本發(fā)明涉及一種銀杏葉組合物，具體涉及一種舒血寧注射液及其制備方法。
背景技術(shù)：
：舒血寧注射液為銀杏葉經(jīng)提取制成的滅菌水溶液。銀杏葉是銀杏科植物銀杏的干燥葉，其為傳統(tǒng)的活血化瘀中藥材，銀杏葉提取物是經(jīng)現(xiàn)代提取工藝從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)的富集產(chǎn)品?？捎糜诏煼翁摽却⒐谛牟?、高血脂、抑郁癥、糖尿病、神經(jīng)疾病、記憶障礙、外周血管疾病、間歇性跛行、腦轉(zhuǎn)耳鳴等疾病的治療。其主要活性成分為黃酮類和萜類。黃酮類成分包括單黃酮、黃酮醇苷、乙?；S酮醇苷、雙黃酮、黃烷-3-醇類以及原花色素等。萜類銀杏內(nèi)酯有銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M及白果內(nèi)酯。舒血寧注射液是銀杏葉經(jīng)提取制成的滅菌水溶液。主要的化學(xué)成分包括總銀杏酸、內(nèi)酯和黃酮等化合物。內(nèi)酯和黃酮是有效活性成分，總銀杏酸為有毒成分。目前，銀杏葉提取物標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版一部。商務(wù)部中國醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會正式對外發(fā)布的《銀杏葉提取物國際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)》指出，國內(nèi)外大量文獻(xiàn)報道顯示，總銀杏酸具有細(xì)胞毒性、胚胎毒性、致敏性及致突變作用，被廣泛認(rèn)為是銀杏葉提取物及其制劑中的毒性物質(zhì)，WHO及多國藥典(包括現(xiàn)行版EP和USP)要求銀杏葉提取物中總銀杏酸的含量不得大于5mg/kg，現(xiàn)行《中國藥典》2015年版要求銀杏葉提取物中含總銀杏酸不得過10mg/kg，舒血寧注射液國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中對總銀杏酸的限量已與國際接軌?？刂瓶傘y杏酸的含量即可降低不良反應(yīng)的發(fā)生，提高產(chǎn)品安生性?？傘y杏酸是公認(rèn)的致敏物質(zhì)，總銀杏酸的去除，可使舒血寧注射液產(chǎn)品質(zhì)量上升一個新臺階。目前，關(guān)于銀杏葉提取物的文獻(xiàn)很多。中國專利申請201610053191.7公開了一種由銀杏葉提取物形成的中藥組合物，以占所述中藥組合物的質(zhì)量百分比計，包括，24-40％的銀杏總黃酮，6-16％的銀杏內(nèi)酯，銀杏酸小于5ppm。優(yōu)選地還包括，1-1.68％的槲皮素-3-O-葡萄糖苷，2.11-3.53％的槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷。進(jìn)一步優(yōu)選地還包括，1.4-3％的銀杏內(nèi)酯A，0.9-1.8％的銀杏內(nèi)酯B和1.2-1.3％的銀杏內(nèi)酯C。本申請的中藥組合物明確了兩種對其藥物具有重要影響的槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷，并進(jìn)一步的將其含量精確限定為1-1.68％和2.11-3.53％，進(jìn)一步的，清楚的界定其銀杏內(nèi)酯A1.4-3％，銀杏內(nèi)酯B0.9-1.8％和銀杏內(nèi)酯C1.2-1.3％。該申請采用乙醇－水溶液進(jìn)行提取，有效成分提取率低。中國專利申請CN200910154390.7公開了一種銀杏提取物的生產(chǎn)工藝，將銀杏葉原料加入8倍50-70％的乙醇對銀杏葉分3次進(jìn)行浸提，浸提溫度70度，然后收集提取液，真空蒸發(fā)，回收乙醇，離心后收集上清液；將經(jīng)過離心處理的提取液過徑高比為1∶10的大孔樹脂層析柱，用5-15％的乙醇分批淋洗至洗出液澄明，然后用70％的乙醇解吸，解吸完畢后，收集解吸液，將上述解吸液再過徑高比為1∶30的大孔樹脂層析柱，收集解吸液，減壓回收乙醇，濃縮成稠膏后，真空干燥即得銀杏提取物。該方法乙醇對銀杏葉分3次進(jìn)行浸提，但無純化步驟，雜質(zhì)多，樹脂柱徑高比偏高，不適規(guī)?；笊a(chǎn)。中國專利申請200910217956.6體公開了一種擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)藥物舒血寧注射液的制備方法。其將銀杏葉粉碎后，經(jīng)乙醇浸泡、濃縮過濾、乙醇冷藏、樹脂吸附、乙醇洗脫等技術(shù)處理，得到銀杏提取液。其僅采用浸泡乙醇提取，提取方法較為簡單，提取率偏低。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種舒血寧注射液。本發(fā)明還提供了一種舒血寧注射液的制備方法。