本申請(qǐng)是于2012年3月6日提交的發(fā)明名稱(chēng)為“用于維持哺乳動(dòng)物體內(nèi)血糖量正常的釩化合物的用途”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01280022288.1的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及用于維持需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人的血糖量正常的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于預(yù)防或者限制在需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人體內(nèi)的腎缺血再灌注(i/r)的方法。本發(fā)明還涉及用于在需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人體內(nèi)預(yù)防、限制或者治療心腎失調(diào)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于維持患有急性應(yīng)激的危重病人體內(nèi)的血糖量正常的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：患有急性應(yīng)激(例如中風(fēng)或者心肌梗死)的患者高比例地發(fā)展高血糖癥，即使這些患者早期未被診斷為糖尿病。這類(lèi)應(yīng)激(壓力)誘發(fā)的高血糖癥與在中風(fēng)和心肌梗死之后的死亡的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。此外，應(yīng)激(壓力)誘發(fā)的高血糖癥可能是腦損傷的風(fēng)險(xiǎn)因素(參見(jiàn)sarahe.capesetal.stroke2001,32，page2426)。此外，高血糖癥和胰島素耐受性通常在危重病人中是常見(jiàn)的，甚至當(dāng)血糖動(dòng)態(tài)平衡預(yù)先已經(jīng)正常時(shí)(參見(jiàn)us2005/171503，通過(guò)引用結(jié)合在此)。g.vanberghe等人(n.engl.j.med.2001，345，1359-1367)發(fā)現(xiàn)甚至在糖尿病患者以及非糖尿病患者危重病人體內(nèi)適度的高血糖癥直接地或者間接地對(duì)重要器官和系統(tǒng)有害。強(qiáng)化胰島素療法將總的icu(重病監(jiān)護(hù)室)死亡率從8％減少至4.6％，以及在需要超過(guò)五天特護(hù)的患者中從20.2％減少至10.6％。強(qiáng)化胰島素療法還顯著地減少血流感染、延長(zhǎng)炎癥、急性腎衰竭、危重病多發(fā)性神經(jīng)病以及輸血要求。因此，用強(qiáng)化胰島素療法嚴(yán)格地維持血糖量正常將減少特護(hù)和醫(yī)院死亡率以及在icu中的垂危成年患者的發(fā)病率。然而，強(qiáng)化胰島素療法需要患者血糖水平的知識(shí)，這涉及頻繁地獲得(毛細(xì)管)血樣。這需要相當(dāng)大的護(hù)士或者技師時(shí)間以及許多患者，尤其是非糖尿病患者，發(fā)現(xiàn)不便重復(fù)血液取樣。此外，間歇性血液樣品可能并未足夠頻繁地進(jìn)行以給出血糖水平的準(zhǔn)確圖形。強(qiáng)化胰島素療法的其他缺點(diǎn)包括：低血糖癥風(fēng)險(xiǎn)(本領(lǐng)域已知的是低血糖癥增加心肌梗死和室性心律不齊的風(fēng)險(xiǎn)；參見(jiàn)us2005/171503，通過(guò)引用結(jié)合在此)的增加，鎮(zhèn)靜作用可以掩蓋低血糖癥以及在當(dāng)引入胰島素時(shí)的選項(xiàng)方面以及在給予方案的患者方面的差異。因此，盡管胰島素療法對(duì)于如上討論的危重病人具有確定的優(yōu)勢(shì)，在本領(lǐng)域中仍需要提供用于控制胰島素給予危重病人，具體地患有急性應(yīng)激的危重病人的方法。急性腎衰竭(arf)是一種臨床綜合征，其特征在于在數(shù)天內(nèi)發(fā)生的腎功能快速劣化。arf通常是由急性腎小管壞死(atn)引起的，其是由局部缺血性損傷和/或腎毒性損傷引起的。通常世界人口，每年每百萬(wàn)人口中出現(xiàn)大約200例嚴(yán)重的arf。在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)研究了數(shù)種藥物(例如抗氧化劑、鈣通道阻滯劑、利尿劑、血管活性物質(zhì)、生長(zhǎng)因子以及抗炎藥的功效，但是發(fā)現(xiàn)具有很少的臨床用途或無(wú)臨床用途。us5.300.496、us5.527.790、us5.620.967、us5.866.563以及us5.888.993(全部結(jié)合以供參考)，公開(kāi)了釩化合物在治療糖尿病、高血壓、肥胖以及與慢性增強(qiáng)的血糖水平相關(guān)的類(lèi)似病癥中的用途。