本發(fā)明涉及一種絲素纖維復(fù)合支架及其制備方法，可用于軟組織、硬組織修復(fù)及藥物緩釋等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，通過組織或器官移植來修復(fù)功能損失已經(jīng)被廣泛接受，然而卻面臨著巨大的供體缺口。通過再生醫(yī)學(xué)手段體在體內(nèi)或體外形成組織或器官為受損功能的修復(fù)提供了新的治療方案。其中，組織工程支架材料的選擇及構(gòu)建成為該治療方法的關(guān)鍵之一。

蠶絲蛋白是來源于自然界的天然高分子生物材料，具有優(yōu)異的力學(xué)性質(zhì)、可控的生物降解性、易加工性，特別是其與膠原同等的生物相容性而成為理想的再生醫(yī)學(xué)支架的原材料。目前，制備絲素蛋白多孔支架的方法有很多，包括冷凍干燥、鹽析法、氣體發(fā)泡法、三維打印等，然而這些方法都依然存在一些難以克服的不足。例如，冷凍干燥法易形成片層結(jié)構(gòu)，不利于細(xì)胞與組織生長，盡管現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了一種反復(fù)進(jìn)行膜溶解控制絲素蛋白自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成多孔支架，但效率低，重復(fù)性差，并且孔壁結(jié)構(gòu)的存在直接限制細(xì)胞的遷移與相互作用，組織生長也因此受限。

為此，克服現(xiàn)有加工技術(shù)與絲蛋白支架結(jié)構(gòu)的上述問題，開發(fā)一種制備方法，并構(gòu)建出有利于細(xì)胞與組織生長的絲素支架對(duì)絲素蛋白在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用及再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用都具有非常重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種絲素纖維復(fù)合支架的制備方法，及由該方法制備的絲素纖維復(fù)合支架，具有多孔支架的大孔徑高空隙率優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有纖維狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，并結(jié)合生物相容性高分子材料，能夠極大促進(jìn)細(xì)胞生長，如細(xì)胞增殖與遷移、和組織生長，對(duì)組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用非常有利。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種絲素纖維復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟，將脫膠蠶絲分散于鹽/甲酸混合液中，得到絲素纖維分散液；然后加入高分子材料與氯化鈉，混合均勻得到絲素混合液；然后將絲素混合液置于流動(dòng)的水中處理，得到濕態(tài)絲素纖維支架；將濕態(tài)絲素纖維支架進(jìn)行冷凍處理得到冷凍體，然后對(duì)冷凍體進(jìn)行冷凍干燥即得到絲素纖維復(fù)合支架；所述高分子材料為殼聚糖和/或膠原。

上述技術(shù)方案中，所述蠶絲為桑蠶絲、柞蠶絲、蓖麻蠶絲或者天蠶絲，優(yōu)選桑蠶絲。

上述技術(shù)方案中，所述甲酸的質(zhì)量濃度為50-99%，優(yōu)選80-98%；所述鹽/甲酸混合液中，鹽的質(zhì)量濃度為0.1-1%，鹽為氯化鈣、溴化鋰等。本發(fā)明以鹽/甲酸分散絲素蛋白纖維，而不溶解，制備的天然絲素纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，具有高孔隙率、高貫通率、優(yōu)良的力學(xué)性能。

上述技術(shù)方案中，所述絲素纖維分散液中，絲素纖維的質(zhì)量濃度為0.1-50%，優(yōu)選1-10%。

上述技術(shù)方案中，所述氯化鈉的粒徑為1μm～2mm，優(yōu)選100-600μm。由此得到的多孔結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的黏附與生長，及組織長入。

上述技術(shù)方案中，所述絲素纖維與氯化鈉的質(zhì)量比為1∶（10-500），優(yōu)選1∶（20-200）。由此得到的支架具有更為均勻的多孔結(jié)構(gòu)、適宜的孔隙率，更適合細(xì)胞與組織生長。

上述技術(shù)方案中，所述絲素纖維與高分子材料的質(zhì)量比為1∶（0.1-0.15）。高分子材料具有良好的生物相容性，與絲素纖維復(fù)合不但可以提高多孔支架的力學(xué)性能，增加可加工性，而且可以保持支架用作組織結(jié)構(gòu)制作需要的生物特性。

上述技術(shù)方案中，冷凍處理的溫度為-10～-196℃，冷凍干燥的溫度為-10～-80℃，冷凍處理的時(shí)間少于冷凍干燥的時(shí)間；這樣處理的優(yōu)點(diǎn)是兼顧能源節(jié)約與多孔結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定獲取。

