本發(fā)明涉及一種核殼式磁性復(fù)合微球及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種具有溫敏特性的核殼式磁性復(fù)合微球的合成及其在分離純化菠蘿蛋白酶中的應(yīng)用，屬于天然產(chǎn)物有效成分的分離純化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

菠蘿蛋白酶是分離于菠蘿的莖和果實中的一類純天然植物蛋白酶，具有較強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力，且具有酰胺鍵和酯鍵的特性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，食品、飼料和美容保健等行業(yè)。在醫(yī)藥領(lǐng)域，其能夠有效抑制血小板聚集，增進(jìn)藥物吸收和抗癌，在各種組織中治療炎癥和水腫等多種功效；在食品工業(yè)方面，菠蘿蛋白酶被用作肉類嫰化劑，使得食物更容易被人體吸收；在飼料方面，將菠蘿蛋白酶加入飼料配方中可預(yù)防動物腹瀉尤其是仔豬的腹瀉。

目前，工業(yè)上菠蘿蛋白酶的提取方法主要有高嶺土吸附法，單寧沉淀法和超濾濃縮法，但這些方法都各自存在一些不足之處，如生產(chǎn)工藝和操作復(fù)雜，酶活回收率低，污染環(huán)境，對技術(shù)要求較高，涉及到超濾膜的使用，生產(chǎn)成本高等。因此，尋求一種新的分離、提純菠蘿蛋白酶的方法是有必要的。

聚合物大分子修飾的磁性微球，不僅具有納米材料所特有的如小尺寸效應(yīng)、表面積效應(yīng)、量子效應(yīng)等，又具有良好的磁導(dǎo)向性、超順磁性和生物相容性，且聚合物大分子修飾后的磁性納米材料能夠更大程度的防止粒子之間相互聚集，增強(qiáng)其分散性和穩(wěn)定性，便于保存和應(yīng)用。不同功能化的聚合物大分子可賦予磁性微球不同的作用功能，這種特定功能化的聚合物復(fù)合微球可以實現(xiàn)從復(fù)雜的樣品中快速分離出目標(biāo)物，且操作簡便，可實現(xiàn)循環(huán)利用，節(jié)約成本。

本發(fā)明采用蒸餾沉淀聚合反應(yīng)將溫敏單體n-異丙基丙烯酰胺（nipam）與帶環(huán)氧基單體甲基丙烯酸縮水甘油酯（gma）共聚在四氧化三鐵表面，相比較傳統(tǒng)的沉淀聚合方法，在此反應(yīng)中無須加入穩(wěn)定劑、分散劑，整個反應(yīng)時間小于兩個小時，大大縮短了反應(yīng)周期，提高反應(yīng)效率。最后將該材料運用于從實際菠蘿皮粗提取液中提取菠蘿蛋白酶，通過sds-page凝膠電泳證明分離純化得到的菠蘿蛋白酶已達(dá)到了電泳純。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的生產(chǎn)工藝和操作復(fù)雜，酶活回收率低，污染環(huán)境，對技術(shù)要求較高，，生產(chǎn)成本高等技術(shù)缺陷，提供一種新型的聚合物大分子共聚修飾的磁性微球及其合成方法，并將該磁性微球應(yīng)用于分離純化菠蘿蛋白酶，同時實現(xiàn)對菠蘿蛋白酶的熱保護(hù)作用。

本發(fā)明采取的技術(shù)手段如下：

本發(fā)明首先提供一種核殼式磁性復(fù)合微球，即一種新型的聚合物大分子共聚修飾的磁性微球，所述微球記為fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺，所述微球比表面積大，粒徑大小均一，都保持在200nm左右。

本發(fā)明還提供該磁性微球的制備方法，具體步驟如下：

（1）磁性溫敏聚合物fe3o4@p(gma-co-nipam)的合成：

mps修飾fe3o4，使得fe3o4表面修飾了雙鍵，得到復(fù)合材料fe3o4/mps；

取fe3o4/mps于三口燒瓶中，加入乙腈超聲分散5min，加入n-異丙基丙烯酰胺（nipam）、甲基丙烯酸縮水甘油酯（gma）、交聯(lián)劑n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺（mba）、引發(fā)劑偶氮二異丁腈（aibn）混合均勻后，安裝分餾柱，冷凝管，接收器；機(jī)械攪拌并通氮氣，油浴加熱燒瓶蒸餾得到部分乙腈，停止反應(yīng)；得到的產(chǎn)物用磁鐵分離，并用乙醇和水反復(fù)洗滌后放入真空干燥箱內(nèi)干燥。