通過(guò)引用結(jié)合的us5.885.980公開(kāi)了用于治療糖尿病的藥物組合物，所述藥物組合物包括生成vo2+的化合物以及微?；膬?yōu)降糖。us5.885.980的實(shí)施例5公開(kāi)了使用胰島素、硫酸氧釩和格列本脲微粉化片劑(glynase)(更通常用于治療ii型糖尿病的磺酰脲類(lèi)型的抗糖尿病藥物)的組合治療在icu中住院的i型糖尿病女性病人的慢性高血糖癥。然而，格列本脲微粉化片劑可能引起低血糖癥，而定義為血糖低于0.3mm/l的低血糖癥將增加心肌梗死和室性心律不齊的風(fēng)險(xiǎn)(參見(jiàn)us2005/171503)。通過(guò)引用結(jié)合的us6.287.586公開(kāi)了特定的釩雙胍復(fù)合物(絡(luò)合物)的藥物組合物，用于治療高血糖癥以及相關(guān)失調(diào)。通過(guò)引用結(jié)合的us6.579.540公開(kāi)了生理學(xué)上可接受的釩化合物用于預(yù)防性治療組織的繼發(fā)性損傷的用途，其中，所述繼發(fā)性損傷是原發(fā)性損傷的結(jié)果并且其中所述原發(fā)性損傷是由創(chuàng)傷(例如局部缺血(梗死)之后再灌注)引起的。因此us6.579.540確實(shí)并未公開(kāi)生理學(xué)上可接受的釩化合物在治療危重病人中的高血糖癥或者腎缺血再灌注中的用途。通過(guò)引用結(jié)合的us6.852.760公開(kāi)了磺酰脲類(lèi)化合物、鉻的生物可利用來(lái)源以及釩的生物可利用來(lái)源的組合用于治療糖尿病的用途。因此，使用釩化合物來(lái)控制糖尿病患者的高血糖癥是本領(lǐng)域已知的。然而，糖尿病是一種慢性病。但是，危重病人住院時(shí)間相對(duì)較短，具體地，一至數(shù)天，并且具體地，在重病監(jiān)護(hù)室(icu)。因此，糖尿病患者與危重病人相比是不同類(lèi)型的患者。p.a.mccullough,int.j.nephrol.,2011卷,文章id762590(doi:10.4061/2011/762590)提出在心臟血管失調(diào)和腎臟失調(diào)之間存在相互關(guān)系。這種關(guān)系稱(chēng)為心腎失調(diào)。當(dāng)前，造影劑誘發(fā)的腎病，優(yōu)選放射性造影劑誘發(fā)的腎病使用n-乙酰半胱氨酸進(jìn)行治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及用于維持需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人的血糖量正常的方法，其中給予所述哺乳動(dòng)物包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物(絡(luò)合物)的藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或者限制需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人的腎缺血再灌注(i/r)的方法，其中給予所述哺乳動(dòng)物包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防、限制或者治療需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人的心腎失調(diào)的方法，其中給予所述哺乳動(dòng)物包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于維持患有急性應(yīng)激的危重病人的血糖量正常的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物，用于預(yù)防或者限制患有急性應(yīng)激的危重病人的腎缺血再灌注(i/r)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)釩化合物或者復(fù)合物、藥學(xué)上可接受的載體、以及第二組分的藥物組合物，所述第二組分選自下組：鎂、魚(yú)油、鉀、銅、硒、維生素d、維生素e、鉻、以及它們的混合物。本發(fā)明還涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物，用于預(yù)防或者治療需要其的哺乳動(dòng)物的造影劑誘發(fā)的腎病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物，用于預(yù)防、限制或者治療需要其的哺乳動(dòng)物的心腎失調(diào)。附圖說(shuō)明圖1示出了在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)之后的平均動(dòng)脈(art.)壓力。圖2示出了在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)后腎血管阻力(vasc.res.)(上列)，腎血流量(中間列)，以及腎氧氣運(yùn)送(下列)。圖3示出了在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)后皮質(zhì)(上列)和髓質(zhì)(下列)中的腎微血管氧張力(μpo2)。