本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，特別是涉及一種采用聚合物、納米相鈣磷鹽、膠原為原料來制備的多孔骨材料以及其制備方法。

背景技術(shù)：

據(jù)統(tǒng)計，我國肢體不自由患者有5000萬人以上，其中由于缺乏骨重建手術(shù)和骨材料，已有500萬人截肢；全國每年因各類交通事故、生產(chǎn)安全事故、骨科疾病等因素，造成骨缺損或骨損傷的患者有1200萬人，骨骼不健全的人數(shù)有上千萬；全國牙缺損、牙缺失患者已逾4億。這些人急需得到妥善治療。臨床上由于創(chuàng)傷、腫瘤、感染所造成的骨缺損很常見，估計我國每年有1200萬骨科病例需要植骨。

在骨缺損填充醫(yī)用材料領(lǐng)域，長期以來，自體骨和異體骨是臨床上治療骨骼缺損的常用植骨材料。盡管自體骨移植存在來源有限和造成供骨區(qū)多種并發(fā)癥的問題，但因其具有骨誘導(dǎo)又兼有骨遺傳功能，一直以來被作為骨缺損治療的“金標準”；異體骨尚不能完全克服移植后的免疫排斥反應(yīng)，有潛在的病源傳播危險，同時存在醫(yī)學(xué)倫理學(xué)方面的障礙。

為了克服其移植所帶來的問題，人工骨材料的使用一直備受關(guān)注，歐美國家近年自體骨和異體骨相比于人工骨材料的使用正趨于明顯的下降趨勢，例如凝膠、脫礦人骨基質(zhì)、鈦合金、高聚物、硫酸鈣、生物活性玻璃、磷酸鈣骨水泥和生物陶瓷、膠原基材料等。然而膠原基材料是最具前景的，因為膠原是天然骨組織中主要的關(guān)鍵組成部分，能夠促進早期礦化和支持新骨的形成，同時材料可以生物降解最終被新骨代替。國內(nèi)外已商品化的產(chǎn)品主要有DePuy Spine的HEALOS、Orthovita的Vitoss、Synthes的chronOs、Medtronic的Mastergraft、Allgens的BonGold等，膠原含量在20至70％之間。

從對自然骨進行的研究得到啟發(fā)，納米羥基磷灰石(nano-HA)/膠原基復(fù)合物收到了極大的關(guān)注。最初，合成物通過納米羥基磷灰石與膠原的直接混合來制備，納米羥基磷灰石從現(xiàn)代陶瓷工藝而來；而膠原是提取自動物組織，但是因為膠原與羥基磷灰石相對弱的結(jié)合，使得在體內(nèi)膠原降解得較快，而羥基磷灰石依然保持原性狀而未對骨修復(fù)產(chǎn)生協(xié)同作用。

然而采用仿生的思路，可以制備出與天然骨類似的羥基磷灰石與膠原結(jié)合成具有獨特規(guī)律的分級結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。兩者的協(xié)同作用在1995年最先被報道，為仿生的制備骨修復(fù)材料提供了思路，為了克服在膠原內(nèi)部或間隔的連續(xù)礦化形成的阻礙，膠原先在酸性的溶液中被分散，通過調(diào)節(jié)pH值或者加入添加劑使其協(xié)同沉淀，羥基磷灰石納米晶體開始在鈣鹽、磷酸鹽和膠原溶液混合的懸浮體系中形成，即生物礦化。

同時為了得到生物相容性好、降解速率可控、易成型的具有高度孔隙率、合適孔徑尺寸的框架材料，通過高分子材料與納米晶磷酸鈣膠原基復(fù)合的方式來制備良好的生物骨材料。