其中，所述fe3o4/mps的合成方法參考文獻(xiàn)（yutingzhang,dianli,mengyu,etal.fe3o4/pvim-ni²⁺magneticcompositemicrospheresforhighlyspecificseparationofhistidine-richproteins[j].acsappliedmaterials&interfaces,2014,6(11):8836-8844.）

其中，所述fe3o4/mps與乙腈用量比例為50-100mg：40-80ml，優(yōu)選用量比為50mg：40ml。

所述n-異丙基丙烯酰胺（nipam）的用量為50-150mg，優(yōu)選nipam用量為100mg；所述甲基丙烯酸縮水甘油酯（gma）的用量為0.05-0.15ml，優(yōu)選gma用量為0.1ml；所述交聯(lián)劑n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺（mba）的用量為100-200mg，優(yōu)選mba用量120mg；所述引發(fā)劑偶氮二異丁腈（aibn）用量為4-10mg，優(yōu)選aibn用量為6.4mg。

所述加熱條件為30min內(nèi)從室溫加熱到沸騰，再蒸餾1h。

所述蒸出乙腈的量為20-40ml。

（2）核殼式磁性復(fù)合微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的合成：

將磁性溫敏聚合物fe3o4@p(gma-co-nipam)分散于一定ph值的亞氨基二乙酸（ida）和氫氧化鈉（naoh）的混合水溶液中，劇烈攪拌反應(yīng)；磁分離上述步驟所得產(chǎn)物，用乙醇和水洗滌上述上述磁分離產(chǎn)物幾遍；在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重；后將所得產(chǎn)物分散于nicl2溶液中，室溫攪拌2h；磁分離產(chǎn)物，用去離子水洗滌幾遍，真空干燥至恒重。

其中，所述磁性溫敏聚合物fe3o4@p(gma-co-nipam)與ida和naoh混合水溶液的用量比為50mg：20ml；所述ida與naoh的用量比為0.33g：0.2g。所述混合水溶液的ph值為8-11。所述劇烈攪拌反應(yīng)的條件是80℃反應(yīng)12-36h。所述nicl2溶液用量為10ml,濃度為0.1m。

本發(fā)明中所制備的核殼式磁性復(fù)合微球與現(xiàn)有技術(shù)中其他技術(shù)制備的相比較，粒徑大小均一，都保持在200nm左右，這樣的粒徑既具有大的比表面積，又能防止粒徑過小而發(fā)生磁性微粒的聚集，從而影響單個微球在實際應(yīng)用中發(fā)揮作用。另外，所制備的磁性微球密度大，看起來美觀大方、“厚實”。

本發(fā)明所制備的核殼式磁性復(fù)合微球用于菠蘿蛋白酶的分離純化，本發(fā)明優(yōu)化了該新型磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺用于分離純化菠蘿蛋白酶的吸附條件，具體內(nèi)容如下：

將濃度為0.1-1.0mg/ml的菠蘿蛋白酶溶液與0.2mgfe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺微球混合，調(diào)節(jié)ph為4-8，nacl濃度為0-1.5m，在15-40℃的恒溫震蕩箱內(nèi)震蕩10-50min，磁鐵分離磁性材料。用緩沖溶液沖洗材料兩次以去除未吸附的菠蘿蛋白酶，測定吸附前后菠蘿蛋白酶溶液的吸光值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

（1）本發(fā)明中制備的磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺粒徑大約為200nm，比表面積大，對菠蘿蛋白酶的吸附量高達(dá)117mg/g，而已報道的其他相似材料的吸附量為只有103mg/g。

（2）本發(fā)明中制備的磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺中含有溫敏聚合物pnipam，在溫度高于其低臨界溶解溫度（lcst）時，pnipam鏈塌縮，顯示疏水性，當(dāng)溫度低于lcst時，pnipam鏈?zhǔn)嬲梗尸F(xiàn)親水性，對菠蘿蛋白酶的酶活具有一定的熱保護(hù)作用。具體的酶活保護(hù)效果如下：在70℃變性10min條件下，結(jié)合fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的菠蘿蛋白酶在室溫復(fù)性2h后酶活恢復(fù)為原來的40%，而游離酶酶活基本沒有恢復(fù)，僅為原來的8%。

