本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種負(fù)載蛋白質(zhì)藥物的可降解聚合物核殼微球。

背景技術(shù)：

近年來，載多肽、蛋白質(zhì)藥物的緩釋和控釋給藥系統(tǒng)發(fā)展很快，尤其是使用可生物降解的材料為載體的微球體或微球長效注射劑的制備。乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）作為骨架材料包裹抗癌藥、多肽、蛋白質(zhì)類藥物制成可注射微球制劑，成為研究熱點(diǎn)。目前，多肽和蛋白藥物微球可以由很多方法制備，但肽和蛋白質(zhì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可以很容易被破壞，可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的喪失。在蛋白質(zhì)藥物的微球的制備中，如何根據(jù)特征選擇一個制備藥物合適的材料，設(shè)計一種安全有效和穩(wěn)定的肽和蛋白質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)是制藥工業(yè)面臨的技術(shù)核心問題。

微球制備的常規(guī)方法有很多，分為相分離法、復(fù)乳法、超臨界流體和噴霧干燥法等新技術(shù)。然而，還有一些突出問題存在于微球制劑技術(shù)，特別是在制備抗癌藥、蛋白質(zhì)藥物微球給藥系統(tǒng)中，比如在制備過程中的多肽和蛋白質(zhì)藥物存在包封率低、易失活、體內(nèi)外釋藥有較明顯突釋等問題。與傳統(tǒng)的制備方法相比較，電噴霧技術(shù)具有制備固體分散體較大的優(yōu)勢。

干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。作為一種廣譜抗病毒劑，其類型分為三類，α-（白細(xì)胞）型、β-（成纖維細(xì)胞）型，γ-（淋巴細(xì)胞）型。在進(jìn)行肝纖維化等相關(guān)疾病治療時，需要每周注射干擾素注射液三次，處于治療周期的病人負(fù)擔(dān)重。隨著生物藥物研究技術(shù)的發(fā)展，針對目前干擾素長效控釋微球尚處于實(shí)驗(yàn)室研究初期階段，預(yù)期其藥物微球緩釋給藥系統(tǒng)具有較好的改善效果，應(yīng)用潛力大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

要解決的技術(shù)問題：針對目前干擾素長效控釋微球的問題，本發(fā)明公開了一種負(fù)載蛋白質(zhì)藥物的可降解聚合物核殼微球，能夠達(dá)到藥物持續(xù)長久釋放的目的，且制備的凝膠微球粒徑均勻，形貌良好。

技術(shù)方案：一種負(fù)載蛋白質(zhì)藥物的可降解聚合物核殼微球，包括下述成分：質(zhì)酸和羥乙基殼聚糖物理凝膠內(nèi)核，乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內(nèi)酯或聚乳酸外殼。

上述負(fù)載蛋白質(zhì)的可降解聚合物核殼微球的制備方法包括下述步驟：

步驟1）稱取適量羥乙基殼聚糖溶解于乙酸溶液中得濃度為5-10mg/L的羥乙基殼聚糖溶液，配制濃度為1-2mg/L的質(zhì)酸衍生物溶液，攪拌下加入羥乙基殼聚糖溶液中，控制羥乙基殼聚糖溶液與質(zhì)酸衍生物溶液體積比為1:1，溶解適量蛋白質(zhì)藥物實(shí)現(xiàn)藥物負(fù)載，由電噴霧同軸針頭內(nèi)口噴射獲得，其中，質(zhì)酸衍生物的制備方法為：將50.65mg的質(zhì)酸、58.85mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和65.45mg的N-羥基丁二酰亞胺或N-羥基磺基丁二酰亞胺混合在10mL去離子水中，室溫下在500rpm下攪拌24小時后，將活化的透明質(zhì)酸聚合物沉淀在冷的乙醇中，沉淀物通過過濾收集并用乙醇洗滌以除去殘余的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺/N-羥基磺基丁二酰亞胺，然后，冷凍干燥以蒸發(fā)任何殘留在透明質(zhì)酸聚合物表面的乙醇和水即得；

步驟2）將聚合物溶解于有機(jī)溶劑中，即得外殼材料：稱取50~200mg聚合物，加1mL有機(jī)溶劑配置聚合物溶液，由電噴霧同軸針頭外口噴射獲得，其中聚合物為乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內(nèi)酯或聚乳酸，有機(jī)溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯；