聚丙交酯(PLGA)具有無毒、可靠的生物安全性，是被美國FDA批準用于臨床的可降解生物材料。聚丙交酯具有一定的強度，材料的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使其能夠適應(yīng)一定范圍的壓力變化，同時多孔組織能夠使血液流通，保證了骨組織的正常代謝。多孔材料植入體內(nèi)后，由于它的比表面積(表面積/體積)的增大，有利于微小血管、纖維結(jié)締組織的長入及營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的輸送，引導(dǎo)成骨細胞的遷移；同時產(chǎn)品本身在骨的形成過程中轉(zhuǎn)化為新骨的主要成份，促進新骨形成，從而使材料引導(dǎo)細胞的能力和成骨活性增加。然而，由于PLGA的降解時間隨著PGA段的共聚到PLA段上，降解時間較快，不利于骨再生，使得降解時間與骨重建不匹配。另外，現(xiàn)有技術(shù)中，在制造礦化膠原干粉時，存在局部離子濃度過大或者過小、磷酸根離子和/或鈣離子殘留導(dǎo)致的洗滌時間過長、沉淀物洗滌費時、鈣磷鹽利用率低等問題，在制備礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料的力學(xué)性能低、降解時間短以及制備時礦化膠原干粉分散性差、有機溶劑殘留量過大和難以去除、孔隙率低等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了實現(xiàn)上述目的，解決本領(lǐng)域存在的上述問題，本發(fā)明在第一方面提供了一種制備礦化膠原干粉的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)使用酸液將I型膠原纖維配制成濃度為0.0001至0.001g/ml的膠原溶液；

(2)以0.08至0.12摩爾鈣離子/克膠原的量向所述膠原溶液中加入含鈣離子水溶液，從而制得鈣/膠原復(fù)合溶液；

(3)以Ca/P＝1.2～1.8的量向所述鈣/膠原復(fù)合溶液中加入含磷酸根離子水溶液，從而制得鈣/磷/膠原復(fù)合溶液；

(4)將鈣/磷/膠原復(fù)合溶液調(diào)節(jié)至pH值為8，攪拌、分離沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5，從而獲得沉淀物；

(5)使用純化水洗滌沉淀物并抽濾，獲得濾餅；

(6)在常壓下將濾餅于-30～-20℃進行預(yù)凍，再在真空條件下于-10～0℃進行升華，從而對濾餅進行冷凍干燥；

(7)將經(jīng)過冷凍干燥的濾餅研磨成粒徑不大于80目的礦化膠原干粉。

本發(fā)明在第二方面提供了本發(fā)明第一方面所述方法制得的礦化膠原干粉。

本發(fā)明在第三方面提供了本發(fā)明第二方面所述的礦化膠原干粉在制備礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明在第四方面提供了一種制備礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料的方法，所述方法包括如下步驟：

(a)配制質(zhì)量體積濃度為0.05至0.10g/ml的高分子聚合物溶液，使用的溶劑為選自由1,4-二氧六環(huán)、氯仿或二甲基亞砜組成的組中的任一種；

(b)向所述高分子聚合物溶液中加入礦化膠原干粉，制得聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液，所述礦化膠原干粉與所述高分子聚合物的質(zhì)量比為1:2～3:2；

(c)在常壓下將聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液于-30～-20℃進行預(yù)凍，再在真空條件下于-10～0℃進行升華；

(d)通過超聲抽提的方式除去凍干后殘留的有機溶劑并干燥；

(e)對去除了有機溶劑的材料進行滅菌，從而制得所述礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料。

本發(fā)明在第五方面還提供了一種制備礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)使用酸液將I型膠原纖維配制成濃度為0.0001至0.001g/ml的膠原溶液；

(2)以0.08至0.12摩爾鈣離子/克膠原的量向所述膠原溶液中加入含鈣離子水溶液，從而制得鈣/膠原復(fù)合溶液；

(3)以Ca/P＝1.2～1.8的量向所述鈣/膠原復(fù)合溶液中加入含磷酸根離子水溶液，從而制得鈣/磷/膠原復(fù)合溶液；

(4)將鈣/磷/膠原復(fù)合溶液調(diào)節(jié)至pH值為8，攪拌、分離沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5，從而獲得沉淀物；