本發(fā)明提供一種舒血寧注射液，該注射液由銀杏葉提取物制成，所述銀杏葉提取物中總黃酮醇苷25-40％，銀杏內(nèi)酯6.5-16％，白果內(nèi)酯3-5％，銀杏酸小于5ppm。所述銀杏葉提取物中總黃酮醇苷29-40％，銀杏內(nèi)酯7-16％，白果內(nèi)酯3-5％，銀杏酸小于1ppm。所述總黃酮醇苷的苷元是由組合物槲皮素、山奈素和異鼠李素組成，其重量比為1.0-1.25:1:0.4-0.75。所述注射液中銀杏內(nèi)酯A不低于0.07mg/ml，銀杏內(nèi)酯B不低于0.03mg/ml，銀杏內(nèi)酯C不低于0.04mg/ml。所述銀杏葉提取物的制備方法，包括以下步驟：(1)取銀杏葉超微粉碎，用4-6倍的50-60％的乙醇，50-60℃下浸泡0.5-2h，回流提取0.5-2h，收集提取液，濾渣用3-5倍的50-60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷組成的混合溶劑回流提取0.5-1.5h，收集提取液；(2)合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.5-8.0，靜置12-24h，過濾，加水定容至銀杏葉量的5-6倍體積；(3)加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.5-5.0，4500-5000r/min離心；(4)離心液以1.6-1.8BV/h過大孔吸附樹脂柱；用1-1.5BV的純化水、1.5-2BV的15％乙醇以3.0-4.0BV/h的流速沖洗樹脂，用5-6BV的80％乙醇加入樹脂柱內(nèi)浸泡0.5-1h，以1.3-1.5BV/h的流速洗脫，收集洗脫液；(5)洗脫液經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，濃縮液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯組成的萃取劑萃取，萃取次數(shù)為2-3次；濃縮至4g/ml；(6)加入無水乙醇，使醇含量為85-88％，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.3-7.8，冷卻靜置24-36h，上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜精濾，濃縮，干燥，得銀杏葉提取物。所述銀杏葉于60-65℃烘3-5h。所述混合溶劑中50-60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的體積比為5-8：1：2。所述樹脂為HPD450和S-8，二者的質(zhì)量比為2-3：1。所述萃取劑中正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的體積比為4-5：1：4-5。所述舒血寧注射液的制備方法，包括以下步驟：(1)取所述銀杏葉提取物，經(jīng)0.22μm濾膜過濾至配劑罐中，加注射用水稀釋；(2)調(diào)節(jié)pH至3.5-4.0，加熱至80-85℃，加入藥用炭，攪拌均勻，煮沸5-8min，(3)冷卻至50℃以下，調(diào)節(jié)pH4.7-5.0，定容，攪拌均勻(4)取樣檢測，符合規(guī)定后經(jīng)0.3μm濾膜過濾，藥液降溫至30℃以下經(jīng)0.22μm濾器精濾，取樣檢測，合格后，灌裝，充氮氣，經(jīng)115℃滅菌30min，送檢，包裝。本發(fā)明舒血寧注射液的使用方法為：肌肉注射，一次10ml，一日1～2次；靜脈滴注，每日20ml，用5％葡萄糖注射液或0.9％生理鹽水注射液稀釋250ml或500ml后使用，或遵醫(yī)囑。乙醇濃度對于銀杏葉提取物的質(zhì)量影響較大，銀杏葉提取物的制備過程中，醇濃度越高，雜質(zhì)去除的越多，有效成分損失也越大。因此，本發(fā)明所選取乙醇的濃度有利于提取物中雜質(zhì)的去除及降低有效成分的損失。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的銀杏提取物的提取方法采用兩種樹脂吸附，有效去除了有害成分總銀杏酸，降低了類過敏反應(yīng)的發(fā)生；同時，采用兩次提取方法，并采用乙醇、丙三醇和二氯甲烷組成的混合溶劑提取，還采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯組成的萃取劑多次萃取，目標(biāo)成分含量高，純度好，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。本發(fā)明制得的舒血寧注射液，成分比例明確，穩(wěn)定性好，雜質(zhì)少，溶解度好，療效穩(wěn)定。