步驟3）搭建實(shí)驗(yàn)裝置，同軸電噴霧制備工藝參數(shù)為：內(nèi)核凝膠溶液流速為0.2mL/h，外殼聚合物流速為2mL/h，噴頭尖端與收集臺之間的距離為15cm，高壓電為4~8kV。

進(jìn)一步的，所述的負(fù)載的蛋白質(zhì)藥物可以是干擾素或牛血清蛋白或細(xì)胞色素C。

進(jìn)一步的，所述的步驟1）中蛋白質(zhì)藥物的負(fù)載量為外殼聚合物質(zhì)量的0.5-20%。

有益效果：本發(fā)明結(jié)合親水性聚合物和可降解聚合物的優(yōu)勢特性，利用電噴霧法制備一種微型狀制劑藥物，開發(fā)研究雙層微球，制備具有質(zhì)酸衍生物和羥乙基殼聚糖化學(xué)凝膠內(nèi)核，PLGA等為聚合物外殼的雙層結(jié)構(gòu)微球，用做干擾素等蛋白質(zhì)藥物載體，并通過適當(dāng)?shù)膬?yōu)化與控制各影響因素，微球的性能得到了改善，能夠達(dá)到藥物持續(xù)長久釋放的目的，且制備的凝膠微球粒徑均勻，形貌良好。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制備載蛋白質(zhì)酸衍生物-羥乙基殼聚糖凝膠內(nèi)核PLGA微球掃描電鏡照片。

圖2為實(shí)施例1制備載蛋白質(zhì)酸衍生物-羥乙基殼聚糖凝膠內(nèi)核PLGA微球激光共聚焦顯微鏡觀測圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

將1mg/mL的質(zhì)酸衍生物溶液、5mg/mL的羥乙基殼聚糖溶液和牛血清蛋白混合凝膠，質(zhì)酸衍生物溶液和羥乙基殼聚糖溶液體積比為1:1，牛血清蛋白的濃度為2%。利用同軸電噴霧技術(shù)制備核-殼顆粒，打開電壓發(fā)生器，將所要噴射的各組分放于5mL注射器中，連接同軸噴霧針頭，調(diào)整高壓4，4.5，5，5.5，6，7kV電噴核殼溶液。一注射器載的是質(zhì)酸衍生物、羥乙基殼聚糖和牛血清蛋白溶液，一注射器載的是PLGA溶液為外殼。采用同軸電噴霧技術(shù)制備核殼微粒，控制內(nèi)核凝膠溶液流速為0.2mL/h，外殼聚合物流速為2mL/h，噴頭尖端與收集臺之間的距離為15cm，調(diào)整高電壓參數(shù)，進(jìn)行電噴操作，將收集的微球冷凍后真空干燥4h，以除去殘余有機(jī)溶劑待測試。

掃描電子顯微鏡觀測微粒的表面形態(tài)和大小，利用QUANTA400FEG熱場發(fā)射掃描電鏡對實(shí)驗(yàn)過程中所需要的樣品進(jìn)行掃描，得到掃描圖像后分析。具體的操作步驟為：將制得的凝膠微球進(jìn)行制樣并粘貼在導(dǎo)電膠上，把四個標(biāo)本待用，開機(jī)并對掃描電鏡儀進(jìn)行調(diào)試，抽真空，達(dá)到掃描條件，將噴金后的樣品放入儀器中，觀察樣品，調(diào)節(jié)放大倍數(shù)通過選擇需要的圖像并記錄，逐個觀察與保存所需圖像，取出樣品并關(guān)機(jī)。

在對收集樣品做表面噴金處置，進(jìn)行電鏡掃描分析，參見圖1，發(fā)現(xiàn)在6kV條件2%牛血清蛋白負(fù)載率下制得的微球表面光滑，形貌完整，呈球形態(tài)，說明該條件下制得的微球比較理想。

將制得的樣品進(jìn)行共聚焦激光掃描圖像的獲取，見圖2，熒光顯示蛋白質(zhì)藥物分布均勻且集中于凝膠內(nèi)核處。

實(shí)施例2

將實(shí)驗(yàn)配置2mg/ml的質(zhì)酸衍生物溶液、10mg/ml羥乙基殼聚糖溶液和牛血清蛋白混合凝膠，質(zhì)酸衍生物溶液和羥乙基殼聚糖溶液體積比為1:1，牛血清蛋白的濃度分別為2%、4%和10%，將所要噴射的溶液吸入注射器中，一注射器載的是質(zhì)酸衍生物、羥乙基殼聚糖和牛血清蛋白溶液，一注射器載的是PLGA溶液為外殼，打開電壓發(fā)生器，連接同軸噴霧針頭，調(diào)整電壓4、4.5、5、5.5、6、7kV，電噴核殼溶液。