(5)使用純化水洗滌沉淀物并抽濾，獲得濾餅；

(6)在常壓下將濾餅于-30～-20℃進行預(yù)凍，再在真空條件下于-10～0℃進行升華，從而對濾餅進行冷凍干燥；

(7)將經(jīng)過冷凍干燥的濾餅研磨成粒徑不大于80目的礦化膠原干粉；

(8)配制質(zhì)量體積濃度為0.05至0.10g/ml的高分子聚合物溶液，使用的溶劑為選自由1,4-二氧六環(huán)、氯仿或二甲基亞砜組成的組中的任一種；

(9)向所述高分子聚合物溶液中加入礦化膠原干粉，制得聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液，所述礦化膠原干粉與所述高分子聚合物的質(zhì)量比為1:2～3:2；

(10)在常壓下將聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液于-30～-20℃進行預(yù)凍，再在真空條件下于-10～0℃進行升華；

(11)通過超聲抽提的方式除去凍干后殘留的有機溶劑并干燥；

(12)對去除了有機溶劑的材料進行滅菌，從而制得所述礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料。

本發(fā)明在第六方面提供了本發(fā)明第四或第五方面所述方法制得的礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料。

本發(fā)明在第七方面提供了本發(fā)明第六方面所述的礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料在制造骨植入物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點以及所帶來的預(yù)想不到的技術(shù)效果至少包括如下幾點：

(1)采用的膠原溶液濃度為0.0001至0.001g/ml，在該膠原濃度下，整體溶液粘度更加適中，不會造成粘度對于局部離子濃度過大或過小的影響。

(2)采用鈣磷摩爾投料比為Ca：P＝1.2至1.8，提高了鈣鹽和磷鹽的利用效率，減少了材料中游離鈣鹽和磷鹽的殘留。

(3)采用pH值為8的沉淀終點，使得礦化膠原沉淀得更加快速而充分，顯著減少了攪拌和靜置時間。

(4)采用80目以下的礦化膠原干粉，使得其在與膠原粘合劑混合時，更容易分散。

(5)采用了40kgy以下的輻照劑量進行滅菌加工，不明顯降低材料的力學(xué)性能和降解時間。

(6)采用高分子聚合物與有機溶劑的質(zhì)量體積比為0.05至0.10g/ml，根據(jù)作為組織工程用的多孔支架，不同的組織細胞對孔徑有不同的要求，而骨和軟骨組織工程則需要100至250μm的孔徑，對于可降解多孔支架材料200至400μm為佳，故該濃度下有機溶劑造孔孔徑接近理論值，且孔隙率為70至95％；

(7)采用了室溫對高分子聚合物進行在良溶劑下的溶脹，因采用了聚合物的良溶劑，故在室溫下即可完成溶脹，減少了溫度較高下溶劑揮發(fā)以及毒性等風險；

(8)通過分段凍干的方式，使得材料能夠在較低溫度下固化，在稍高溫度下升華，縮短了凍干時間。

(9)以聚乳酸(PLA)如左旋聚乳酸和聚己內(nèi)酯(PCL)代替PLGA作為高分子支架材料，使得降解時間與骨重建匹配。

(10)由于采用超聲抽提的方式除去凍干后有機溶劑的殘留，時間短，效率高，殘留量小。

具體實施方式

如上所述，本發(fā)明在第一方面提供了一種制備礦化膠原干粉的方法所述方法包括如下步驟：

(1)使用酸液將I型膠原纖維配制成濃度為0.0001至0.001g/ml(例如0.0001、0.0005或0.001g/ml)的膠原溶液；

(2)以0.08至0.12(例如0.08、0.10或0.12)摩爾鈣離子/克膠原的量向所述膠原溶液中加入含鈣離子水溶液，從而制得鈣/膠原復(fù)合溶液；

(3)以Ca/P＝1.2～1.8(例如1.2、1.4、1.6或1.8)的量向所述鈣/膠原復(fù)合溶液中加入含磷酸根離子水溶液，從而制得鈣/磷/膠原復(fù)合溶液；

(4)將鈣/磷/膠原復(fù)合溶液調(diào)節(jié)至pH值為8，攪拌、分離沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5(例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)，從而獲得沉淀物；

(5)使用純化水洗滌沉淀物并抽濾，獲得濾餅；

(6)在常壓下將濾餅于-30～-20℃(例如-30、-25或-20℃)進行預(yù)凍，再在真空條件下于-10～0℃(例如-10、-5或0℃)進行升華，從而對濾餅進行冷凍干燥；

