本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)軟骨組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有再生性能和理想力學(xué)強(qiáng)度的去細(xì)胞化軟骨支架及其制備方法。

背景技術(shù)：

軟骨的自身修復(fù)能力極其有限，用組織工程技術(shù)構(gòu)建工程化軟骨為修復(fù)軟骨缺損提供了一種具有良好應(yīng)用前景的方法。軟骨組織工程的研究?jī)?nèi)容包括種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞因子以及生物反應(yīng)器技術(shù)等，其中構(gòu)建理想的支架材料是成功構(gòu)建軟骨組織工程的關(guān)鍵。細(xì)胞支架為軟骨細(xì)胞的增殖分化提供適宜的場(chǎng)所，相當(dāng)于軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)成分。

目前用于軟骨組織工程的支架材料包括天然材料和人工合成材料兩種，人工合成的材料主要有聚乙交酯、聚丙交酯以及兩者的共聚物等。人工合成材料的缺點(diǎn)是疏水性，不利于細(xì)胞的粘附，并且降解產(chǎn)物呈酸性，在體內(nèi)容易引起炎癥反應(yīng)。而天然材料來(lái)源于動(dòng)物或人體，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、成分、生物力學(xué)環(huán)境適合種子細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育及新陳代謝，材料可降解，因此越來(lái)越受到研究者的重視。

目前常用的天然軟骨支架材料有膠原和透明質(zhì)烷為原料的天然軟骨的仿生支架。天然材料研制的基本原則是仿生，即模擬天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物化學(xué)成分，為軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜環(huán)境。但是軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)生化成分與結(jié)構(gòu)復(fù)雜，仿生材料難于真正模仿軟骨組織的復(fù)雜的天然結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)和生物學(xué)特性，很少進(jìn)入臨床應(yīng)用，尚無(wú)理想的支架。

脫細(xì)胞基質(zhì)由于去除了細(xì)胞和可溶性蛋白等引起免疫反應(yīng)的物質(zhì)，并且保留了原先的天然結(jié)構(gòu)，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。目前，異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)已經(jīng)商品化。國(guó)外有人用酒精脫水、凍干和液氮循環(huán)凍融等方法對(duì)兔鼻間隔軟骨進(jìn)行滅活，作為細(xì)胞生長(zhǎng)的支架，但是此種方法會(huì)使細(xì)胞殘片殘留，抗原性去除不徹底，并且滅活的大塊軟骨無(wú)多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以及代謝廢物排出困難。國(guó)內(nèi)有將軟骨整塊進(jìn)行脫細(xì)胞處理的研究報(bào)道，但形成的脫細(xì)胞軟骨不具備組織工程支架要求得多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳送以及代謝物的派出困難；另外國(guó)內(nèi)有將軟骨進(jìn)行粉碎后脫細(xì)胞的研究報(bào)道，韓雪峰等人將軟骨粉碎成100～154μm微粒，與軟骨細(xì)胞混合培養(yǎng)構(gòu)建組織工程骨，其缺點(diǎn)是微粒較大、與軟骨細(xì)胞混合不均勻，并且不具備一定具體的形狀，細(xì)胞-微粒復(fù)合體生物力學(xué)強(qiáng)度低，手術(shù)植入不易操作，移植后易出現(xiàn)變形等問(wèn)題。

絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含量約占蠶絲的70％～80％，富含18種氨基酸，具有優(yōu)良的物理特性和化學(xué)特性，可以通過(guò)不同處理得到纖維、粉末、膜、凝膠等不同性狀的材料。近年來(lái)隨著組織工程化器官和細(xì)胞支架研究的興起以及各種生物技術(shù)的發(fā)展，絲素蛋白的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，已成功應(yīng)用于手術(shù)縫合線(xiàn)等多種醫(yī)用材料中，但是絲素蛋白本身不具有促進(jìn)軟骨再生能力。此外，體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，表面涂有絲素蛋白的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞不易黏附，生長(zhǎng)緩慢。因此，盡管絲素蛋白具有較好的彈性強(qiáng)度、耐磨性能等力學(xué)特性，但缺乏促進(jìn)細(xì)胞黏附和再生能力，因此很難應(yīng)用于軟骨支架中。

理想的用于組織工程軟骨構(gòu)建的支架材料應(yīng)符合以下基本要求：①具有良好的彈性強(qiáng)度、耐磨性能等力學(xué)特性，能與組織植入部位的力學(xué)要求相匹配。②具有適合細(xì)胞粘附、增生和分化的表面化學(xué)特性，有利于細(xì)胞附著再生。③為軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供了最接近的細(xì)胞外微環(huán)境，良好的生物相容性和生物可吸收性。④制備流程簡(jiǎn)單易行，制備出的支架產(chǎn)品易長(zhǎng)期保存。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種具有再生性能和彈性強(qiáng)度的去細(xì)胞化軟骨支架，能夠復(fù)合細(xì)胞從而構(gòu)建組織工程軟骨，可用于臨床上修復(fù)軟骨缺損。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述去細(xì)胞化軟骨支架的制備方法。