配置質(zhì)酸衍生物與羥乙基殼聚糖溶液，因兩者不容易溶于水，所以需測試前提前配置，質(zhì)酸衍生物不穩(wěn)定，不可以放置超過2天，否則，凝膠效果受到影響。測定HA-NHS與GC混合凝膠流變趨勢圖，可以得到凝膠曲線變化波動，前期G’變化曲線波動較大，可能是由于凝膠過程中混入空氣，影響到凝膠變化曲線。質(zhì)酸衍生物與羥乙基殼聚糖凝膠時間為26min。

對比SEM結(jié)果，BSA濃度影響微球形態(tài)。2%BSA在電壓為6kV控制條件下，制備出的凝膠小球，表面光滑，形態(tài)呈球形態(tài)，但是仍然會有棒形出現(xiàn)；10%BSA在6kV電壓的控制條件下，制備出的微球形態(tài)較差；4%BSA在電壓5.5-6kV的控制條件下，制備出的凝膠微球形態(tài)很好，作為微球制備優(yōu)選條件。

實(shí)施例3

將5mg/mL的羥乙基殼聚糖溶液、1mg/mL的質(zhì)酸衍生物溶液和干擾素混合凝膠，質(zhì)酸衍生物溶液和羥乙基殼聚糖溶液體積比為1:1，干擾素的濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%，采用同軸電噴霧技術(shù)制備核殼微粒，控制內(nèi)核凝膠溶液流速為0.2mL/h，外殼PLGA聚合物流速為2mL/h，噴頭尖端與收集臺之間的距離為15cm，實(shí)驗(yàn)溫度控制在2-8℃，高電壓為6kV，進(jìn)行電噴操作，將收集的微球冷凍后真空干燥4h，以除去殘余有機(jī)溶劑待測試。

用干擾素代替牛血清蛋白，進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)凝膠內(nèi)核雙層結(jié)構(gòu)微球的制備。SEM測試可以看出表面光滑，形態(tài)呈球形態(tài)。進(jìn)行激光掃描圖像的獲取，觀測到具有殼聚糖凝膠內(nèi)核、PLGA為聚合物外殼的雙層結(jié)構(gòu)微球。通過電鏡掃描和共聚焦測試表明制得的微球粒徑均一，形貌完整，負(fù)載了蛋白質(zhì)。親水性凝膠內(nèi)核改善了蛋白質(zhì)藥物的負(fù)載和釋放性能、藥物穩(wěn)定性的影響，以及親疏水界面結(jié)構(gòu)對載體結(jié)構(gòu)性能的影響。

通過電噴霧法制備雙層微球，用質(zhì)酸衍生物和羥乙基殼聚糖混合凝膠包載2%濃度的干擾素，采用電噴霧技術(shù)制備具有特定親、疏水性結(jié)構(gòu)比例的微球，制備的凝膠微球粒徑均勻，形貌良好，包封率良好，釋藥性能好的凝膠微球。

實(shí)施例4

將5mg/mL的羥乙基殼聚糖溶液、1mg/mL的質(zhì)酸衍生物和細(xì)胞色素C混合凝膠，質(zhì)酸衍生物溶液和羥乙基殼聚糖溶液體積比為1:1，PLGA溶液為外殼，細(xì)胞色素C的濃度分別為2%和4%，分別為A組和B組，A組在6kV的電壓下做電噴霧，B組則在5.5kV的電壓下做電噴，最后得到兩組微球。控制內(nèi)核凝膠溶液流速為0.2mL/h，外殼聚合物流速為2mL/h，噴頭尖端與收集臺之間的距離為15cm，進(jìn)行同軸電噴霧操作制備核殼微粒。將收集的微球冷凍后真空干燥4h，以除去殘余有機(jī)溶劑，然后進(jìn)行分析測試。

制備得到的結(jié)構(gòu)微球，研究其對模型蛋白質(zhì)細(xì)胞色素C的負(fù)載效果，以及對蛋白質(zhì)藥物的負(fù)載和釋放性能、藥物穩(wěn)定性的影響，以及親疏水界面結(jié)構(gòu)對載體結(jié)構(gòu)性能的影響。在對收集實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行電鏡掃描分析，觀測制得的微球球形粒徑均一，形貌完整，表面光滑。

以上對本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)介紹，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。