圖4示出了在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)后腎的氧消耗(上列)，鈉再吸收所需的氧氣量(vo2/tna+)(中間列)，以及肌酐清除率(creat.clear.)(下列)。圖5示出了在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)之后的尿液輸出量。圖6示出了在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)之后il-6和inos表達(dá)(上列)以及mpo-染色的白細(xì)胞外觀(下列)。圖7示出了在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)之后il-6和inos表達(dá)(上列)以及mpo-染色的白細(xì)胞外觀(下列)。具體實(shí)施方式定義如在本說(shuō)明書(shū)中和權(quán)利要求中以及其結(jié)合中使用的動(dòng)詞“包括”以其非限制性含義使用，是指包括該詞語(yǔ)后面的事項(xiàng)，但是并未排除并未具體提及的事項(xiàng)。另外，通過(guò)不定冠詞“一個(gè)”或者“一種”提及元件并不排除存在超過(guò)一個(gè)元件的可能性，除非上下文明確地要求存在一個(gè)且僅一個(gè)元件。因此，不定冠詞“一個(gè)”或者“一種”通常是指“至少一個(gè)”。在本文件中，術(shù)語(yǔ)“危重病人”是指在重病監(jiān)護(hù)室(icu)中相應(yīng)短期(特別地是一至數(shù)天，更特別地是一至七天)住院的患者組。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“危重病人”是指患有急性應(yīng)激(特別地是急性腎衰竭(arf)、急性腎功能不全(aci)或者兩者)的患者組。建議的是針對(duì)腎臟的腎缺血再灌注(i/r)(其可以作為以下各項(xiàng)的結(jié)果發(fā)生或者可以在以下各項(xiàng)的期間發(fā)生：例如心臟或者血管手術(shù)、腎臟移植、選擇性主動(dòng)脈瘤修復(fù)和休克(例如心原性休克、出血性休克或者膿毒性休克))影響腎臟微循環(huán)，這可以防止正常的組織再灌注。這可能導(dǎo)致不希望的效應(yīng)，例如腎缺氧、氧化應(yīng)激以及具有器官衰竭的不可恢復(fù)的損害。術(shù)語(yǔ)“心腎失調(diào)”限定為如心臟和腎臟的器官失調(diào)，由此，在一個(gè)器官中的急性或者慢性功能障礙可以引起在其他器官中的急性或者慢性功能障礙。已經(jīng)提出了每種失調(diào)的數(shù)種可能的病理生理學(xué)機(jī)制。因此，本發(fā)明涉及用于維持需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人的血糖量正常的方法，其中給予所述哺乳動(dòng)物包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物(絡(luò)合物)的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于預(yù)防或者限制需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人的腎缺血再灌注(i/r)的方法，其中給予所述哺乳動(dòng)物包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于預(yù)防或者限制需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選患有急性應(yīng)激的危重病人的腎臟的腎缺血再灌注(i/r)的方法，其中給予所述哺乳動(dòng)物包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物。出人意料地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物顯著地增加需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選危重病人的腎皮質(zhì)和髓質(zhì)中的微血管氧化，其中這種微血管氧化通過(guò)i/r損傷在早期被降低。還出人意料地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物增加需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選危重病人的腎臟氧利用效率，其通過(guò)i/r損傷在早期被降低。另外，出人意料地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物顯著地降低需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選危重病人的由早期i/r損傷引起的炎癥激活。