具體實施方式實施例1：銀杏葉組合物一、提取方法(1)取銀杏葉于65℃烘4h，超微粉碎，用5倍的55％的乙醇，50-60℃下浸泡1.5h，回流提取1h，收集提取液，濾渣用4倍的55％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷組成的混合溶劑回流提取1h，收集提取液；其中，50-60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的體積比為6：1：2。(2)合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.6，靜置18h，過濾，加水定容至銀杏葉量的5倍體積；(3)加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.8，4750r/min離心；(4)離心液以1.7BV/h過大孔吸附樹脂柱；用1.2BV的純化水、1.8BV的15％乙醇以3.5BV/h的流速沖洗樹脂，用5.5BV的80％乙醇加入樹脂柱內(nèi)浸泡1h，以1.4BV/h的流速洗脫，收集洗脫液；其中，樹脂柱中的樹脂為HPD450和S-8的混合物，二者的質(zhì)量比為3：1；(5)洗脫液經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，濃縮液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯組成的萃取劑萃取，萃取次數(shù)為3次；濃縮至4g/ml；其中，正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的體積比為5：1：4。(6)加入無水乙醇，使醇含量為86％，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.6，冷卻靜置30h，上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜精濾，濃縮，干燥，得銀杏葉提取物。二、含量檢測1、總黃酮醇苷照高效液相色譜法(《中國藥典》2015年版四部附錄0512)測定。1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)為流動相；檢測波長為360nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計算應(yīng)不低于2500；2)對照品溶液的制備：分別取槲皮素對照品、山奈素對照品、異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml分別含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作為對照品溶液；3)供試品溶液的制備：取本品約35mg，精密稱定，加甲醇-25％鹽酸溶液(4∶1)的混合溶液25ml，置水浴中加熱回流30分鐘，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。4)測定法：分別精密吸取對照品溶液(或?qū)φ仗崛∥锶芤?與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，分別計算槲皮素、山奈素與異鼠李素的含量，按下式換算成總黃酮醇苷的含量：總黃酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量)×2.51。2、萜類內(nèi)酯照高效液相色譜法(《中國藥典》2015年版四部附錄0512))測定。1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以正丁醇-四氫呋喃-水(1∶15∶84)為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論板數(shù)按白果內(nèi)酯峰計算應(yīng)不低于2500。2)對照品溶液的制備：分別取白果內(nèi)酯對照品、銀杏內(nèi)酯A對照品、銀杏內(nèi)酯B對照品和銀杏內(nèi)酯C對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml各含2mg、1mg、1mg、1mg的混合溶液，作為對照品溶液。3)供試品溶液的制備：取本品約0.15g，精密稱定，加水10ml，至水浴中溫?zé)崾谷苌?，?％鹽酸溶液2滴，用乙酸乙酯振搖提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％醋酸鈉溶液20ml洗滌，分取醋酸鈉液，再用乙酸乙酯10ml洗滌。合并乙酸乙酯提取液及洗滌液，用水洗滌2次，每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗滌，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。4)測定法：分別精密吸取對照品溶液5μl、10μl，供試品溶液5～10μl，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程分別計算白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C的含量，即得。