本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)美容制劑領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪組織制劑及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1889年，游離脂肪移植的首例臨床應(yīng)用被報(bào)道。隨后，脂肪抽吸技術(shù)于20世紀(jì)80年代開(kāi)始出現(xiàn)，使自體脂肪顆粒的獲得變得常見(jiàn)和普通，這極大地促進(jìn)了脂肪移植與吸脂術(shù)的有機(jī)結(jié)合，自體脂肪顆粒注射移植技術(shù)也因此得到迅速發(fā)展。自體脂肪顆粒游離移植，不僅取材更加容易，而且因具有對(duì)供受體部位創(chuàng)傷小，不留瘢痕，生物相容性好，無(wú)排斥及過(guò)敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在整形外科修復(fù)各種軟組織凹陷或缺損中得到了廣泛應(yīng)用。但是，現(xiàn)實(shí)中移植后的脂肪存活率較低，一般僅為30％-70％。研究發(fā)現(xiàn)，在移植早期，脂肪移植物缺乏有效的血液供應(yīng)而處于急性缺血缺氧狀態(tài)。在移植物與宿主建立充分的血供之前，脂肪組織只能靠周?chē)M織液的浸潤(rùn)和滲透來(lái)維持營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，而這種供應(yīng)的距離只有150～200μm，超過(guò)該距離就需要生成新的血管來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)。然而，新生血管生長(zhǎng)緩慢，每天只生長(zhǎng)十幾微米，新生血管一般要在移植后5d才能長(zhǎng)入移植物的周邊部位，這時(shí)中央部分的脂肪組織已經(jīng)由于缺血缺氧時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)生了壞死、液化。因此，在自體顆粒脂肪移植后的轉(zhuǎn)歸過(guò)程中，如何促進(jìn)脂肪的再血管化，是提高脂肪移植后成活率的關(guān)鍵。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，有必要針對(duì)上述的問(wèn)題，提供一種脂肪組織制劑及其制備方法與應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：脂肪組織制劑，包含脂肪組織和內(nèi)皮祖細(xì)胞。優(yōu)選地，所述脂肪組織制劑由顆粒脂肪和內(nèi)皮祖細(xì)胞組分組成。優(yōu)選地，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞組分為內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液。優(yōu)選地，內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水中內(nèi)皮祖細(xì)胞的濃度為5×106-1×107個(gè)/ml。優(yōu)選地，顆粒脂肪的體積為內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液體積的10倍。優(yōu)選地，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量為5×105-1×106個(gè)內(nèi)皮祖細(xì)胞/ml顆粒脂肪。優(yōu)選地，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量為7×105-8×105個(gè)內(nèi)皮祖細(xì)胞/ml顆粒脂肪。一種脂肪組織制劑的制備方法，按10:1的體積比例將顆粒脂肪和內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液混合均勻，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液的濃度為5×106-1×107個(gè)/ml。上述脂肪組織制劑在整形或美容中作為填充制劑的應(yīng)用。所述整形或美容包括充填顏面部的凹陷畸形、隆乳、豐顳和隆鼻。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一種單一譜系的干細(xì)胞，EPCs同時(shí)具有干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞特征，可自我更新和分化。當(dāng)受到外傷、炎癥、缺血等刺激后，它可以從骨髓(或其它一些組織、器官)中動(dòng)員至外周血，歸巢至損傷的部位并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)整合入已存在的血管(血管新生)或直接產(chǎn)生新的血管(血管發(fā)生)來(lái)發(fā)揮其作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1、本發(fā)明脂肪組織制劑用做整形、美容中的填充制劑，在人體內(nèi)存活率高。通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察，移植后具有大量正常脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞清晰，僅有少量壞色、炎性反應(yīng)現(xiàn)象和纖維間隙；移植2-3個(gè)月后，脂肪組織顏色淡黃，柔軟，有光澤，僅少許纖維包裹；2、本發(fā)明脂肪組織制劑回注填充后，移植脂肪中心部位的微血管密度正常，血管再造化明顯。3、本發(fā)明脂肪組織制劑的制作方法簡(jiǎn)單，可以大量制備。