)明的藥物的給藥途徑為口服、鼻吸入、注射或腸胃外給藥。該藥物 的制劑可以是片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、緩釋制劑、控釋制劑或注射劑。當(dāng)該藥物為片劑，拉西地平的含量為10-40mg/片。當(dāng)該藥物為膠囊劑，拉西地平的含量為15-20mg/粒膠囊。

在治療沙粒病毒時，拉西地平的藥物有效劑量為20～50mg。本發(fā)明的藥物中拉西地平的含量為藥物有效劑量。此處，術(shù)語“藥物有效劑量”表示當(dāng)給動物或者人施用時，該活性組分的量足以帶來所預(yù)期的生理或者藥理活性。然而，藥物有效劑量可根據(jù)患者的年齡、體重、健康狀況、性別，以及給藥途徑和治療期等來調(diào)節(jié)。

本實施方式還提供一種拉西地平在制備治療由沙粒病毒包膜糖蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

GPC被信號肽酶和SKI-1/S1P酶翻譯后修飾加工為穩(wěn)定的信號肽(SSP)、GP1和GP2，其中GP1負責(zé)病毒與宿主細胞之間的吸附和受體識別，GP2負責(zé)病毒與宿主細胞之間的膜融合，三者形成三聚復(fù)合物存在于病毒的粒子表面，共同介導(dǎo)病毒與宿主細胞的侵染。因此，拉西地平能夠通過與GPC相互作用，來抑制由GPC介導(dǎo)的病毒侵入宿主細胞而引發(fā)的病毒感染，因此，所有通過GPC介導(dǎo)的病毒感染都可以使用拉西地平來進行有效的治療和預(yù)防。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述：

實施例1

本實施例提供一種用于治療沙粒病毒感染的拉西地平片劑：

取100g拉西地平、600g微晶纖維素、350g無水乳糖、220g硬脂酸鎂和30g氧化硅，按公知的制片技術(shù)和設(shè)備制成片劑，其中拉西地平的含量為10mg/片。

實施例2

本實施例提供一種用于治療沙粒病毒感染的拉西地平片劑：

取100g拉西地平、600g微晶纖維素、350g無水乳糖、220g硬脂酸鎂和30g氧化硅，按公知的制片技術(shù)和設(shè)備制成片劑，其中拉西地平的含量為40mg/片。

實施例3

本實施例提供一種用于治療沙粒病毒感染的拉西地平片劑：

取100g拉西地平、600g微晶纖維素、350g無水乳糖、220g硬脂酸鎂和30g氧化硅，按公知的制片技術(shù)和設(shè)備制成片劑，其中拉西地平的含量為25mg/片。

實施例4

本實施例提供一種用于治療沙粒病毒感染的拉西地平注射液：

取1500mg拉西地平，溶于1000mL注射用水中，加熱溶解，混合均勻后，分裝成3mg/2mL/支濃度的注射液，消毒制成產(chǎn)品。

實施例5

本實施例提供一種用于治療沙粒病毒感染的拉西地平注射液：

取5000mg拉西地平，溶于1000mL注射用水中，加熱溶解，混合均勻后，分裝成10mg/2mL/支濃度的注射液，消毒制成產(chǎn)品。

下面結(jié)合實驗例對本發(fā)明提供的拉西地平在抗沙粒病毒感染方面的效果進行評價。

實驗例1

本實驗例對拉西地平的細胞毒性進行評價：

一.實驗材料

1.1細胞和藥物

Vero細胞購自美國模式菌種保藏中心(ATCC)；

藥物：拉西地平(購自Selleck公司)。

1.2實驗儀器

全波段多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)

二.實驗方法：

2.1細胞培養(yǎng)：

將Vero細胞于37℃、5％CO₂的加濕細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用 含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，細胞至90％匯合度后傳代，傳代比例1：3～4。

2.2.拉西地平的細胞毒性檢測：

Vero細胞按1×10⁴細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃、5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h，待細胞貼壁長成單層后，分別用3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM的拉西地平進行處理，每組三個重復(fù)孔，對照組加相同量的二甲基亞砜(DMSO)。藥物作用3h后更換培養(yǎng)基為含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用MTT染色，檢測OD 492nm，分析細胞存活率。

三、實驗結(jié)果：

如圖2所示，拉西地平對Vero細胞的CC50(半數(shù)致死濃度)為144μM。本實驗例中，拉西地平在細胞水平的抗病毒實驗中給藥劑量范圍為0.8-50μM，完全處在安全無毒性濃度范圍。

實驗例2

本實驗例提供拉西地平對拉沙假型病毒的抗病毒活性及特異性：

一、實驗原理：

由于拉沙病毒為第四級病毒，其致病性很強，如果直接用拉沙病毒進行試驗，會對實驗者的身體健康以及生命安全構(gòu)成極大的威脅。鑒于此，發(fā)明人構(gòu)建了包膜為拉沙病毒膜蛋白內(nèi)含水泡性口炎基因組的拉沙假病毒(VSVΔG/LASV-GPC)，來代替拉沙病毒進行試驗。VSVΔG/LASV-GPC的基因組為VSV病毒的，該病毒的表面表達有沙粒病毒的GPC。