3、總銀杏酸照高效液相色譜法(《中國藥典》2015年版四部附錄0512))測定。1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-1％冰醋酸溶液(90∶10)為流動相；檢測波長為310nm。理論板數(shù)按白果新酸峰計算應(yīng)不低于4000。2)對照品溶液的制備：取白果新酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作為對照品溶液。另取總銀杏酸對照品適量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作為定位用對照溶液。3)供試品溶液的制備：取本品粉末約10g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚(60-90℃)50ml，密塞，稱定重量，回流提取2小時，放冷，再稱定重量，用石油醚(60-90℃)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25ml，減壓回收溶劑至干，精密加入甲醇2ml，密塞，搖勻，即得。4)測定法：精密吸取供試品溶液、對照品溶液及定位用對照溶液各10μl，注入液相色譜儀，計算供試品溶液中與總銀杏酸對照品相應(yīng)色譜峰的總峰面積，以白果新酸對照品外標(biāo)法計算總銀杏酸含量，即得。4、雜質(zhì)成分檢測4.1熾灼殘渣：取本品1.0g置已熾灼至恒重的坩堝中，精密稱定，緩緩熾灼至完全炭化，放冷至室溫；加硫酸1ml使?jié)駶?，低溫加熱至硫酸蒸氣除盡后，在500-600℃熾灼使完全炭化，移至干燥器內(nèi)，放冷至室溫，精密稱定后，再在500-600℃熾灼至恒重，稱重。該重量與取樣量的比值為熾灼殘渣值。4.2重金屬及有害元素(電感耦合等離子體質(zhì)譜法)1)標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的制備：分別精密量取鉛、砷、鎘、汞、銅單元素標(biāo)準(zhǔn)液適量，用10％硝酸溶液稀釋制成每1ml分別含鉛、砷、鎘、汞、銅為1μg、0.5μg、1μg、1μg、10μg的溶液，即得。2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密量取鉛、砷、鎘、銅標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，用10％硝酸溶液稀釋制成每1ml含鉛、砷0ng、1ng、5ng、10ng、20ng，含鎘0ng、0.5ng、2.5ng、5ng、10ng，含銅0ng、50ng、100ng、200ng、500ng的系列濃度混合溶液。另精密量取汞標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，用10％硝酸溶液稀釋制成每1ml分別含汞0ng、0.2ng、0.5ng、1ng、2ng、5ng的溶液，本液應(yīng)臨用配制。3)內(nèi)標(biāo)溶液的制備：精密量取鍺、銦、鉍單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水稀釋制成每1ml各含1μg的混合溶液，即得。4)供試品溶液的制備取供試品于60℃干燥2小時，粉碎成粗粉，取約0.5g，精密稱定，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5-10ml。密閉并按各微波消解儀的相應(yīng)要求及一定的消解程序進(jìn)行消解。消解完全后，消解液冷卻至60℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50ml量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1μg/ml)，200μl，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。除不加金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，余同法制備試劑空白溶液。5)測定法：以測量值(3次讀數(shù)的平均值)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將儀器的樣品管插入供試品溶液中，測定，讀取3次讀數(shù)的平均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算相應(yīng)的濃度。在相同的分析條件下進(jìn)行空白試驗，扣除空白干擾。4.3大孔吸附樹脂殘留檢查：照殘留溶劑測定法(《中國藥典》2015年版四部附錄0861第二法)測定。