本發(fā)明屬于納米材料制備和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，一種基于DNA材料的磁性納米治療診斷試劑及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磁性氧化鐵納米顆粒的作為藥物輸送載體已經(jīng)得到了廣泛的研究(Acc. Chem. Res. 2011 ,44 , 883 ), 這將磁性氧化鐵納米顆粒作為MRI成像探針直接升級(jí)為集診斷和治療元素為一體的治療診斷試劑（Theranostics 2012,2 , 86）。通常，磁性氧化鐵納米顆粒會(huì)與治療試劑一起被載入基于聚合物的基質(zhì)中，并且研制出各種各樣的用于診斷治療用途的磁性氧化鐵納米顆粒(Biomaterials, 2011, 32 , 9364)。比如，Nasongkla et al .研發(fā)出一種基于磁性氧化鐵納米顆粒治療診斷試劑，被命名為SPIO-doxorubicin (Dox)-cRGD 微粒，該微?？赏瑫r(shí)進(jìn)行惡性腫瘤成像和可示蹤藥物輸送（Nano Lett, 2006 , 6 , 2427）。
由于具有較高水平的結(jié)構(gòu)可編程性、顯著的生物相容性以及容易修飾官能團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)，DNA被認(rèn)為是良好的藥物載體材料，特別是在抗腫瘤藥物輸送方面（Small , 2013，9 (18), 3082?3087）。很多研究者發(fā)現(xiàn)DNA在沒有轉(zhuǎn)染試劑的情況下就能很好地穿過哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜（Chem. Commun，2013，49 (20), 2010?2012）。除此之外，DNA分子操控技術(shù)日趨成熟，通過設(shè)計(jì)特定的堿基序列，可以構(gòu)建出多向性的DNA三維結(jié)構(gòu)，如帶狀結(jié)構(gòu)、管狀結(jié)構(gòu)、2/3D晶體結(jié)構(gòu)等等。該分子操控技術(shù)為DNA很好的應(yīng)用在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)。例如，Dongming Huang課題組利用六點(diǎn)星狀的tiles組裝DNA二十面體，連接配體后可作為阿霉素的載體，用于癌癥的治療(ACS Nano, 2011, 5(8): 6156-63)。
為了提高成像的靈敏度和磁靶向性，增強(qiáng)氧化鐵納米顆粒磁的性質(zhì)成為關(guān)鍵。其中一種增大磁飽和值的方式就是摻雜二價(jià)金屬元素，常用來摻雜的金屬離子像Zn, Co, Ni, Cu和 Mn等。根據(jù)我們以前的研究表明，二巰基丁二酸（DMSA）包裹的Zn2+摻雜的Fe3O4納米顆粒（DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs）具有較高的磁飽和值和生物相容性。并且通過其表面修飾腫瘤靶向肽環(huán)狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（cRGD），最終可以得到了一種腫瘤靶向性的納米復(fù)合磁性材料。此外，DNA四面體可以作為良好的藥物輸送載體。因?yàn)樵诒姸嗟腄NA三維結(jié)構(gòu)中， DNA四面體（TND）具有最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，且DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基對(duì)之間能夠嵌入一些藥物分子，比如說是平面存在芳香環(huán)的阿霉素。因此，制備以DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs為基質(zhì)，增加RGD為靶向抗體且連接有DNA四面體藥物載體的新型治療診斷系統(tǒng)，具有較高的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于DNA材料的磁性納米治療診斷試劑及其制備和應(yīng)用。該方法控制反應(yīng)條件制備具有高磁飽和值的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs，并以此納米顆粒為基質(zhì)，同時(shí)連接靶向分子c(RGD)以及藥物載體DNA四面體，從而得到具有磁共振成像診斷和藥物治療的試劑。該治療診斷具有性能穩(wěn)定、生物相容性好、磁共振信號(hào)均較強(qiáng)以及靶向給藥的特點(diǎn)。所得的產(chǎn)物能滿足臨床應(yīng)用的需求。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種基于DNA材料的磁性納米治療診斷試劑的制備方法，其特征在于：
（1）DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的制備
首先把FeSO4?(NH4)2SO4?6H2O 和ZnSO4溶解在20ml的水里，使得前體達(dá)到1.73×10-3mol Fe2+ and 2.67×10-4 mol Zn2+ 的目的，其次，把10ml油酸、10ml無水乙醇和1g NaOH混合，在常溫下磁力攪拌直到得到均勻的溶液，再者，把前體Fe2+和Zn2+的混合溶液倒進(jìn)該均勻溶液中，攪拌幾分鐘以后，混合溶液變成深棕色，最后把該溶液轉(zhuǎn)移進(jìn)50ml反應(yīng)釜中，密封，230度加熱15個(gè)小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束以后，冷卻至室溫，產(chǎn)品沉積在釜底，納米顆粒分散在環(huán)己烷取出，再把乙醇加入分散有納米顆粒的環(huán)己烷中，沉淀出納米顆粒，最后納米顆粒再用乙醇反復(fù)洗數(shù)次，顆粒表面的油酸用DMSA進(jìn)行兩次交換，使得納米顆粒徹底分散在水相中；
（2）DNA四面體的制備
DNA四面體（TDN）是由TDN-1，TDN-2，TDN-3，氨基修飾的TDN-4，修飾在5’端記為NH3-TDN-4，四條單鏈組裝而成的，取上述50 μM 的DNA單鏈TDN-1，TDN-2，TDN-3，NH3-TDN-4各2μL加入到42μL Tris-MgCl2緩沖液中， 10 mM Tris 和50 mM MgCl2 ，pH 8；將上述樣品溶液置于PCR儀中在95℃保溫10分鐘后快速冷卻至4℃，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)自組裝成即可得到濃度為2μM 的NH3-DNA四面體；