（3）本發(fā)明制備合成的聚合物大分子共聚修飾的磁性微球在分離純化菠蘿蛋白酶的應(yīng)用中，只需改變?nèi)芤旱膒h和溫度就能夠?qū)⒉ぬ}蛋白酶從微球上洗脫下來，無需引入咪唑溶液洗脫從而造成酶溶液中存在雜質(zhì)。

（4）本發(fā)明中制備的磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺具有超順磁性，在外加磁性條件下，可在10s內(nèi)被回收，外界磁場消失時，又可均勻的分散在溶液中。

（5）本發(fā)明中制備的磁性材料具有很好的重復(fù)利用性，在循環(huán)使用6次后，菠蘿蛋白酶的吸附量仍然能夠保持為原來的90%。

附圖說明

圖1為按照實施例1和3制備的fe3o4（a）和fe3o4@p(gma-co-nipam)（b）的tem圖。

圖2為按實施例1和實施例4制得的fe3o4（a）、fe3o4/mps（b）和fe3o4@p(gma-co-nipam)（c）的紅外譜圖。

圖3為按實施例1和實施例3制得的fe3o4（a）、fe3o4@p(gma-co-nipam)（b）和fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺（c）的vsm圖。

圖4為磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的實際應(yīng)用流程示意圖。

圖5為實施例6制得的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的循環(huán)利用結(jié)果圖。

圖6為實施例8制得的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺對菠蘿蛋白酶熱保護(hù)酶活恢復(fù)效果圖。

圖7為實施例8制得的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺對菠蘿蛋白酶熱保護(hù)效果圖。

圖8為磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺對菠蘿蛋白酶酶活熱保

護(hù)示意圖；其中，n-天然狀態(tài)；d-變性過程；i-失活過程。

具體實施方式

下面通過實例進(jìn)一步描述本發(fā)明，并結(jié)合附圖說明使得本技術(shù)方案更加清晰易懂，顯然，所列舉的實施例并不是全部的實施例，在不背離本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠做出的任何顯而易見的改進(jìn)替換或變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1：fe3o4/mps的合成

將1.350g六水合氯化鐵、3.854g乙酸銨和0.4g檸檬酸三鈉溶于70ml乙二醇中，油浴溫度170℃下攪拌1h至溶液成黑色均勻體系，轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼反應(yīng)釜中加熱至200℃并保持16h。取出后冷卻至室溫，磁分離產(chǎn)物，用乙醇洗滌至上清液透明，放在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重。

取0.3g上述制備的fe3o4分散于40ml乙醇、10ml去離子水和1.5ml氨水中，加入0.6gmps，70℃劇烈攪拌24h。磁分離產(chǎn)物，用乙醇洗滌去除多余的mps，放在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重。

實施例2：fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的合成

（1）fe3o4@p(gma-co-nipam)的合成：

取50mg上述實施例1中fe3o4/mps于三口燒瓶中，加入40ml乙腈超聲分散5min，加入50mgnipam，0.05mlgma，100mg交聯(lián)劑mba，4mg引發(fā)劑aibn，油浴加熱燒瓶，安裝分餾柱，冷凝管，接收器，機(jī)械攪拌并通氮氣。將反應(yīng)燒瓶從室溫30min內(nèi)加熱到沸騰，再經(jīng)過一個小時蒸餾得到20ml乙腈，停止反應(yīng)。磁分離產(chǎn)物，并用乙醇和水反復(fù)洗滌，放在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重。

（2）fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的合成：

將50mgfe3o4@p(gma-co-nipam)微球分散于預(yù)先調(diào)節(jié)ph為8的20ml亞氨基二乙酸（ida）和氫氧化鈉（naoh）混合水溶液中，80℃劇烈攪拌12h。磁分離產(chǎn)物，用乙醇和水洗滌幾遍，在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重。后將所得產(chǎn)物分散于10ml,0.1mnicl2溶液中，室溫攪拌2h；磁分離產(chǎn)物，用去離子水洗滌幾遍，真空干燥至恒重。