另外，出人意料地發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物顯著地降低需要其的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選危重病人的由早期i/r損傷引起的腎損傷。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在需要其的哺乳動(dòng)物中用于預(yù)防或者治療造影劑引起腎病，優(yōu)選放射性造影劑引起腎病(其是急性腎衰竭(arf)的形式)的方法，其中給予所述哺乳動(dòng)物包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，危重病人是非糖尿病患者。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是通過(guò)以下誘發(fā)的急性應(yīng)激：損害、損傷、創(chuàng)傷、醫(yī)學(xué)處理、感染、中風(fēng)、血管或者冠狀動(dòng)脈架橋術(shù)外科手術(shù)、休克(優(yōu)選心原性休克、出血性休克或者膿毒性休克)、或者心肌梗死的處理。優(yōu)選地，在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選危重病人體內(nèi)維持血糖水平，在約80mg/dl至約110mg/dl之間(約4.4至約6.1mmol/l)。優(yōu)選地，血糖水平維持在約85mg/dl至約100mg/dl之間。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，腸胃外給予根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，靜脈內(nèi)給予藥物組合物。因?yàn)槲Ｖ夭∪嗽谥夭”O(jiān)護(hù)室(icu)住院，根據(jù)本發(fā)明的方法執(zhí)行一至七天，優(yōu)選一至六天，更優(yōu)選一至五天，甚至更優(yōu)選一至四天，又甚至更優(yōu)選一至三天，又甚至更優(yōu)選一至兩天并且特別地僅一天。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，優(yōu)選將胰島素或者胰島素類(lèi)似物共同給予哺乳動(dòng)物，優(yōu)選危重病人。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，將抗心律不齊藥物共同給予哺乳動(dòng)物，優(yōu)選危重病人。根據(jù)本發(fā)明的又另一實(shí)施方式，將營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑共同給予哺乳動(dòng)物，優(yōu)選危重病人。在此，優(yōu)選的是所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑選自下組：鎂、魚(yú)油、鉀、銅、硒、維生素d、維生素e、以及它們的混合物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物(絡(luò)合物)是雙(麥芽醇)氧釩(iv)(也稱(chēng)為bmov)。bmov及其合成是本領(lǐng)域已知的(cas38213-69-3)。因此本發(fā)明還涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物、藥學(xué)上可接受的載體、以及第二組分的藥物組合物，所述第二組分選自下組：鎂、魚(yú)油、鉀、銅、硒、維生素d、以及它們的混合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物，用于維持患有急性應(yīng)激的危重病人的血糖量正常。如上所述，優(yōu)選危重病人是非糖尿病患者。優(yōu)選地，急性應(yīng)激是由損害、損傷、創(chuàng)傷、醫(yī)學(xué)處理、感染、中風(fēng)、冠狀動(dòng)脈架橋術(shù)外科手術(shù)或者心肌梗死的處理誘發(fā)的。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選以足夠的量給予藥物組合物使得血糖水平維持在約80mg/dl至約110mg/dl之間(約4.4至約6.1mmol/l)，優(yōu)選約85mg/dl至約100mg/dl之間。優(yōu)選地，腸胃外或者靜脈內(nèi)給予根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物給予一至七天，優(yōu)選一至六天，更優(yōu)選一至五天，甚至更優(yōu)選一至四天，又甚至更優(yōu)選一至三天，又甚至更優(yōu)選一至兩天并且特別地僅一天。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包括胰島素或者胰島素類(lèi)似物、抗心律不齊藥物、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、或者它們的組合。