本發(fā)明還公開了根據(jù)上述制備方法制備的絲素纖維復(fù)合支架，其內(nèi)部主要由絲素纖維構(gòu)成，纖維直徑為50nm-50μm，同時(shí)纖維之間還存在高分子材料；支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為50μm~1mm，壓縮模量為5kPa-100MPa。

本發(fā)明的絲素復(fù)合支架因具有三維多孔結(jié)構(gòu)，可以為細(xì)胞的粘附增殖、及組織的再生提供三維空間，并且有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，因此本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述絲素纖維復(fù)合支架在制備組織工程支架中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明直接以天然絲素纖維構(gòu)建纖維多孔材料，該制備方法利用酸對(duì)蠶絲的良好分散性以及少量鹽存在的微溶作用，結(jié)合處理工藝，所制備的絲素纖維復(fù)合支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，同時(shí)存在高分子材料，具有高孔隙率、高貫通率、優(yōu)良的力學(xué)性能，非常有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細(xì)胞的遷移、組織的生長，是理想的組織工程支架。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例一

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得絲素蛋白纖維；將其分散于0.15%氯化鈣88%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度2%；

（2）通過分篩獲得直徑200-400μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入殼聚糖，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、殼聚糖的質(zhì)量比為1∶100∶0.1；

（3）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-20℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約11kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為880nm-50μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為690μm~1mm。

實(shí)施例二

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于0.15%氯化鈣98%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度2%；

（2）通過分篩獲得直徑200-400μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入膠原，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、膠原的質(zhì)量比為1∶100∶0.1；

（3）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約12kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為500nm-25μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為900μm~0.9mm。

實(shí)施例三

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于0.1%溴化鋰98%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度6%；

（2）通過分篩獲得直徑100-200μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入膠原，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、膠原的質(zhì)量比為1∶30∶0.15；

（3）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-20℃冷凍，然后-80℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約89kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為660nm-36μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為560μm~1mm。

實(shí)施例四

（1）天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于0.5%氯化鈣98%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度4%；

（2）通過分篩獲得直徑200-250μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入膠原，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、膠原的質(zhì)量比為1∶50∶0.15；

（3）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-196℃冷凍，然后-10℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約38kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為900nm-50μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為520μm~0.5mm。

實(shí)施例五

（1）天然天蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于1%氯化鈣90%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度2%；

（2）通過分篩獲得直徑200-400μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入膠原，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、膠原的質(zhì)量比為1∶100∶0.12；

（3）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-100℃冷凍，然后-50℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約19kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為800nm-30μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為960μm~1mm。

實(shí)施例六

（1）天然蓖麻蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于0.5%溴化鋰90%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度8%；

（2）通過分篩獲得直徑200-350μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入殼聚糖，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、殼聚糖的質(zhì)量比為1∶180∶0.15；

（3）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約102kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為640nm-38μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為50μm~0.5mm。

實(shí)施例七

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于0.2%氯化鈣98%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度5%；

（2）通過分篩獲得直徑50-80μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入膠原與殼聚糖，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、膠原、殼聚糖的質(zhì)量比為1∶90∶0.05∶0.08；

（3）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-20℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約58kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為800nm-49μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為700μm~1mm。

實(shí)施例八

（1）天然蓖麻蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于0.7%氯化鈣98%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度4%；

（2）通過分篩獲得直徑160-220μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入膠原，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、膠原、殼聚糖的質(zhì)量比為1∶90∶0.15；

（4）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-10℃冷凍，然后-60℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約90kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為50nm-45μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為500μm~0.8mm。

實(shí)施例九

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于0.6%氯化鈣98%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度10%；

（3）通過分篩獲得直徑200-220μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入膠原與殼聚糖，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、膠原、殼聚糖的質(zhì)量比為1∶200∶0.05∶0.05；

（4）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-80℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約260kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為100nm-50μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為520μm~1mm。

實(shí)施例十

（1）天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復(fù)3次后獲得純絲素蛋白纖維；分散于1%溴化鋰98%甲酸溶劑中，絲素纖維分散液濃度6%；

（3）通過分篩獲得直徑60-80μm的氯化鈉顆粒，然后加入絲素纖維分散液中，并攪拌均勻，加入殼聚糖，得到絲素混合液，絲素纖維與氯化鈉、膠原、殼聚糖的質(zhì)量比為1∶50∶0.15；

（4）將絲素混合液浸入流動(dòng)水中去除氯化鈉，得到濕態(tài)絲素纖維支架；濕態(tài)絲素纖維支架在-20℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維復(fù)合支架，壓縮模量約100kPa，支架內(nèi)部纖維直徑為350nm-10μm，纖維之間還存在高分子材料，支架孔隙率大于50%，孔徑范圍為500μm~1mm。