實施例3：fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的合成

（1）fe3o4@p(gma-co-nipam)的合成：

取75mg上述實施例1中fe3o4/mps于三口燒瓶中，加入60ml乙腈超聲分散5min，加入100mgnipam，0.1mlgma，120mg交聯(lián)劑mba，6.4mg引發(fā)劑aibn，油浴加熱燒瓶，安裝分餾柱，冷凝管，接收器，機(jī)械攪拌并通氮氣。將反應(yīng)燒瓶從室溫30min內(nèi)加熱到沸騰，再經(jīng)過一個小時蒸餾得到20ml乙腈，停止反應(yīng)。磁分離產(chǎn)物，并用乙醇和水反復(fù)洗滌，放在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重。

（2）fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的合成：

將50mgfe3o4@p(gma-co-nipam)微球分散于預(yù)先調(diào)節(jié)ph為11的20ml亞氨基二乙酸（ida）和氫氧化鈉（naoh）混合水溶液中，80℃劇烈攪拌24h。磁分離產(chǎn)物，用乙醇和水洗滌幾遍，在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重。后將所得產(chǎn)物分散于10ml,0.1mnicl2溶液中，室溫攪拌2h；磁分離產(chǎn)物，用去離子水洗滌幾遍，真空干燥至恒重。

圖1是按照實施例1和3制備的fe3o4（a）和fe3o4@p(gma-co-nipam)（b）的tem圖。由圖可以看出，所制備的fe3o4顆粒大小均一，粒徑大約為200nm，修飾雙鍵包覆聚合物以后，粒徑增加了約20nm，呈現(xiàn)核殼結(jié)構(gòu)。

圖3是按照實施例1和實施例3制得的fe3o4（a）、fe3o4@p(gma-co-nipam)（b）和fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺（c）的vsm圖。通過測定所制備的fe3o4、fe3o4@p(gma-co-nipam)和fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的飽和磁化強(qiáng)度值（ms）分別是56.85、12.84、11.45emu/g，且所合成的磁球在室溫時幾乎沒有明顯的剩磁，表明均是超順磁性的。盡管在包覆聚合物以后微球的飽和磁化強(qiáng)度值大幅度下降，但從圖3中的插圖照片中可以看出，fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺能夠分散在菠蘿蛋白酶水溶液中，形成均勻的淺棕色懸浮液，而在外加磁場的作用下，fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺又能夠迅速的從蛋白酶溶液中分離出來，發(fā)揮其在實際應(yīng)用中的優(yōu)勢。

實施例4：fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的合成

（1）fe3o4@p(gma-co-nipam)的合成：

取100mg上述實施例1中fe3o4/mps于三口燒瓶中，加入80ml乙腈超聲分散5min，加入150mgnipam，0.15mlgma，200mg交聯(lián)劑mba，10mg引發(fā)劑aibn，油浴加熱燒瓶，安裝分餾柱，冷凝管，接收器，機(jī)械攪拌并通氮氣。將反應(yīng)燒瓶從室溫30min內(nèi)加熱到沸騰，再經(jīng)過一個小時蒸餾得到40ml乙腈，停止反應(yīng)。磁分離產(chǎn)物，并用乙醇和水反復(fù)洗滌，放在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重。

（2）fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的合成：

將50mgfe3o4@p(gma-co-nipam)微球分散于預(yù)先調(diào)節(jié)ph為11的20ml亞氨基二乙酸（ida）和氫氧化鈉（naoh）混合水溶液中，80℃劇烈攪拌36h。磁分離產(chǎn)物，用乙醇和水洗滌幾遍，在50℃真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重。后將所得產(chǎn)物分散于10ml,0.1mnicl2溶液中，室溫攪拌2h；磁分離產(chǎn)物，用去離子水洗滌幾遍，真空干燥至恒重。

圖2是按照按實施例1和實施例4制得的fe3o4（a）、fe3o4/mps（b）和fe3o4@p(gma-co-nipam)（c）的紅外譜圖。如圖所示，在3條譜帶600cm^-1處均出現(xiàn)了fe3o4中fe-o的振動峰，修飾雙鍵后，圖2（b）中1632cm^-1處出現(xiàn)了雙鍵的特征峰，證明mps成功的修飾在fe3o4表面；包覆p(gma-co-nipam)殼層后，圖2（c）908cm^-1處為gma中環(huán)氧基的典型特征峰，1521cm^-1and2949cm^-1分別是nipam單體中n-h振動峰和亞甲基的伸縮振動峰，證明聚合物殼層的修飾成功。