1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以鍵合/交聯(lián)聚乙二醇為固定相，采用彈性石英毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；氫火焰離子化檢測器，柱溫，程序升溫，起始溫度為60℃，維持16分鐘，再以每分鐘20℃升溫至200℃，維持2分鐘；檢測器溫度300℃；進(jìn)樣口溫度240℃；載氣為氮氣，流速為每分鐘1.0ml。頂空進(jìn)樣，頂空瓶平衡溫度為90℃，平衡時間為30分鐘。理論板數(shù)以鄰二甲苯峰計算應(yīng)不低于40000，各待測峰之間的分離度應(yīng)符合規(guī)定。2)對照品溶液的制備：精密稱取正己烷，苯，甲苯，對二甲苯，鄰二甲苯，苯乙烯，1，2-二乙基苯和二乙烯苯對照品適量，加N，N-二甲基乙酰胺制成每1ml中分別含20μg、4μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg、20μg的溶液，作為對照品儲備液。精密吸取上述儲備液2ml，置50ml量瓶中，加25％N，N-二甲基乙酰胺溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置20ml頂空瓶中，密封瓶口，即得。3)供試品溶液的制備：取本品約0.1g，精密稱定，置20ml頂空瓶中，精密加入25％的N，N-二甲基乙酰胺溶液5ml，密封瓶口，搖勻，即得。4)測定法：分別精密量取頂空氣體1ml，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。檢測結(jié)果：總黃酮醇苷(％)：43.0(其中槲皮素的含量為6.7％、山柰素的含量為6.15％、異鼠李素的含量為4.29％)；銀杏內(nèi)酯(％)：11.8；白果內(nèi)酯(％)：4.3；銀杏酸(百萬分之)：未檢出；熾灼殘渣(％)：0.29；鉛(百萬分之)：未檢出；鎘(千萬分之)：未檢出；砷(千萬分之)：未檢出；汞(千萬分之)：未檢出；銅(百萬分之)：未檢出；正己烷(％)：未檢出；苯(％)：未檢出；甲苯(％)：未檢出；對二甲苯(％)：未檢出；鄰二甲苯(％)：未檢出；苯乙烯(％)：未檢出；1，2-二乙基苯(％)：未檢出；二乙烯苯(％)：未檢出。實施例2：銀杏葉組合物一、提取方法(1)取銀杏葉于60℃烘3h，超微粉碎，用4倍的50％的乙醇，50℃下浸泡2h，回流提取0.5h，收集提取液，濾渣用3倍的50％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷組成的混合溶劑回流提取1.5h，收集提取液；其中，50％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的體積比為5：1：2。(2)合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.5，靜置12h，過濾，加水定容至銀杏葉量的5倍體積；(3)加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.5，4500r/min離心；(4)離心液以1.6BV/h過大孔吸附樹脂柱；用1BV的純化水、2BV的15％乙醇以3.0BV/h的流速沖洗樹脂，用5BV的80％乙醇加入樹脂柱內(nèi)浸泡0.5h，以1.3BV/h的流速洗脫，收集洗脫液；其中，樹脂柱中的樹脂為HPD450和S-8的混合物，二者的質(zhì)量比為2：1；(5)洗脫液經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，濃縮液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯組成的萃取劑萃取，萃取次數(shù)為2次；濃縮至4g/ml；其中，正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的體積比為4：1：5。(6)加入無水乙醇，使醇含量為85％，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.3，冷卻靜置24h，上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜精濾，濃縮，干燥，得銀杏葉提取物。二、含量檢測，方法同實施例1。檢測結(jié)果：總黃酮醇苷(％)：38.4(其中槲皮素的含量為7.21％、山柰素的含量為5.78％、異鼠李素的含量為2.31％)；銀杏內(nèi)酯(％)：7.2；白果內(nèi)酯(％)：3.4；銀杏酸(百萬分之)：未檢出；熾灼殘渣(％)：0.27；鉛(百萬分之)：未檢出；鎘(千萬分之)：未檢出；砷(千萬分之)：未檢出；汞(千萬分之)：未檢出；銅(百萬分之)：未檢出；正己烷(％)：未檢出；苯(％)：未檢出；甲苯(％)：未檢出；對二甲苯(％)：未檢出；鄰二甲苯(％)：未檢出；苯乙烯(％)：未檢出；1，2-二乙基苯(％)：未檢出；二乙烯苯(％)：未檢出。