哺乳動物沖卵液及其配制方法和應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明設及動物胚胎移植技術領域，具體地說，設及一種哺乳動物沖卵液及其配 制方法和應用。
【背景技術】
[000^ 超數(shù)排卵和胚胎移植技術(M0ET化牛、羊改良和育種中已經廣泛應用。在M0ET過 程中，胚胎(卵）回收效率的高低直接影響了后續(xù)胚胎移植的進行。胚胎(卵）的回收一般在 超排供體配種3~8天后進行，所采用的胚胎(卵）回收方法分為手術法和非手術法。牛的胚 胎回收方法主要采用非手術法，其具體操作過程是用帶金屬忍的沖卵管插入一側供體子宮 角，給氣囊充氣，固定沖卵管，抽出金屬忍，用配制好的沖卵液把位于子宮角的胚胎沖洗出 來。目前，國內常用TCM-199、化nk' S液等進口合成緩沖液作為牛胚胎沖卵液使用，由于其價 格昂貴，合成條件要求嚴格等問題，影響了牛超數(shù)排卵技術的推廣和應用。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種哺乳動物沖卵液及其配制方法。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供上述沖卵液在哺乳動物非手術法胚胎移植技術中的應 用。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種哺乳動物沖卵液，所述沖卵液包括I液、Π 液 和轄牛血清；
[0006] 所述I液包括氯化鋼W及氯化鐘、氯化巧和氯化儀中的至少一種;所述Π 液包括憐 酸氨二鋼和/或其水合物W及果糖，任選包括憐酸二氨鐘。
[0007] 具體地，所述I液包括氯化鋼5.0-10.0 g/L、氯化鐘0-0.5g/L、氯化巧0-0.5g/L和氯 化儀0-0.5g/L。優(yōu)選地，所述I液包括氯化鋼7.0-9. Og/L、氯化鐘0.1-0.3g/L、氯化巧0.1- 0.3g/L和氯化儀0.1-0.3肖/1。更優(yōu)選地，所述1液包括氯化鋼8.0肖凡、氯化鐘0.2肖/1、氯化巧 0.1邑/1和氯化儀0.1邑/1。
[000引所述Π 液包括憐酸氨二鋼1.0-2. Og/L或屯水合憐酸氨二鋼1.0-3 . Og/L或十二水 合憐酸氨二鋼1.0-3. Og/L、憐酸二氨鐘0-0.5g/L和D-果糖1.0-3. Og/L。優(yōu)選地，所述Π 液包 括憐酸氨二鋼1.0-1.2g/L或屯水合憐酸氨二鋼2.0-2.2g/L或十二水合憐酸氨二鋼2.6- 3. Og/L、憐酸二氨鐘0.1-0.3g/L和D-果糖1.0-1.5g/L。更優(yōu)選地，所述Π 液包括十二水合憐 酸氨二鋼2.9g/L、憐酸二氨鐘0.2g/L和D-果糖1. Og/L。
[0009] 使用時，將I液和Π 液按1: 2-2:1的體積比（優(yōu)選體積比1:1)混合，然后向混合液中 添加10-15V/V%的轄牛血清，即得所述哺乳動物沖卵液。
[0010] 本發(fā)明還提供所述沖卵液的配制方法，用去離子水或蒸饋水，按照各組分含量分 別配制I液和Π 液，120°C高壓滅菌15-20分鐘后，將I液和Π 液按比例混合，然后向混合液中 添加轄牛血清，即得。
[0011] 本發(fā)明進一步提供所述沖卵液在哺乳動物非手術法胚胎移植技術中的應用。
[0012]本發(fā)明所述哺乳動物包括但不限于牛、羊、馬、小鼠。優(yōu)選地，所述哺乳動物為牛。 [QQU]本發(fā)明提供的哺乳動物沖卵液，制備簡單，滲透壓及pH范圍(抑7.1-7.4)更接近供 體子宮內的生理環(huán)境，能夠延長胚胎在體外保存時間，有利于牛、羊胚胎規(guī)?；a和胚胎 移植技術的推廣應用。