為了證明拉西地平對VSVΔG/LASV-GPC的抑制是通過對其細胞進入過程的抑制實現(xiàn)的，發(fā)明人以水泡性口炎病毒的假病毒(VSVΔG/VSV-G)作為對照病毒，驗證拉西地平對VSVΔG/LASV-GPC的抑制效果。VSVΔG/VSV-G與VSVΔG/LASV-GPC的基因組相同，不同之處在于，VSVΔG/VSV-G的表面表達有野生型水泡口膜炎病毒膜蛋白，而VSVΔG/LASV-GPC的表面表達有GPC。

VSVΔG/LASV-GPC與VSVΔG/VSV-G的基因組均攜帶海腎熒光素酶報告基因，當(dāng)病毒基因組復(fù)制表達時也會同時表達熒光素酶，將細胞裂解后加入熒光素底物，二者反應(yīng)就會產(chǎn)生熒光，并且熒光的量與熒光素酶的量成正比，因此可以通過熒光素酶活性強弱來衡量感染細胞的病毒的量。

二、實驗材料

2.1細胞、病毒和藥物

Vero細胞購自美國模式菌種保藏中心(ATCC)；

病毒：VSVΔG/VSV-G、VSVΔG/LASV-GPC；

藥物：拉西地平(購自Selleck公司)。

2.2實驗儀器

全波段多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)

三.實驗方法：

3.1細胞培養(yǎng)：

將Vero細胞于37℃、5％CO₂的加濕細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，細胞至90％匯合度后傳代，傳代比例1：3～4。

3.2病毒擴增：

將HEK293T細胞接種于六孔板，每孔的細胞數(shù)約為4×10⁵，12-16h后細胞長到70％-80％匯合度時用脂質(zhì)體3000(lipo 3000)試劑轉(zhuǎn)染2μg質(zhì)粒pCAGGS-LASV-GPC，4-6h后更換培養(yǎng)基為2mL的含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24h后吸去舊的培養(yǎng)基，將2μL的VSVΔG/VSV-G病毒稀釋于1mL的無血清的MEM緩沖液中，搖晃混勻，于37℃、5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱中孵育1h，每隔15min搖晃一下。吸去培養(yǎng)基，用PBS或MEM緩沖液洗一次，用移液槍吸去緩沖液后，每孔加入2mL含的2％FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)30h后轉(zhuǎn)移上清液到無菌的EP管，低速離心除去細胞，上清液分裝后保存在-80℃冰箱。

3.3拉西地平抗病毒感染活性檢測：

將Vero細胞按照1.5×10⁴細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃、5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h，待細胞長成單層后，分別用0.78125μM、1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM的拉西地平進行處理，陰性對照組加0.5％的DMSO。孵育1h后用VSVΔG/LASV-GPC感染Vero細胞，37℃孵育1h后更換培養(yǎng)基為含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基，24h后裂解細胞檢測熒光素酶活 性。

3.4拉西地平抗病毒感染特異性檢測：

將Vero細胞按照1.5×10⁴細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃、5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h，待細胞長成單層后，分別用0.78125μM、1.5625μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM的拉西地平進行處理，陰性對照組加0.5％的DMSO。孵育1h后用VSVΔG/VSV-G感染Vero細胞，37℃孵育1h后更換培養(yǎng)基為含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基，24h后裂解細胞檢測熒光素酶活性。

將轉(zhuǎn)移20μL的細胞裂解液到白色96孔微量板中，將熒光素底物(promega)按照體積比1:100稀釋于海腎熒光素酶檢測緩沖液，每孔加50μl稀釋好的底物，用全波長酶標(biāo)儀測定熒光值，按照下式計算拉西地平對VSVΔG/LASV-GPC或VSVΔG/VSV-G的抑制率：

抑制率(％)＝100-(樣品孔/對照孔)*100

四、實驗結(jié)果

如圖2中VSVΔG/LASV-GPC的抑制曲線所示，拉西地平顯著抑制了VSVΔG/LASV-GPC的活性，其EC₅₀＝2.6μM，且呈劑量依賴關(guān)系。

如圖2中VSVΔG/VSV-G的抑制曲線所示，拉西地平對VSVΔG/VSV-G沒有抑制作用。而在拉西地平的濃度為15μM時，抑制率約為75％，這主要是因為細胞中拉西地平的濃度過大而引起的非特異性死亡，而非由于VSVΔG/LASV-GPC的侵染而導(dǎo)致的細胞死亡。

因為VSVΔG/LASV-GPC和VSVΔG/VSV-G只有膜蛋白不同，所以可以確定拉西地平可以特異性地抑制由GPC介導(dǎo)的拉沙病毒的細胞進入過程，由此說明拉西地平能夠抗拉沙病毒。

由細胞實驗的結(jié)果可知，拉西地平具有很好的抗沙粒病毒感染的活性。目前，采用拉西地平來治療沙粒病毒感染的患者的臨床試驗已經(jīng)順利開展，并且從早期的治療結(jié)果來看，拉西地平對沙粒病毒感染的患者的藥效很好，能夠減輕患者由沙粒病毒感染引起的各種癥狀。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。