實施例3：銀杏葉組合物一、提取方法(1)取銀杏葉于65℃烘5h，超微粉碎，用6倍的60％的乙醇，60℃下浸泡0.5h，回流提取2h，收集提取液，濾渣用5倍的60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷組成的混合溶劑回流提取0.5h，收集提取液；其中，60％的乙醇、丙三醇和二氯甲烷的體積比為8：1：2。(2)合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8.0，靜置24h，過濾，加水定容至銀杏葉量的6倍體積；(3)加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為5.0，5000r/min離心；(4)離心液以1.8BV/h過大孔吸附樹脂柱；用1.5BV的純化水、1.5BV的15％乙醇以4.0BV/h的流速沖洗樹脂，用6BV的80％乙醇加入樹脂柱內(nèi)浸泡1h，以1.5BV/h的流速洗脫，收集洗脫液；其中，樹脂柱中的樹脂為HPD450和S-8的混合物，二者的質(zhì)量比為3：1；(5)洗脫液經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，濃縮液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯組成的萃取劑萃取，萃取次數(shù)為3次；濃縮至4g/ml；其中，正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的體積比為4：1：4。(6)加入無水乙醇，使醇含量為88％，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.8，冷卻靜置36h，上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜精濾，濃縮，干燥，得銀杏葉提取物。二、含量檢測，方法同實施例1。檢測結(jié)果：總黃酮醇苷(％)：29.7(其中槲皮素的含量為4.37％、山柰素的含量為4.26％、異鼠李素的含量為3.2％)；銀杏內(nèi)酯(％)：7.9；白果內(nèi)酯(％)：3.8；銀杏酸(百萬分之)：未檢出；熾灼殘渣(％)：0.32；鉛(百萬分之)：未檢出；鎘(千萬分之)：未檢出；砷(千萬分之)：未檢出；汞(千萬分之)：未檢出；銅(百萬分之)：未檢出；正己烷(％)：未檢出；苯(％)：未檢出；甲苯(％)：未檢出；對二甲苯(％)：未檢出；鄰二甲苯(％)：未檢出；苯乙烯(％)：未檢出；1，2-二乙基苯(％)：未檢出；二乙烯苯(％)：未檢出。實施例4：舒血寧注射液(1)取實施例1銀杏葉組合物，經(jīng)0.22μm濾膜過濾至配劑罐中，加注射用水稀釋；(2)調(diào)節(jié)pH至3.8，加熱至82℃，加入0.3wt％藥用炭，攪拌均勻，煮沸6min，(3)冷卻至50℃以下，調(diào)節(jié)pH4.8，定容，攪拌均勻(4)取樣檢測，符合規(guī)定后經(jīng)0.3μm濾膜過濾，藥液降溫至30℃以下經(jīng)0.22μm濾器精濾，取樣檢測，合格后，灌裝，充氮氣，經(jīng)115℃滅菌30min，送檢，包裝。注射液含量測定方法基本同組合物的，僅總黃酮醇苷的供試品制備有所不同：總黃酮醇苷測定中供試品溶液的制備：精密量取本品10ml，加甲醇16ml，18％鹽酸溶液6ml，置水浴中加熱回流1.5小時，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。經(jīng)檢測，含總黃酮醇苷0.92mg/ml，銀杏內(nèi)酯0.24mg/ml，白果內(nèi)酯0.11mg/ml，銀杏酸未檢出。實施例5：舒血寧注射液(1)取實施例2銀杏葉組合物，經(jīng)0.22μm濾膜過濾至配劑罐中，加注射用水稀釋；(2)調(diào)節(jié)pH至3.5，加熱至80℃，加入0.35wt％藥用炭，攪拌均勻，煮沸5min，(3)冷卻至50℃以下，調(diào)節(jié)pH4.7，定容，攪拌均勻(4)取樣檢測，符合規(guī)定后經(jīng)0.3μm濾膜過濾，藥液降溫至30℃以下經(jīng)0.22μm濾器精濾，取樣檢測，合格后，灌裝，充氮氣，經(jīng)115℃滅菌30min，送檢，包裝。經(jīng)檢測，含總黃酮醇苷0.87mg/ml，銀杏內(nèi)酯0.22mg/ml，白果內(nèi)酯0.09mg/ml。實施例6：舒血寧注射液(1)取實施例3銀杏葉組合物，經(jīng)0.22μm濾膜過濾至配劑罐中，加注射用水稀釋；(2)調(diào)節(jié)pH至4.0，加熱至85℃，加入0.2wt％藥用炭，攪拌均勻，煮沸8min，(3)冷卻至50℃以下，調(diào)節(jié)pH5.0，定容，攪拌均勻(4)取樣檢測，符合規(guī)定后經(jīng)0.3μm濾膜過濾，藥液降溫至30℃以下經(jīng)0.22μm濾器精濾，取樣檢測，合格后，灌裝，充氮氣，經(jīng)115℃滅菌30min，送檢，包裝。經(jīng)檢測，含總黃酮醇苷0.89mg/ml，銀杏內(nèi)酯0.23mg/ml，白果內(nèi)酯0.11mg/ml。