優(yōu)選地，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑選自下組：鎂、魚(yú)油、鉀、銅、硒、維生素d、維生素e、鉻以及它們的混合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物，用于預(yù)防或者限制患有急性應(yīng)激的危重病人的腎缺血再灌注(i/r)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)釩化合物或者復(fù)合物、藥學(xué)上可接受的載體、以及第二組分的藥物組合物，所述第二組分選自下組：鎂、魚(yú)油、鉀、銅、硒、維生素d、維生素e、鉻、以及它們的混合物。本發(fā)明還涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物，用于預(yù)防或者治療需要其的哺乳動(dòng)物的造影劑誘發(fā)的腎病。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是患有急性應(yīng)激的危重病人。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括生理學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無(wú)機(jī)釩化合物或者復(fù)合物的藥物組合物，用于預(yù)防、限制或者治療需要其的哺乳動(dòng)物的心腎失調(diào)。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是患有急性應(yīng)激的危重病人。實(shí)例材料和方法動(dòng)物本研究方案通過(guò)了阿姆斯特丹大學(xué)學(xué)術(shù)醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。動(dòng)物的處理和關(guān)照遵守實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物研究所的關(guān)照和使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的指南。將具有平均體重280±30克的三十二只雄性維斯塔大鼠(wistarrat)(harlannetherlandsbv,horst,thenetherlands)用于本項(xiàng)研究。在開(kāi)始研究之前將動(dòng)物隔離一周，以便允許適應(yīng)它們的新環(huán)境并且在保持溫度在22±1℃具有相對(duì)濕度為55±10％的燈光控制室中在常規(guī)籠子中使動(dòng)物成對(duì)地居住。全部動(dòng)物都接收標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的大鼠食物和水用于無(wú)限制地消耗。手術(shù)準(zhǔn)備最初使用克他命(nimatek，eurovetanimalhealthbv，bladel，荷蘭；90mg/kg)、右旋美托咪啶(dexdomitor，pfizeranimalhealthbv，capelleaandenijssel，荷蘭；0.5mg/kg)、硫酸阿托品(centrafarmbv，etten-leur，荷蘭；0.05mg/kg)的混合物通過(guò)腹膜內(nèi)注射來(lái)麻醉所有動(dòng)物。一旦麻醉，在開(kāi)始外科手術(shù)之前將胸骨柄(thoracicmanubrium)和下巴之間的區(qū)域以及覆蓋左側(cè)腎臟的左側(cè)肋部剃毛并且清潔。在外科手術(shù)準(zhǔn)備過(guò)程和實(shí)驗(yàn)過(guò)程的剩余時(shí)間期間，通過(guò)氣管切開(kāi)術(shù)和具有0.4的吸入氧氣分?jǐn)?shù)(fio2)的機(jī)械通氣裝置來(lái)維持麻醉。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間維持體溫在37±0.5℃。調(diào)整通氣裝置的設(shè)置以保持動(dòng)脈pco2在35至40mmhg之間。為了藥物以及流體管理和血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)，三個(gè)容器插有聚乙烯導(dǎo)管(外徑＝0.9mm；braun，melsungen，德國(guó))。右頸動(dòng)脈中的導(dǎo)管連接到壓力傳感器以監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓和心率。為了以15ml/kg/hr的速率連續(xù)灌輸林格乳酸鹽(baxter，utrecht，荷蘭)將導(dǎo)管插入右頸靜脈。為了取出血樣進(jìn)行血液氣體分析，將導(dǎo)管插入股動(dòng)脈。在全部實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物保持在全身麻醉下并且接收連續(xù)的靜脈內(nèi)稀釋的克他命或者鎮(zhèn)痛藥輸注。通過(guò)在左側(cè)肋部上約～4cm的切口將左側(cè)腎臟暴露，去被膜，以及固定在路賽特(lucite)(即聚(甲基丙烯酸甲酯)；pmma)定制的腎杯中。