通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明將良好的生物相容性和優(yōu)良力學(xué)性能的絲素蛋白作為基質(zhì)材料，結(jié)合具有良好黏附性的蝸牛黏蛋白和具有促進(jìn)組織再生能力的蟾蜍器官去細(xì)胞支架，制備形成一種符合理想支架要求的去細(xì)胞化軟骨支架。

本發(fā)明的一種具有去細(xì)胞化軟骨支架主要組分包括絲素蛋白、蝸牛黏蛋白、甾醇、蟾蜍或青蛙的軟骨去細(xì)胞支架成分，可以通過(guò)改變組分配比，控制軟骨支架的力學(xué)強(qiáng)度和降解速度，該去細(xì)胞化軟骨支架呈三維固體形狀，表面分布細(xì)密的空洞，具有促進(jìn)細(xì)胞再生和黏附的性能。

上述的去細(xì)胞化軟骨支架中絲素蛋白的質(zhì)量百分含量為30％-60％、蟾蜍或青蛙的軟骨去細(xì)胞支架成分的質(zhì)量百分含量為20％-60％、蝸牛黏蛋白的質(zhì)量百分含量為1％-15％、甾醇的質(zhì)量百分含量為0.5％-5％。

上述的甾醇包括膽甾醇、谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇。

上述的去細(xì)胞化軟骨支架中可進(jìn)一步加入活性因子、抗生素、pH緩沖液、穩(wěn)定劑中的一種或一種以上的混合物。

上述的穩(wěn)定劑包括聚乙二醇、聚維酮、明膠、膠原、右旋糖酐、丙三醇、海藻糖、1，2，4-丁三醇、赤蘚糖醇、蘇阿糖醇、季戊四醇、環(huán)戊五醇、木糖醇、來(lái)蘇糖醇、阿拉伯糖醇、環(huán)己六醇、山梨醇、阿洛糖醇、阿卓糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、艾杜糖醇、半乳糖醇、太羅糖醇及果糖醇中的一種，或它們的任意組合。

上述的活性因子包括硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、促進(jìn)組織生長(zhǎng)的生物活性因子一種或幾種。

一種上述去細(xì)胞化軟骨支架的制備方法：將所述的絲素蛋白、蝸牛黏蛋白、甾醇、蟾蜍或青蛙的軟骨去細(xì)胞支架成分加入到含有抗生素、pH緩沖液、穩(wěn)定劑的水溶液中，攪拌形成均勻溶液，灌注于金屬模具中，液氮速凍成型，冷凍干燥除去水分，形成三維固體支架，γ-射線(xiàn)輻照滅菌。

上述的去細(xì)胞化軟骨支架表面成親水性，分布細(xì)密的孔洞，有利于軟骨細(xì)胞的黏附。

上述的去細(xì)胞化軟骨支架用于軟骨組織的替換移植物。

本發(fā)明的去細(xì)胞化生物支架具備以下優(yōu)點(diǎn)：①應(yīng)用蟾蜍或青蛙的軟骨去細(xì)胞支架成分，不僅來(lái)源廣泛，而且生物相容性好，并有促進(jìn)軟骨組織再生的能力。②應(yīng)用絲素蛋白，去除因絲膠蛋白引起的免疫反應(yīng)，保持去細(xì)胞化軟骨組織支架具有良好的彈性強(qiáng)度、耐磨性能等力學(xué)特性，能與組織植入部位的力學(xué)要求相匹配。③蝸牛黏蛋白、甾醇和蟾蜍或青蛙的軟骨去細(xì)胞支架成分合用，為軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供了最接近的細(xì)胞外微環(huán)境，具有促進(jìn)細(xì)胞粘附、增生和分化的特性，有利于軟骨細(xì)胞附著再生。④去細(xì)胞化軟骨組織支架具有良好的生物相容性和生物可吸收性。⑤制備流程簡(jiǎn)單易行，制備出的三維去細(xì)胞化生物支架無(wú)菌，容易長(zhǎng)期保存；表面成親水性，分布細(xì)密的孔洞，有利于軟骨細(xì)胞的黏附。⑥制備過(guò)程不經(jīng)加熱，不使用任何化學(xué)或酶交聯(lián)劑，不會(huì)產(chǎn)生因交聯(lián)劑殘留導(dǎo)致的毒副反應(yīng)，也保存了各組分的活性。

具體實(shí)施方式

下文將詳細(xì)描述本發(fā)明具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。

實(shí)施例1具有再生性能和彈性強(qiáng)度的去細(xì)胞化軟骨支架的制備

按照表1的去細(xì)胞化軟骨支架各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的組成，秤取各組分，將抗生素、pH緩沖液、穩(wěn)定劑等附加組分溶解配成水溶液，加入絲素蛋白、蝸牛黏蛋白、甾醇、蟾蜍或青蛙的軟骨去細(xì)胞支架成分，攪拌均勻，灌注于金屬模具中，浸入液氮中速凍成型，脫模，將成型的去細(xì)胞支架冷凍干燥處理，除去水分，形成三維固體支架，γ-射線(xiàn)輻照滅菌，封裝于無(wú)菌容器中保存。