實施例5：磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺用于分離純化菠蘿蛋白酶

（1）fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺吸附量考察：

將300μl濃度為0.1mg/ml的菠蘿蛋白酶溶液與0.2mg本發(fā)明中實施例3

制備的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺微球混合，調(diào)節(jié)ph為4，nacl濃度為0m，在15℃的恒溫震蕩箱內(nèi)震蕩10min，磁鐵分離磁性材料。用緩沖溶液沖洗材料兩次以去除未吸附的菠蘿蛋白酶，然后測定吸附前后菠蘿蛋白酶溶液的吸光值，計算出吸附量為73mg/g。

該實施例中吸附條件是ph為4，溫度為15℃，且吸附時間只有10min，在低ph的條件下，氫鍵和疏水基的作用會使得菠蘿蛋白酶分子很難從溶液中擴(kuò)散到磁性微球表面，且吸附溫度低，分子運動比較慢，而吸附時間只有10min，吸附量并未達(dá)到飽和，所以吸附量會稍微低點。

（2）洗脫前后菠蘿蛋白酶酶活測定：

將0.2mg結(jié)合菠蘿蛋白酶的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺微球分散

于200μl洗脫液（pbs,0.2m;ph=4;nacl,1.0m）中，40℃恒溫震蕩30min，磁鐵分離磁性材料，用酪蛋白法測得上清液中菠蘿蛋白酶酶活為洗脫前的95.3%；說明該分離純化過程對酶活的影響不大，雖然吸附量小，但并不會影響酶活。

實施例6：磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺用于分離純化菠蘿蛋白酶

（1）fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺吸附量考察：

將300μl濃度為1mg/ml的菠蘿蛋白酶溶液與0.2mg本發(fā)明中實施例3制備的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺微球混合，調(diào)節(jié)ph為6，nacl濃度為0.1m，在30℃的恒溫震蕩箱內(nèi)震蕩30min，磁鐵分離磁性材料。用緩沖溶液沖洗材料兩次以去除未吸附的菠蘿蛋白酶，測定吸附前后菠蘿蛋白酶溶液的吸光值，計算出吸附量為117mg/g；該實施例中的吸附條件是磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺吸附菠蘿蛋白酶的最佳吸附條件。

（2）洗脫前后菠蘿蛋白酶酶活測定：

將0.2mg結(jié)合菠蘿蛋白酶的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺微球分散于200μl洗脫液（pbs,0.2m;ph=4;nacl,1.0m）中，40℃恒溫震蕩30min，磁鐵分離磁性材料，用酪蛋白法測得上清液中菠蘿蛋白酶酶活為洗脫前的96%；說明該分離純化過程對酶活幾乎沒有什么影響。

方便本領(lǐng)域技術(shù)人員更好理解本發(fā)明的技術(shù)方案，圖4為磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的實際應(yīng)用流程示意圖，采用示意圖的方式展示該材料的循環(huán)利用過程，具體操作流程如下：將0.2mg磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺加入到300μl菠蘿皮粗提取液中，30℃恒溫震蕩30min后，磁分離產(chǎn)物，然后按照實施例5（2）部分，將結(jié)合在微球上的菠蘿蛋白酶洗脫下來，將原液、上清液及洗脫液保留，做凝膠電泳（sds-page），而洗脫過后的磁性微球則進(jìn)入下一次循環(huán)利用。

其中菠蘿皮粗提取液的制備方法：購買常規(guī)市售新鮮的菲律賓進(jìn)口菠蘿，用蒸餾水洗凈、晾干、削皮后，將菠蘿皮放在4℃冰箱預(yù)冷12h，然后以菠蘿皮和pbs(ph=6;edta,5mmol/l)1:1的比例進(jìn)行榨汁，將榨好的菠蘿皮汁用四層紗布過濾，然后將濾液在4℃的離心機(jī)8000rmp/min轉(zhuǎn)速下離心20min，上清液即為菠蘿皮粗提取液。

圖5為實施例6制得的磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的循環(huán)利用結(jié)果圖?？梢钥闯?，材料在經(jīng)過6次循環(huán)后（每次循環(huán)使用的菠蘿蛋白酶溶液都是新配制的），對菠蘿蛋白酶的吸附量仍然能夠保持為原來的90%，對降低生產(chǎn)成本具有重要意義。