（3）治療診斷試劑TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制備
取EDC和NHS溶解在PBS緩沖液中，緩沖液PH=7.4， 0.05M，并用0.2M的鹽酸調(diào)解PH，把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超聲10分鐘，室溫下反應(yīng)，以活化羧基，將混合物用PBS 緩沖液磁分離洗滌3 次以除去多余的EDC和NHS，緩沖液PH=7.4， 0.01M，將活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS緩沖液中，把c(RGD)和NH3-DNA四面體溶解在PBS緩沖液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室溫反應(yīng)，混合物用PBS 緩沖液磁分離洗滌3 次以除去多余的游離抗體和NH3-DNA四面體，緩沖液PH=7.4， 0.01M，最后重懸于PBS中，PBS0.01M，pH 7.4，4℃保存。
所述的治療診斷試劑的磁共振成像診斷部分是Zn0.4Fe2.6O4 NPs。
所述的治療診斷試劑的藥物治療載體部分是DNA四面體。
所述的治療診斷試劑的靶向分子是氨基修飾的c(RGD)。
所述的DNA四面體是氨基修飾的。
所述的DNA四面體和c(RGD)的分子個(gè)數(shù)之比為0.1-10。
所述的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs與DNA四面體和c(RGD)的分子個(gè)數(shù)之比為1:10:10。
一種基于DNA材料的磁性納米治療診斷試劑，其特征在于，根據(jù)上述任一所述方法制備得到。
一種基于DNA材料的磁性納米治療診斷試劑的應(yīng)用。
DNA四面體（TDN）是由TDN-1，TDN-2，TDN-3，氨基修飾的TDN-4，修飾在5’端記為NH3-TDN-4，四條單鏈組裝而成的，其序列為tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55，tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55，ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55，acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
本發(fā)明以高磁飽和值的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs為基質(zhì)，通過偶聯(lián)的方法將靶向分子c(RGD)和DNA四面體連接到其表面，即可得到具有靶向性的治療診斷試劑。所用原料生物安全性高。本發(fā)明制備的診斷治療試劑具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性、靶向性磁共振成像和藥物輸送的性能。本發(fā)明所用的藥物輸送載體DNA四面體具有良好的細(xì)胞穿透性和生物相容性。本發(fā)明中的制備方法工藝簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，能進(jìn)一步滿足生產(chǎn)和應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
以下通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
1．DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的制備
首先把FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O 和ZnSO4溶解在20ml的水里，使得前體達(dá)到1.73×10-3mol Fe2+ and 2.67×10-4 mol Zn2+ 的目的。其次，把10ml油酸、10ml無水乙醇和1g NaOH混合，在常溫下磁力攪拌直到得到均勻的溶液。再者，把前體Fe2+和Zn2+的混合溶液倒進(jìn)該均勻溶液中，攪拌幾分鐘以后，混合溶液變成深棕色。最后把該溶液轉(zhuǎn)移進(jìn)50ml反應(yīng)釜中，密封，230度加熱15個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束以后，冷卻至室溫。產(chǎn)品沉積在釜底，納米顆粒分散在環(huán)己烷取出。再把乙醇加入分散有納米顆粒的環(huán)己烷中，沉淀出納米顆粒，最后納米顆粒再用乙醇反復(fù)洗數(shù)次。顆粒表面的油酸用DMSA進(jìn)行兩次交換，使得納米顆粒徹底分散在水相中。
2. DNA四面體的制備
DNA四面體（TDN）是由TDN-1，TDN-2，TDN-3，NH3-TDN-4四條單鏈組裝而成的。取上述50 μM 的DNA單鏈TDN-1，TDN-2，TDN-3，NH3-TDN-4各2μL加入到42μL Tris-MgCl2緩沖液中（10 mM Tris 和50 mM MgCl2 ，pH 8）。將上述樣品溶液置于PCR儀中在95℃保溫10分鐘后快速冷卻至4℃，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)自組裝成即可得到濃度為2μM 的NH3-DNA四面體。
3. 治療診斷試劑TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制備
取EDC和NHS溶解在PBS緩沖液中（PH=7.4，0.05M）中，并用0.2M的鹽酸調(diào)解PH。把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超聲10分鐘，室溫下反應(yīng)，以活化羧基。將混合物用PBS 緩沖液（PH=7.4， 0.01M）磁分離洗滌3 次以除去多余的EDC和NHS，將活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS緩沖液中。把c(RGD)和NH3-DNA四面體（分子個(gè)數(shù)之比1:1）溶解在PBS緩沖液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室溫反應(yīng)。混合物用PBS 緩沖液（PH=7.4，0.01M）磁分離洗滌3 次以除去多余的游離抗體和NH3-DNA四面體，最后重懸于PBS(0.01M，pH 7.4) 中，4℃保存。