【具體實施方式】
[0014] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0015] 實施例1哺乳動物沖卵液及其制備
[0016] 沖卵液I液的配制：使用電子天平按表1比例稱取氯化鋼、氯化鐘、氯化巧和氯化 儀，去離子水或蒸饋水充分溶解，120°C高壓滅菌15-20分鐘，室溫靜置保存。
[0017] 沖卵液II液的配制:使用電子天平按表2比例稱取十二水合憐酸氨二鋼、憐酸二氨 鐘和D-果糖，去離子水或蒸饋水充分溶解，120°C高壓滅菌15-20分鐘，室溫靜置保存。
[0018] 沖卵液的配制:將I液和Π 液按表3比例充分混合，然后添加混合液10-15V/V%的 轄牛血清，即得哺乳動物沖卵液。
[0019] 表1沖卵液I液配方 [0020]
[0021] 表2沖卵液II液配方
[0022]
[0025] 實施例2不同沖卵液對奶牛胚胎生產和胚胎移植的影響
[0026] 1、供體牛:選擇180頭，18-20月齡青年奶牛為供體。
[0027] 2、供體牛超排處理:超排采用常規(guī)方法，即連續(xù)4天注射促卵泡成熟激素(F甜），劑 量逐日遞減。具體為:供體牛發(fā)情周期任意埋植CIDR(第0天），第5-8天早、晚各肌注FSH，第7 天注射F甜同時分別肌注前列腺素(PG)，同時晚上撤除CIDRdFSH注射總劑量為7.8-8.4mg。
[0028] 3、人工授精:供體發(fā)情后12小時第一次人工授精，間隔12小時后第二次人工授精。 每次使用1支冷凍細管精液，輸精部位為子宮體。
[0029] 4、胚胎采集:供體母牛配種后第7天采用非手術方法回收胚胎。每側子宮角反復沖 洗6~7次，所用沖卵液為實施例1中制備的沖卵液A~G，CN102864122A中公開的馬屬動物沖 卵液及TCM-199(幾種沖卵液的滲透壓與抑值比較見表4)，沖卵液使用量為250-400mL。
[0030] 5、胚胎移植:選擇30枚可用胚胎，隨機分為2組，每組15枚胚胎，分別保存在上述沖 卵液中，室溫保存2小時之后進行胚胎移植。
[0031] 結果表明，相比于馬屬動物沖卵液和TCM-199,使用本發(fā)明制備的沖卵液用于牛的 胚胎回收和胚胎移植，獲得的可用胚胎數(shù)和受體胚胎移植受胎率更高，提高了牛超數(shù)排卵 的效率(表5和表6)。
[0032] 表4幾種沖卵液的滲透壓與抑值比較
[0033]
[0036]表6不同沖卵液的保存對胚胎移植的影響
[0037]
[00；3 引
[0039] 實施例3黑安格斯肉牛的胚胎生產
[0040] 1、供體牛:選擇34頭，18-22月齡青年黑安格斯肉牛為供體。
[0041 ] 2、供體牛FSH注射劑量為10.0 mg，所用沖卵液為實施例1中制備的沖卵液A，具體操 作同實驗例2中的描述。
[0042] 結果表明，使用沖卵液A超排黑安格斯肉牛能夠獲得可用胚胎8.3枚(表7)。
[0043] 表7黑安格斯肉牛胚胎生產結果(單位:頭，枚）
[0044]
[0045] W上結果表明，利用本發(fā)明配制的沖卵液能夠提高牛超數(shù)排卵效率和胚胎移植受 胎率。沖卵液制備方法簡單、成本低廉，有利于胚胎在體外的短期保存，能夠滿足牛、羊胚胎 的規(guī)模化生產需要，促進了胚胎移植技術的推廣應用。