對比例1(1)取銀杏葉于65℃烘4h，超微粉碎，用5倍的55％的乙醇，50-60℃下浸泡1.5h，回流提取1h，收集提取液，濾渣用4倍的55％的乙醇回流提取1h，收集提取液；(2)合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.6，靜置18h，過濾，加水定容至銀杏葉量的5倍體積；(3)加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.8，4750r/min離心；(4)離心液以1.7BV/h過大孔吸附樹脂柱；用1.2BV的純化水、1.8BV的15％乙醇以3.5BV/h的流速沖洗樹脂，用5.5BV的80％乙醇加入樹脂柱內(nèi)浸泡1h，以1.4BV/h的流速洗脫，收集洗脫液；其中，樹脂柱中的樹脂為HPD450；(5)洗脫液經(jīng)減壓濃縮得濃縮液，濃縮液采用正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯組成的萃取劑萃取，萃取次數(shù)為3次；濃縮至4g/ml；其中，正丁醇、丙三醇和乙酸乙酯的體積比為5：1：4。(6)加入無水乙醇，使醇含量為86％，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.6，冷卻靜置30h，上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜精濾，濃縮，干燥，得銀杏葉提取物。含量檢測，方法同實施例1，結(jié)果如下：檢測結(jié)果：總黃酮醇苷(％)：26.7(其中槲皮素的含量為3.92％、山柰素的含量為3.8％、異鼠李素的含量為2.91％)；銀杏內(nèi)酯(％)：6.3；白果內(nèi)酯(％)：3.1；銀杏酸(百萬分之)：6；熾灼殘渣(％)：0.67；鉛(百萬分之)：1；鎘(千萬分之)：未檢出；砷(千萬分之)：未檢出；汞(千萬分之)：未檢出；銅(百萬分之)：5；正己烷(％)：未檢出；苯(％)：未檢出；甲苯(％)：未檢出；對二甲苯(％)：未檢出；鄰二甲苯(％)：未檢出；苯乙烯(％)：未檢出；1，2-二乙基苯(％)：未檢出；二乙烯苯(％)：未檢出。實驗例1：對小鼠腦膜微循環(huán)影響的試驗(一)動物:昆明種小鼠，雌雄兼有，體重18-22g。(二)藥物S4:實施例4制備得到的舒血寧注射液，D1:對比例1的銀杏葉提取物配制形成的銀杏葉注射液(同實施例4的制備方法)。(三)儀器：AL-21型激光流量儀(四)方法：1、動物分組將小鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)對照組、腦缺血模型組、S4用藥組(3.5mg/kg，相當(dāng)于人用劑量的1.3倍)、D1用藥組(3.5mg/kg，相當(dāng)于人用劑量的1.3倍)。每組10只，雌雄各半。2、腦膜血流量的測定動物以戊巴比妥麻醉，俯臥固定，沿矢狀縫切開頭部皮膚，輕輕刮去顱骨表面結(jié)締組織，將激光探頭固定于顱骨表面(大腦皮層運(yùn)動區(qū))，用激光微循環(huán)流量儀測定腦膜微循環(huán)變化。實驗在常溫(22-25℃)下進(jìn)行。3、給藥和測定藥物經(jīng)尾靜脈注射。測定給藥前(0)和給藥后1、2、10分鐘的血流量。(五)結(jié)果:如表1所示表1.S4對小鼠腦膜微循環(huán)的影響X±S：與空白對照組比**p<0.01；從表1可以看出：空白對照組動物在10分鐘內(nèi)，腦膜微循環(huán)流量穩(wěn)定。溶媒對照組動物在給予溶媒10分鐘內(nèi)，腦膜微循環(huán)流置基本無變化。給小鼠靜脈注射相當(dāng)于人用劑量1.3S4,可明顯增加小鼠腦膜微循環(huán)，本發(fā)明的效果優(yōu)于D1。實驗例2：對冠心病心絞痛的作用1、病例：120例住院患者均符合1979年WHO制定的《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》，根據(jù)衛(wèi)生部1993年制定的中藥新藥治療胸痹(冠心病心絞痛)的臨床研究指導(dǎo)原則，確定中醫(yī)證型和冠心病心絞痛輕重分級標(biāo)準(zhǔn)。輕度：有較典型的心絞痛發(fā)作，但疼痛不重，有時需含硝酸甘油；中度：每天有數(shù)次較典型的心絞痛發(fā)作，每次持續(xù)數(shù)分鐘至10分鐘，一般都需含服硝酸甘油；較重度：每天有多次典型發(fā)作，影響日常生活活動，每次發(fā)作持續(xù)時間較長，需多次含服硝酸甘油；重度：疼痛發(fā)作次數(shù)及程度均比較嚴(yán)重者。隨機(jī)分為2組，治療1組60例，男31例，女29例，平均年齡(55.1±9.1)歲，平均病程(6.8±7.1)年；治療2組60例，男28例，女32例，平均年齡(55.8±8.6)歲，平均病程(7.0±6.8)年。2、治療方法：治療1組給予5％葡萄糖注射液250ml+實施例620ml，靜脈滴注，1次/天，連用15天；治療2組給予5％葡萄糖注射液250ml+市售注射液20ml，靜脈滴注，1次/天，連用15天。