附圖說(shuō)明圖1為脂肪組織的肉眼觀察結(jié)果圖片。圖2為脂肪組織的HE染色結(jié)果圖片(10×40倍)。圖3為脂肪組織的免疫組化染色結(jié)果圖片(10×40倍)。其中，圖A為對(duì)照組，圖B為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組。具體實(shí)施方式為了更好的說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式做進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明中所用試劑或儀器均可由市場(chǎng)購(gòu)得，使用的檢測(cè)方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。實(shí)施例1、脂肪組織制劑本實(shí)施例中的脂肪組織制劑由下述含量的下述組分組成：顆粒脂肪，5×106個(gè)/ml內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液，其中，顆粒脂肪的體積為內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液體積的10倍。上述脂肪組織制劑的制備方法為：將顆粒脂肪和內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液混合均勻，使每毫升顆粒脂肪0.1ml內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液，脂肪組織制劑中，每毫升顆粒脂肪含有5×105個(gè)/ml的內(nèi)皮祖細(xì)胞。本實(shí)施例中顆粒脂肪按照常規(guī)方法制備。簡(jiǎn)述如下：將皮下脂肪置于離心機(jī)中，2000rpm，離心3分鐘，用剪刀剪碎脂肪，并用孔徑300μm的細(xì)胞篩過(guò)濾，得到直徑﹤300μm的顆粒脂肪備用。本實(shí)施例中內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液通過(guò)以下方法制備：(1)臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離將臍血樣本用等量的Hank’s平衡鹽溶液稀釋?zhuān)靹蚝缶徛尤氲降攘康娜肆馨图?xì)胞分離液之上，保持分界面穩(wěn)定，避免其混合；使用離心機(jī)水平轉(zhuǎn)頭，740×g室溫離心30min。離心后可見(jiàn)原淋巴細(xì)胞分離液與血液之間的灰白色細(xì)胞層，即單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)。小心收集此層細(xì)胞置于另一新離心管中，并加入含有2％FBS的PBS液中，200×g室溫離心5min。離心后棄上清液，再次以含有2％FBS的PBS液重懸，200×g室溫離心5min。(2)內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)最后一次離心后棄上清液，加入含有10％FBS的EGM-2培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，接種于前期包被的6孔培養(yǎng)板中，置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃、5％CO2、濕度>95％。20ml臍帶血中提取的細(xì)胞可接種于3個(gè)孔中。細(xì)胞接種后24h，吸除上清液以去除未貼壁細(xì)胞及細(xì)胞碎片，以新鮮EGM-2培養(yǎng)基潤(rùn)洗細(xì)胞，吸除后更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每日換液。培養(yǎng)至7天，轉(zhuǎn)為隔日換液，記錄最初集落形成時(shí)間；培養(yǎng)至14天，40×倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)集落數(shù)量(以超過(guò)50個(gè)細(xì)胞為集落的判斷標(biāo)準(zhǔn))。至細(xì)胞生長(zhǎng)至80％以上匯合后以0.25％胰蛋白酶/EDTA消化傳代。按以上方法將細(xì)胞培養(yǎng)P2代備用(3)收集細(xì)胞去除瓶中培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次，加入2ml胰蛋白酶溶液，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，約2分鐘后，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM終止消化，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，去除上清培養(yǎng)基，使用生理鹽水調(diào)至細(xì)胞濃度5×105，得到內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液。實(shí)施例2、脂肪組織制劑本實(shí)施例中的脂肪組織制劑由下述含量的下述組分組成：顆粒脂肪，7.5×106個(gè)/ml內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液，其中，顆粒脂肪的體積為內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液體積的10倍。上述脂肪組織制劑的制備方法為：將顆粒脂肪和內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液混合均勻，使每毫升顆粒脂肪0.1ml內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液，脂肪組織制劑中，每毫升顆粒脂肪含有7.5×105個(gè)/ml的內(nèi)皮祖細(xì)胞。