表1 去細(xì)胞化軟骨支架各實(shí)驗(yàn)組的組成

注：“/”代表此項(xiàng)組分為0；“軟骨去細(xì)胞支架成分”項(xiàng)下數(shù)字后的括號(hào)內(nèi)的動(dòng)物是指軟骨去細(xì)胞支架成分的來(lái)源動(dòng)物。

實(shí)施例2具有再生性能和彈性強(qiáng)度的去細(xì)胞化軟骨支架的性能檢測(cè)和應(yīng)用效果

(1)去細(xì)胞化軟骨支架的性能檢測(cè)

表面孔徑觀察：光鏡和掃描電鏡觀察下各組的去細(xì)胞化軟骨支架表面的孔隙率和孔徑大小，是否均勻一致。

吸水性測(cè)定：稱(chēng)量去細(xì)胞化軟骨支架質(zhì)量Wo值，然后置于盛有去離子水的稱(chēng)量瓶中，充分溶脹，用濾紙吸干表面水分，稱(chēng)質(zhì)量得Wn值。樣品吸水率根據(jù)下列公式計(jì)算：吸水率(％)＝[(Wn-Wo)/Wo]×100

硬度測(cè)定：利用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，測(cè)定去細(xì)胞化軟骨支架的壓縮模量和拉伸模量。

(2)支架的生物相容性

采用MTT法檢測(cè)去細(xì)胞化軟骨支架浸提液對(duì)體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞的毒性；采用裸鼠實(shí)驗(yàn)，將去細(xì)胞化軟骨支架植入到裸鼠背部皮袋，4周后取組織觀察結(jié)果，判斷支架的體內(nèi)相容性。

(3)對(duì)缺損的兔膝關(guān)節(jié)軟骨的移植修復(fù)效果

將去細(xì)胞化軟骨支架植入修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，6個(gè)月后觀察兔膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)行為，取修復(fù)部位的軟骨組織進(jìn)行組織學(xué)觀察，綜合評(píng)價(jià)各組的去細(xì)胞化軟骨支架對(duì)于缺損的兔膝關(guān)節(jié)軟骨的移植修復(fù)后的應(yīng)用效果。本項(xiàng)指標(biāo)作為軟骨組織的替換移植物的最關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：以上各組的去細(xì)胞化軟骨支架實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2數(shù)據(jù)可見(jiàn)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組在孔隙率、孔徑大小、吸水性、壓縮模量和拉伸模量等性能指標(biāo)上相差不明顯，各項(xiàng)性能指標(biāo)優(yōu)異，且體內(nèi)外相容性良好，兔膝關(guān)節(jié)的活動(dòng)行為和組織學(xué)評(píng)價(jià)等指標(biāo)良好，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)組對(duì)于缺損的兔膝關(guān)節(jié)軟骨具有良好移植修復(fù)效果。

對(duì)照組1的孔隙率、孔徑大小、吸水性、壓縮模量和拉伸模量等性能指標(biāo)很差，對(duì)于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損無(wú)修復(fù)效果，移植后關(guān)節(jié)出現(xiàn)變形。

對(duì)照組3選用同為嚙齒類(lèi)動(dòng)物小鼠的軟骨去細(xì)胞支架成分，但是對(duì)于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)效果不如實(shí)驗(yàn)組，且再生的軟骨細(xì)胞形態(tài)差。

對(duì)照組2、4和5在孔隙率、孔徑大小、吸水性、壓縮模量和拉伸模量等性能指標(biāo)上與實(shí)驗(yàn)組相近，也具有良好的體內(nèi)外相容性，但在兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)中修復(fù)效果較差，并伴有再生的細(xì)胞形態(tài)差、骨質(zhì)疏松、軟骨細(xì)胞附著少等問(wèn)題。

由上可知，實(shí)驗(yàn)組對(duì)于對(duì)缺損的兔膝關(guān)節(jié)軟骨的移植修復(fù)效果良好，可以作為軟骨組織的替換移植物。而缺失本發(fā)明的去細(xì)胞化軟骨支架主要成分的對(duì)照組不能作為關(guān)節(jié)軟骨缺損的移植替代物應(yīng)用，即使替換同為嚙齒類(lèi)動(dòng)物小鼠的軟骨去細(xì)胞支架成分代替本發(fā)明的蟾蜍或青蛙的軟骨去細(xì)胞支架成分，也不能取得良好的軟骨修復(fù)效果。

表2 去細(xì)胞化軟骨支架各實(shí)驗(yàn)組的性能結(jié)果和應(yīng)用效果

上述詳細(xì)說(shuō)明是針對(duì)發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)當(dāng)包含于本發(fā)明的專(zhuān)利范圍內(nèi)。

另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可在本發(fā)明權(quán)利要求公開(kāi)的范圍和精神內(nèi)做其它形式和細(xì)節(jié)上的各種修改、添加和替換。當(dāng)然，這些依據(jù)本發(fā)明精神所做的各種修改、添加和替換等變化，都應(yīng)包含在本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。