實施例7：磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺用于分離純化菠蘿蛋白酶

（1）fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺吸附量考察：

將300μl濃度為0.5mg/ml的菠蘿蛋白酶溶液與0.2mg本發(fā)明中實施例3

制備的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺微球混合，調(diào)節(jié)ph為8，nacl濃度為1m，在40℃的恒溫震蕩箱內(nèi)震蕩50min，磁鐵分離磁性材料。用緩沖溶液沖洗材料兩次以去除未吸附的菠蘿蛋白酶，測定吸附前后菠蘿蛋白酶溶液的吸光值，計算出吸附量為96mg/g。

該實施例中nacl濃度為1m，相比于實施例5和6，鹽離子濃度偏高，使得菠蘿蛋白酶分子處于更多的離子氛圍中，與磁性微球結(jié)合的空間障礙和靜電斥力會增大，導(dǎo)致吸附量減少。

（2）洗脫前后菠蘿蛋白酶酶活測定：

將0.2mg結(jié)合菠蘿蛋白酶fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺微球分散于200ul洗脫液（pbs,0.2m;ph=4;nacl,1.0m）中，40℃恒溫震蕩30min，磁鐵分離磁性材料，用酪蛋白法測得上清液中菠蘿蛋白酶酶活為洗脫前的95.7%；說明該吸附-洗脫過程并沒有對菠蘿蛋白酶的酶活造成影響。

實施例8：磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺對菠蘿蛋白酶的熱保護(hù)作用

將300μl濃度為1mg/ml的菠蘿蛋白酶溶液與0.2mg本發(fā)明中實施例3制備的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺微球混合，調(diào)節(jié)ph為6，nacl濃度為0.1m，在30℃的恒溫震蕩箱內(nèi)震蕩30min后，將溫度升至70℃保持10min，然后室溫保持2h復(fù)性菠蘿蛋白酶。磁分離產(chǎn)物，將產(chǎn)物分散于200ul洗脫液（pbs,0.2m;ph=4;nacl,1.0m）中，40℃恒溫震蕩30min，磁鐵分離磁性材料，用酪蛋白法測得上清液中菠蘿蛋白酶酶活為洗脫前的40%。

圖6為實施例8中的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺對菠蘿蛋白酶熱保護(hù)酶活恢復(fù)效果圖。由圖可得，在70℃變性10min條件下，結(jié)合fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的菠蘿蛋白酶在室溫復(fù)性2h后酶活恢復(fù)為原來的40%，而游離酶酶活基本沒有恢復(fù)，僅為原來的8%，可以得出fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺對菠蘿蛋白酶酶活有一定的熱保護(hù)作用。為了進(jìn)一步驗證溫敏單體nipam是所合磁性微球具有熱保護(hù)作用的關(guān)鍵，將沒有聚合溫敏單體的磁性微球fe3o4@pgma/ida/ni²⁺作用于菠蘿蛋白酶，保持與上述內(nèi)容條件一致，與游離酶作對比，發(fā)現(xiàn)其酶活恢復(fù)效果和游離酶基本一致，幾乎沒有酶活恢復(fù)。

圖7為實施例8中的fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺對菠蘿蛋白酶熱保護(hù)效果圖。將結(jié)合fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺的菠蘿蛋白酶與游離菠蘿蛋白酶均在65，70，75，80℃條件下保持10min后測酶活，可以明顯看出游離酶酶活損失的更多，說明該材料對菠蘿蛋白酶酶活有一定的熱保護(hù)作用。

圖8為磁性微球fe3o4@p(gma-co-nipam)/ida/ni²⁺對菠蘿蛋白酶酶活熱保護(hù)示意圖。菠蘿蛋白酶屬于單亞基酶，單亞基酶活性的失去一般分為兩步，變性過程和失活過程，變性過程是可逆的，而失活過程是不可逆的。如圖8所示，當(dāng)溫度高于pnipam的lcst時，溫敏單體塌縮，呈現(xiàn)疏水性。溫度繼續(xù)升高，菠蘿蛋白酶發(fā)生變性過程，暴露出疏水部位，正好與pnipam通過疏水作用相結(jié)合，阻止了酶分子的相互聚集而失活。降低溫度，pnipam鏈伸展，呈現(xiàn)親水性，釋放出菠蘿蛋白酶分子，酶分子可通過折疊恢復(fù)其原來構(gòu)象，從而使酶活恢復(fù)。