腎動(dòng)脈和靜脈被仔細(xì)地分離以保護(hù)周?chē)纳窠?jīng)和腎上腺。血管周?chē)曀矔r(shí)流量探針(型號(hào)0.7rb；transonicsystems，伊薩卡島，紐約，美國(guó))放置在左側(cè)腎動(dòng)脈周?chē)⑶疫B接至流量計(jì)(t206；transonicsystems，伊薩卡島，紐約，美國(guó))以允許腎血流量(rbf)的連續(xù)測(cè)量。分離、結(jié)扎左側(cè)輸尿管，并且用聚乙烯導(dǎo)管進(jìn)行插管(外徑＝0.9mm；braun，梅爾松根，德國(guó))，用于收集尿液。將一小片鋁箔(10x10mm)放置在腎靜脈的背面部位上以防止并列組織和下部組織促進(jìn)在靜脈po2測(cè)量中干擾磷光信號(hào)。在外科手術(shù)方案(～60min)之后，將一根光纖放置在去被膜腎臟上方1mm并且將另一光纖放置在腎靜脈上方1mm從而使用磷光壽命技術(shù)(20)來(lái)測(cè)量氧化。隨后靜脈內(nèi)注入帶氧體g2(oxyphorg2)(oxygenenterprises，費(fèi)城，賓夕法尼亞州，美國(guó)；6mg/kg)5min，接下來(lái)是30min穩(wěn)定時(shí)間。手術(shù)區(qū)域貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)都覆蓋有濕潤(rùn)的紗網(wǎng)敷布用于防止外科手術(shù)區(qū)域中暴露組織的干燥。磷光壽命測(cè)量已經(jīng)更詳細(xì)地在別處(20)描述。通過(guò)灌輸1ml3m氯化鉀來(lái)終止實(shí)驗(yàn)。最終，移除腎臟、稱(chēng)量并且處理用于組織學(xué)評(píng)估。還在事后檢查導(dǎo)管的正確位置。實(shí)驗(yàn)方案在外科手術(shù)準(zhǔn)備完成之后，接著是30min的穩(wěn)定時(shí)間，每只動(dòng)物被隨機(jī)分配到以下組中：bmov7mg/kg(n＝6)；bmov15mg/kg；(n＝6)，i/r對(duì)照(n＝8)，以及時(shí)間對(duì)照(n＝3)。在30分鐘局部缺血期之前開(kāi)始15分鐘bmov灌輸并且貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)連續(xù)地進(jìn)行灌輸。血液動(dòng)力學(xué)和血液氣體參數(shù)從右頸總動(dòng)脈連續(xù)地監(jiān)控平均動(dòng)脈壓(map)。此外，使用瞬時(shí)超聲流量探針(trans-timeultrasoundflowprobe)(型號(hào)0.7rb；transonicsystemsinc，伊薩卡島，紐約)連續(xù)地記錄腎動(dòng)脈血流量[rbf；ml/min]。在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血之后90min(r90min)從頸動(dòng)脈取動(dòng)脈血樣(0.5ml)。用相同體積的hes130/0.4(6％hes130/0.4；freseniuskabinederlandb.v.，schelle，比利時(shí))替代血樣。樣品用來(lái)確定血液氣體值(abl505血液氣體分析器；radiometer，哥本哈根，丹麥)，以及用于確定血紅蛋白濃度、血紅蛋白氧飽和度、以及鈉和鉀濃度(osm3；radiometer)。腎微脈管以及靜脈po2全身性注入白蛋白靶向的(并且因此限定循環(huán))磷光染料(帶氧體g2；oxygenenterprises，ltd.，費(fèi)城，賓夕法尼亞州，美國(guó))的氧氣淬滅的磷光壽命使用雙波長(zhǎng)時(shí)域磷光計(jì)測(cè)量，并且用于檢測(cè)微血管和靜脈po2(μpo2)中的變化。帶氧體g2(四-(4-羧基-苯基)苯并卟啉的雙層谷氨酸酯樹(shù)枝狀化合物)具有兩個(gè)激發(fā)峰(λ激發(fā)1＝440nm，λ激發(fā)2＝632nm)和一個(gè)發(fā)射峰(λ發(fā)射＝800nm)，由于激發(fā)光的不同光學(xué)穿透深度其允許在腎皮質(zhì)和外部髓質(zhì)中同時(shí)進(jìn)行壽命測(cè)量。為了測(cè)量腎靜脈po2(prvo2)使用單波長(zhǎng)頻率域磷光計(jì)。測(cè)量的壽命和po2值之間的相互關(guān)系通過(guò)斯特恩-沃爾默關(guān)系(stern-volmerrelation)給出：1/τ＝(1/τ0)+kq[o2]，其中τ是測(cè)量的壽命，τ0是在0mmhg的氧濃度下的壽命并且kq是已知的淬滅常數(shù)。腎功能收集來(lái)自左側(cè)輸尿管的尿液樣品進(jìn)行尿液體積和肌酸酐濃度的分析。在每個(gè)尿液收集期間的中點(diǎn)處獲得用于分析肌酸酐濃度的血漿樣品。通過(guò)比色法確定尿液和血漿中肌酸酐的濃度。肌酐清除率(clearcrea[ml/min])評(píng)估為腎小球?yàn)V過(guò)率的指數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)公式完成清除率的計(jì)算：clearcrea＝(ucrea×v)/pcrea,其中ucrea是尿液中肌酸酐的濃度，v是每單位時(shí)間尿液體積，而pcrea是血漿中肌酸酐的濃度。