[0046] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可W對之作一些修改或改進，運對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的運些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種哺乳動物沖卵液，其特征在于，所述沖卵液包括I液、Π 液和犢牛血清； 所述I液包括氯化鈉以及氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂中的至少一種;所述π液包括磷酸氫 二鈉和/或其水合物以及果糖，任選包括磷酸二氫鉀。2. 根據(jù)權利要求1所述的沖卵液，其特征在于，所述I液包括氯化鈉5.0-10.0 g/L、氯化 鉀 0-0.5g/L、氯化鈣 0-0.5g/L 和氯化鎂 0-0.5g/L。3. 根據(jù)權利要求2所述的沖卵液，其特征在于，所述I液包括氯化鈉7.0-9. Og/L、氯化鉀 0.1-0.3g/L、氯化鈣 0.1-0.3g/L 和氯化鎂 0.1-0.3g/L。4. 根據(jù)權利要求3所述的沖卵液，其特征在于，所述I液包括氯化鈉8. Og/L、氯化鉀 0.2g/L、氯化鈣0. lg/L和氯化鎂0. lg/L。5. 根據(jù)權利要求1所述的沖卵液，其特征在于，所述Π 液包括磷酸氫二鈉1.0-2. Og/L或 七水合磷酸氫二鈉1.0-3. Og/L或十二水合磷酸氫二鈉1.0-3. Og/L、磷酸二氫鉀0-0.5g/L和 D-果糖 1.0-3.0g/L。6. 根據(jù)權利要求5所述的沖卵液，其特征在于，所述Π 液包括磷酸氫二鈉1.0-1.2g/L或 七水合磷酸氫二鈉2.0-2.2g/L或十二水合磷酸氫二鈉2.6-3.0g/L、磷酸二氫鉀0.1-0.3g/L 和 D-果糖 1.0_1.5g/L。7. 根據(jù)權利要求6所述的沖卵液，其特征在于，所述Π 液包括十二水合磷酸氫二鈉 2.9g/L、磷酸二氫鉀 0.2g/L 和 D-果糖 1.0g/L。8. 根據(jù)權利要求1-7任一項所述的沖卵液，其特征在于，使用時，將I液和Π 液按1:2-2: 1的體積比混合，然后向混合液中添加1 〇-15v/v%的犢牛血清，優(yōu)選地，I液和Π 液按1:1的 體積比混合。9. 根據(jù)權利要求1-7任一項所述沖卵液的配制方法，其特征在于，用去離子水或蒸餾 水，按照各組分含量分別配制I液和Π 液，120°C高壓滅菌15-20分鐘后，將I液和Π 液按比例 混合，然后向混合液中添加犢牛血清，即得。10. 根據(jù)權利要求1-7任一項所述沖卵液在哺乳動物非手術法胚胎移植技術中的應用， 所述哺乳動物包括牛、羊、馬、小鼠，優(yōu)選牛。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種哺乳動物沖卵液及其配制方法，所述沖卵液包括Ⅰ液、Ⅱ液和犢牛血清；所述Ⅰ液包括氯化鈉以及氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂中的至少一種；所述Ⅱ液包括磷酸氫二鈉和/或其水合物以及果糖，任選包括磷酸二氫鉀。其配制方法為：用水分別配制Ⅰ液和Ⅱ液，120℃高壓滅菌15-20分鐘后，將Ⅰ液和Ⅱ液按比例混合，并向混合液中添加適量犢牛血清即得。本發(fā)明還提供所述沖卵液在哺乳動物非手術法胚胎移植技術中的應用。本發(fā)明提供的哺乳動物沖卵液，制備簡單，滲透壓及pH范圍(pH7.1-7.4)更接近供體子宮內的生理環(huán)境，能夠延長胚胎在體外保存時間，有利于牛、羊胚胎規(guī)?；a和胚胎移植技術的推廣應用。
【IPC分類】A61D19/04, C12N5/073
【公開號】CN105670988
【申請?zhí)枴緾N201610073489
【發(fā)明人】郝海生, 朱化彬, 宋金輝
【申請人】中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年2月2日