3、觀察指標(biāo)：每天觀察2次，了解臨床癥狀、體征、舌象、脈象及有關(guān)反應(yīng)，心率、血壓等一般體格檢查項目，并做詳細(xì)記錄。用藥前后各查一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，三大常規(guī)化驗及心、肝、腎功能檢查，常規(guī)12導(dǎo)聯(lián)心電圖。心絞痛癥狀療效評定標(biāo)準(zhǔn)按輕度、中度、分別評定：輕度：癥狀消失或基本消失為顯效；疼痛發(fā)作次數(shù)、程度及持續(xù)時間明顯減輕為有效；癥狀基本與治療前相同為無效；疼痛發(fā)作次數(shù)、程度及持續(xù)時間有所加重(或達(dá)到“中度、較重度”標(biāo)準(zhǔn))為加重。中度：癥狀消失或基本消失為顯效；癥狀減輕到“輕度”標(biāo)準(zhǔn)為有效；癥狀基本與治療前相同為無效；疼痛發(fā)作次數(shù)、程度及持續(xù)時間有所加重(或達(dá)到“較重度”標(biāo)準(zhǔn))為加重。心電圖療效評定標(biāo)準(zhǔn)：顯效：心電圖恢復(fù)到“大致正?！被蜻_(dá)到“正常心電圖”；有效：ST段降低，以治療后回升0.05mv以上，但未達(dá)到正常標(biāo)準(zhǔn)，在主要導(dǎo)聯(lián)倒置T波變淺(達(dá)25％以上者)，或T波由平坦變?yōu)橹绷?，房室或室?nèi)傳導(dǎo)阻滯改善者；無效：心電圖基本與治療前相同；加重：ST段較治療前降低0.05mv以上，在主要導(dǎo)聯(lián)倒置T波加深(達(dá)25％以上者)或直立T波變平坦，平坦T波變倒置，以及出現(xiàn)異位心律、房室傳導(dǎo)阻滯或室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯。4、結(jié)果實驗期間未見任何不良反應(yīng)。4.1NO、NOS、SOD、MDA變化情況：見表2。表2：治療前后NO、NOS、SOD、MDA比較注：與治療前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與治療2組比較#P＜0.05。從表2可以看出：一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)：與治療前相比，治療1組的NO、NOS、SOD顯著增加(P＜0.01)，治療2組的NO、NOS、SOD明顯增加(P＜0.05)；與治療2組相比，治療1組的NO、NOS、SOD明顯增加(P＜0.05)；丙二醛(MDA)：與治療前相比，治療1組的MDA顯著減少(P＜0.01)，治療2組的MDA明顯減少(P＜0.05)；與治療2組相比，治療1組的MDA明顯減少(P＜0.05)。4.2心絞痛臨床療效比較：見表3。表3：心絞痛療效比較例數(shù)顯效有效無效加重1組601840202組601231170從表3可以看出：從有效來說，治療1組的心絞痛效果明顯優(yōu)于治療2組；從總有效率來說，治療1組治療心絞痛的總有效率為96.7％，治療2組的總有效率為71.7％，治療1組的總有效率優(yōu)于治療2組。4.3心電圖療效比較：見表4。表4：心電圖療效比較組別例數(shù)顯效有效無效加重1組606371702組60428280從表4可以看出：從有效來說，治療1組的心電圖療效有效和顯效(37+6)明顯優(yōu)于治療2組(28+4)；從總有效率來說，治療1組治療心絞痛的總有效率為71.7％，治療2組的總有效率為53.3％，治療1組心電圖療效的總有效率優(yōu)于治療2組。4.4動態(tài)心電圖缺血性ST-T改變時間比較：見表5。表5：動態(tài)心電圖缺血性ST-T改變時間比較組別例數(shù)治療前治療后1組60130.69±17.4032.33±5.26**#※2組60128.52±18.2165.42±7.87*注：與治療前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與治療2組比較#P＜0.05。從表5可以看出：與治療前相比，治療1-2組心電圖缺血性ST-T改變時間有不同程度的減少(P＜0.05，P＜0.01)；與治療2組分別相比，治療1組心電圖缺血性ST-T改變時間明顯減少(P＜0.05)。5、實驗小結(jié)：本發(fā)明提供的組合物可以治療心絞痛，效果優(yōu)于市售產(chǎn)品。以上對本發(fā)明實施例所提供的一種舒血寧注射液及其制備方法，進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進(jìn)行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實施方式及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。當(dāng)前第1頁1 2 3