此外，分析了全部尿液樣品的鈉(na+)濃度。na+(efna+[％])的排出分?jǐn)?shù)用做腎小管功能的標(biāo)志并且計(jì)算如下：efna+＝(una+×pcrea)/(pna+×ucrea)×100,其中una+是尿液中na+濃度，而pna+是血漿中na+的濃度。clearcrea以及efna+在基線(xiàn)時(shí)和再灌注之后進(jìn)行確定。免疫組織化學(xué)分析將腎臟組織固定在4％福爾馬林中并且包埋在石蠟中。腎臟切片(5μm)用二甲苯脫石蠟并且用逐漸減少百分比的乙醇并且最終用水進(jìn)行再水化。通過(guò)在檸檬酸鹽緩沖液(ph6.0)(thermoscientific，ap-9003-500)中微波載玻片10min來(lái)完成抗原恢復(fù)。在室溫下，將載玻片放置冷卻20分鐘，然后用蒸餾水漂洗。切片的周?chē)胮ap筆標(biāo)記。在室溫下使用3％h2o2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性10min并且隨后使用蒸餾水和pbs漂洗。將封閉試劑(labvision，ta-125-ub)施加于每個(gè)載玻片，隨后在室溫下在潮濕小室內(nèi)孵育5min。在4℃下使用兔多克隆inos抗體(inosab-1，兔pab，rb-1605-p，neomarkersfremont，ca)和il-6(abcam，6672)孵育腎臟切片過(guò)夜，并且在室溫下用抗髓過(guò)氧化物酶(mpo)抗體(髓過(guò)氧化物酶ab-1，rb-373-a，neomarkersfremont，ca)、脂鈣蛋白2抗體(ngal)(abcam41105)、針對(duì)大鼠l-fabp的多克隆抗體(hycultbiotecthp8010)孵育1小時(shí)。在大量ultrabdiluent(ultrab稀釋劑)(thermoscientific，ta-125-ud)中稀釋抗體。在pbs中洗滌切片三次，每次5min，然后在室溫下使用生物素化的山羊抗兔抗體(labvision，tp-125-bn)孵育30min。在pbs中洗滌載玻片之后，在潮濕的小室中在室溫下施加鏈霉親和素過(guò)氧化物酶標(biāo)簽試劑(labvision，ts-125-hr)30min。通過(guò)與aec一起孵育將帶顏色產(chǎn)物顯色。使用邁爾(mayer)氏蘇木精(labvision，ta-125-mh)復(fù)染載玻片并且安裝在視覺(jué)支架(visionmount)中(labvision，ta-060-ug)，然后在蒸餾水中洗滌。對(duì)inos、il-6、l-fabp、ngal以及mpo染色強(qiáng)度和分布兩者進(jìn)行評(píng)分。對(duì)于每個(gè)樣品，通過(guò)將在每個(gè)強(qiáng)度下染色的細(xì)胞的百分比乘以染色的加權(quán)強(qiáng)度求和來(lái)得到組織學(xué)評(píng)分(hscore)值[hscore＝spi(i+1)，其中i是強(qiáng)度評(píng)分而pi是細(xì)胞的相應(yīng)百分比](senturket.al.,1999)。在放大倍數(shù)x400下在光學(xué)顯微鏡下在來(lái)自240個(gè)選擇的腎小球中的各個(gè)腎小球中以及在240個(gè)選擇的腎小管周?chē)鷧^(qū)域中，我們?cè)u(píng)估m(xù)po反應(yīng)。如果在腎小球中可以看見(jiàn)白細(xì)胞，我們?cè)u(píng)分為1，而如果看不見(jiàn)則評(píng)分為0(demirciet.al.,2006；legrandet.al；2009)。統(tǒng)計(jì)分析使用graphpadprism版本5.0(用于視窗系統(tǒng))(graphpad軟件公司，拉喬拉市，加利福尼亞州，美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。全部數(shù)據(jù)都表示為平均數(shù)±sd。使用bonferroni事后檢驗(yàn)通過(guò)雙向方差分析(anova)進(jìn)行組和時(shí)間點(diǎn)之間的參數(shù)比較分析。具有小于0.05p值的之間的差值被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)顯著的。表1示出時(shí)間對(duì)照結(jié)果。這些結(jié)果示出通過(guò)i/r損傷降低了平均動(dòng)脈壓，bmov不影響平均動(dòng)脈壓而且bmov的作用不是劑量依賴(lài)性的。表1bslnr90(min)p-值平均動(dòng)脈壓103.5±4.298.5±4.5>0.05腎血管阻力22±222±2>0.05腎血流量4.7±0.64.6±0.5>0.05腎do21.2±0.21.2±0.1>0.05cμpo265±760±6>0.05mμpo252±649±7>0.05腎vo20.13±0.070.19±0.06>0.05尿液量0.0022±0.00070.0020±0.0007>0.05平均動(dòng)脈壓如圖1所示，bmov不影響平均動(dòng)脈壓(圖1示出在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌輸90min(r90min)之后的平均動(dòng)脈(art.)