本實(shí)施例中顆粒脂肪和內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液的制備方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3、脂肪組織制劑本實(shí)施例中的脂肪組織制劑由下述含量的下述組分組成：顆粒脂肪，1×107個(gè)/ml內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液，其中，顆粒脂肪的體積為內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液體積的10倍。上述脂肪組織制劑的制備方法為：將顆粒脂肪和內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液混合均勻，使每毫升顆粒脂肪0.1ml內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液，脂肪組織制劑中，每毫升顆粒脂肪含有1×106個(gè)/ml的內(nèi)皮祖細(xì)胞。本實(shí)施例中顆粒脂肪和內(nèi)皮祖細(xì)胞生理鹽水溶液的制備方法與實(shí)施例1相同。為了更好的說(shuō)明本發(fā)明的效果，對(duì)本發(fā)明脂肪組織制劑進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。采用8只月齡為4-6周的健康SPF級(jí)裸鼠(廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量15～18g，雌雄不限。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作下列分組：將裸鼠隨機(jī)分為A、B兩組，每組四只，每只分別于背部皮下注射4點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.4ml脂肪組織制劑。A組為空白對(duì)照組，其脂肪組織制劑為每毫升顆粒脂肪加入0.1ml生理鹽水。B組為實(shí)驗(yàn)組，分別采用實(shí)施例2中的脂肪組織制劑。注射后、注射3個(gè)月后，麻醉裸鼠，取各點(diǎn)移植物放入10％多聚甲醛保存，進(jìn)行肉眼觀察、HE染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)。效果實(shí)施例1、肉眼觀察肉眼觀察脂肪組織體積大小、質(zhì)地、色澤、纖維包膜形成情況。結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，A組移植物質(zhì)地較硬，灰暗無(wú)光澤，可見(jiàn)明顯纖維包裹現(xiàn)象；B組較柔軟，有光澤，顏色淡黃，僅有少許纖維包裹。綜上所述，B組脂肪存活效果明顯優(yōu)于A組脂肪。效果實(shí)施例2、HE染色對(duì)3個(gè)月后的脂肪組織進(jìn)行HE染色，方法如下：將脂肪組織放入固定液中固定24小時(shí)，從固定液中取出脂肪組織，使用酒精浸泡脫水，然后將脫水后的脂肪組織放入二甲苯溶液去除酒精并透明化。將已透明的脂肪組織放入已融化的石蠟中包埋，然后立刻取出冷卻凝固成塊。石蠟塊冰凍半小時(shí)，放入切片機(jī)中切片得到石蠟切片，烘干石蠟切片后脫蠟染色，然后鏡檢。HE染色結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，A組脂肪細(xì)胞散在分布，纖維結(jié)締組織較多；B組纖維結(jié)締組織較少，并可見(jiàn)分布的血管橫斷面。綜上所述，B組脂肪存活效果明顯優(yōu)于A組。效果實(shí)施例3、免疫組化對(duì)及3個(gè)月后的脂肪組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，方法如下：將石蠟切片(制備方法同HE染色方法)置于65℃烘箱中20分鐘，PBS沖洗。滴加約50μl3％H2O2在切片上室溫靜置10分鐘，PBS沖洗。將切片置于EDTA溶液中，放入高壓鍋中加熱，待高壓鍋噴氣閥噴氣后計(jì)時(shí)3分鐘。取出切片復(fù)溫1小時(shí)，PBS沖洗。采用二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(BOSTER)，按照說(shuō)明書(shū)滴加適當(dāng)稀釋的一抗(兔IgG)，20-37℃孵育1～2小時(shí)或4℃過(guò)夜。用0.01MPBS洗2分鐘，滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(SV-0002)，37℃孵育30分鐘，PBS或TBS沖洗2分鐘。取1ml蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般5-30分鐘。蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復(fù)染、脫水，透明，封片、觀察。結(jié)果如圖3所示。圖中陽(yáng)性部位表明該處為微血管橫截面。統(tǒng)計(jì)每組20個(gè)視野下微血管的個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。表1、微血管個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表組別每個(gè)視野微血管橫截面平均數(shù)(個(gè))A組1±0.976B組4±1.523由表1可知，B組與A組差異極顯著(P<0.001)。B組每個(gè)視野微血管橫截面平均數(shù)為4個(gè)以上，A組每個(gè)視野微血管橫截面平均數(shù)為1個(gè)左右，B組脂肪組織在體內(nèi)形成的微血管數(shù)是A組的四倍，證明本發(fā)明方案有利于脂肪在體內(nèi)存活。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3