經(jīng)表征DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的水和動(dòng)力學(xué)半徑為22nm，Zeta電勢(shì)為-30mV；TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs水和動(dòng)力學(xué)半徑為35nm，Zeta電勢(shì)為-5mV。
實(shí)施例2
步驟1、2同實(shí)施例1。
3. 治療診斷試劑TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制備
取EDC和NHS溶解在PBS緩沖液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的鹽酸調(diào)解PH。把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超聲10分鐘，室溫下反應(yīng)，以活化羧基。將混合物用PBS 緩沖液（PH=7.4， 0.01M）磁分離洗滌3 次以除去多余的EDC和NHS，將活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS緩沖液中。把c(RGD)和NH3-DNA四面體（分子個(gè)數(shù)之比2:1）溶解在PBS緩沖液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室溫反應(yīng)?；旌衔镉肞BS 緩沖液（PH=7.4， 0.01M）磁分離洗滌3 次以除去多余的游離抗體和NH3-DNA四面體，最后重懸于PBS(0.01M，pH 7.4) 中，4℃保存。
經(jīng)表征DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的水和動(dòng)力學(xué)半徑為22nm，Zeta電勢(shì)為-30mV；TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs水和動(dòng)力學(xué)半徑為33nm，Zeta電勢(shì)為-11mV。
實(shí)施例3
步驟1、2同實(shí)施例1。
3. 治療診斷試劑TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制備
取EDC和NHS溶解在PBS緩沖液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的鹽酸調(diào)解PH。把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超聲10分鐘，室溫下反應(yīng)，以活化羧基。將混合物用PBS 緩沖液（PH=7.4， 0.01M）磁分離洗滌3 次以除去多余的EDC和NHS，將活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS緩沖液中。把c(RGD)和NH3-DNA四面體（分子個(gè)數(shù)之比1:2）溶解在PBS緩沖液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室溫反應(yīng)?；旌衔镉肞BS 緩沖液（PH=7.4， 0.01M）磁分離洗滌3 次以除去多余的游離抗體和NH3-DNA四面體，最后重懸于PBS(0.01M，pH 7.4) 中，4℃保存。
經(jīng)表征DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的水和動(dòng)力學(xué)半徑為22nm，Zeta電勢(shì)為-30mV；TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs水和動(dòng)力學(xué)半徑為41nm，Zeta電勢(shì)為5mV。
實(shí)施例4
步驟1、2同實(shí)施例1。
3. 治療診斷試劑TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs的制備
取EDC和NHS溶解在PBS緩沖液中（PH=7.4， 0.05M）中，并用0.2M的鹽酸調(diào)解PH。把上述溶解加入到DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs中，并超聲10分鐘，室溫下反應(yīng)，以活化羧基。將混合物用PBS 緩沖液（PH=7.4， 0.01M）磁分離洗滌3 次以除去多余的EDC和NHS，將活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs重新分散在PBS緩沖液中。把c(RGD)和NH3-DNA四面體（分子個(gè)數(shù)之比3:1）溶解在PBS緩沖液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs溶液中，室溫反應(yīng)?；旌衔镉肞BS 緩沖液（PH=7.4， 0.01M）磁分離洗滌3 次以除去多余的游離抗體和NH3-DNA四面體，最后重懸于PBS(0.01M，pH 7.4) 中，4℃保存。
經(jīng)表征DMSA-Zn0.4Fe2.6O4 NPs的水和動(dòng)力學(xué)半徑為22nm，Zeta電勢(shì)為-30mV
TDN-Zn0.4Fe2.6O4-RGD NPs水和動(dòng)力學(xué)半徑為39nm，Zeta電勢(shì)為-14mV。
<110> 上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司
<120> 一種基于DNA材料的新型磁性納米藥物載體及其制備方法
<160>4
<210>1
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tatcaccagg cagttgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210>2
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210>3
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
<210>4
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55