壓。nsp>0.05(不顯著)，*p<0.05，**p<0.01，以及***p<0.001相對(duì)于bsln)。腎臟血液動(dòng)力學(xué)以及氧氣遞送數(shù)據(jù)示出腎血管阻力不受i/r損傷影響，但是顯著地降低腎血流量和氧氣運(yùn)送。該數(shù)據(jù)還示出bmov不影響腎血流量和氧氣運(yùn)送而且該bmov的作用不是劑量依賴(lài)性的。如圖2所示，bmov不影響腎血液動(dòng)力學(xué)和氧氣運(yùn)送(圖2示出了在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)后腎血管阻力(vasc.res.)(上列)，腎血流量(中間列)，以及腎氧氣運(yùn)送(下列)。nsp>0.05(不顯著)，*p<0.05，**p<0.01，以及***p<0.001相對(duì)于bsln)。腎微血管氧化該數(shù)據(jù)表明在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)中微血管氧化通過(guò)i/r損傷顯著地降低。該數(shù)據(jù)還示出bmov顯著地增加在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)中的微血管氧化而且該bmov作用不是劑量依賴(lài)性的。如圖3所示，bmov顯著地增加微血管氧化(圖3示出在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)后在皮質(zhì)(上列)和髓質(zhì)(下列)中的腎微血管氧張力(μpo2)。nsp>0.05(不顯著)，*p<0.05，**p<0.01，以及***p<0.001相對(duì)于bsln)。腎功能該數(shù)據(jù)表示腎氧消耗和肌酐清除率不受i/r損傷影響，但是鈉再吸收所需氧氣量(vo2/tna+)增加，表示降低的腎臟氧氣利用效率。該數(shù)據(jù)還示出bmov增加腎臟氧氣利用效率而且bmov的作用不是劑量依賴(lài)性的。圖4示出了bmov增加腎臟氧氣利用效率(圖4示出了在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)后腎臟氧氣消耗(上列)，鈉再吸收所需的氧氣量(vo2/tna+)(中間列)，以及肌酐清除率(creat.clear.)(下列)。nsp>0.05(不顯著)，*p<0.05，**p<0.01，以及***p<0.001相對(duì)于bsln)。圖5示出了在基線(xiàn)(bsln)時(shí)以及在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)之后的尿液輸出量。nsp>0.05(不顯著)。炎癥激活的生物標(biāo)志物該數(shù)據(jù)還示出i/r損傷導(dǎo)致炎癥激活。該數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明bmov顯著地降低炎癥激活而且bmov的作用是劑量依賴(lài)性的，即，與使用低劑量治療的組中的水平相比較，在使用高劑量bmov治療的組中inos表達(dá)顯著更低。如圖6所示，bmov顯著地降低炎癥激活(圖6示出了在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)之后的il-6和inos表達(dá)(上列)以及mpo-染色的白細(xì)胞外觀)(下列)。nsp>0.05(不顯著)，*p<0.05，**p<0.01，以及***p<0.001相對(duì)于i/r對(duì)照)。腎損傷的生物標(biāo)志物該數(shù)據(jù)示出i/r導(dǎo)致腎損傷。該數(shù)據(jù)還示出bmov顯著地降低腎損傷而且bmov的作用是劑量依賴(lài)性的，即，與用低劑量治療的組中的水平相比較，在用高劑量bmov治療的組中ngal水平顯著更低。如圖7所示，bmov顯著地降低腎損傷(圖7示出了在局部缺血30min和再灌注90min(r90min)之后的il-6和inos表達(dá)(上行)以及mpo-染色的白細(xì)胞外觀)(下行)。nsp>0.05(不顯著)，*p<0.05，**p<0.01，以及***p<0.001相對(duì)于i/r對(duì)照，以及+p<0.05相對(duì)于bmov7mg/kg)。結(jié)論腎i/r導(dǎo)致：1)降低平均動(dòng)脈壓；2)降低腎血流量和氧氣遞送；3)降低在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)中的微血管氧化；4)降低腎臟氧利用效率；5)炎癥激活；以及6)腎損傷。bmov不影響：1)平均動(dòng)脈壓；以及2)腎臟血液動(dòng)力學(xué)以及氧氣遞送。bmov引起1)增加微血管氧化；2)增加腎臟氧利用效率；3)減少炎癥激活；以及4)減少腎損傷。當(dāng)前第1頁(yè)12