(7)將經(jīng)過冷凍干燥的濾餅研磨成粒徑不大于80目(例如不大于80、90、100或120目)的礦化膠原干粉。

在一些優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中的所述酸液選自由鹽酸水溶液、硝酸水溶液和乙酸水溶液組成的組，優(yōu)選的是乙酸水溶液。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述酸液的濃度為0.45至0.55mM(例如0.45、0.50或0.55mM)。

在一些優(yōu)選的實施方式中，步驟(4)中的pH使用氫氧化鈉水溶液來調(diào)節(jié)，優(yōu)選的是，所述氫氧化鈉水溶液的濃度為0.9M至1.1M(例如0.9、1.0或1.1M)。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述含鈣離子水溶液和/或含磷酸根離子水溶液的加入采用邊緩慢滴加邊攪拌的方式進行。

在一些優(yōu)選的實施方式中，在步驟(4)中將pH調(diào)節(jié)至8之后，再攪拌8至24小時，形成白色懸濁液，靜置12至24小時(例如12、18或24小時)，除去上清，再加純化水至原體積后攪拌5至10次(例如5、6、7、8、9或10次)，靜置1至3小時后除去上清，連續(xù)清洗3至7次，直到上清液的pH值在7.0～7.5(7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)之間。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述含鈣離子水溶液的濃度為0.45M至0.55M(例如0.45、0.50或0.55M)。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述含磷酸根離子水溶液的濃度為0.4M至0.6M(例如0.40、0.50或0.60M)。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述I型膠原纖維為非凝膠狀態(tài)的I型牛膠原纖維。

在一些優(yōu)選的實施方式中，用于制備所述含鈣離子水溶液的鈣鹽和用于制備含磷酸根離子水溶液的磷鹽為藥用或藥用輔料級別的鈣鹽和磷鹽。

本發(fā)明在第二方面提供了本發(fā)明第一方面所述方法制得的制得的礦化膠原干粉。

本發(fā)明在第三方面提供了本發(fā)明第一方面所述方法制得的或者本發(fā)明第二方面所述的礦化膠原干粉在制備礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明在第四方面提供了一種制備礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料的方法，所述方法包括如下步驟：

(a)配制質(zhì)量體積濃度為0.05至0.10g/ml的高分子聚合物溶液，使用的溶劑為選自由1,4-二氧六環(huán)、氯仿或二甲基亞砜組成的組中的任一種；

(b)向所述高分子聚合物溶液中加入礦化膠原干粉，制得聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液，所述礦化膠原干粉與所述高分子聚合物的質(zhì)量比為1:2～3:2(例如1:2、2:2或3:2)；

(c)在常壓下將聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液于-30～-20℃(例如-30、-25或-20℃)進行預(yù)凍，再在真空條件下于-10～0℃(例如-10、-5或0℃)進行升華；

(d)通過超聲抽提的方式除去凍干后殘留的有機溶劑并干燥；

(e)對去除了有機溶劑的材料進行滅菌，從而制得所述礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料。

在一些優(yōu)選的實施方式中，在步驟(d)和(e)之間還包括有機溶劑殘留量是否處在合格殘留值范圍內(nèi)的檢測步驟。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述合格殘留值范圍為小于或者等于50ppm。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述檢測步驟通過如下方式進行：稱取1.0g的二次凍干膠原復(fù)合物，檢測有機溶劑殘留量是否小于或者等于50ppm(例如不大于50、40、30、20或10ppm)，如果大于50ppm，則重復(fù)步驟(d)，直至有機溶劑殘留量小于或者等于50ppm。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述高分子聚合物為PLA和/或PCL在一些更優(yōu)選的實施方式中，所述PLA的粘均分子量(下文有時簡稱為分子量)為100,000～300,000(例如為100,000、200,000或300,000)。在另外一個優(yōu)選的實施方式中，所述PCL的特性粘度1.0至2.5dl/g(例如為1.0、1.5、2.0或2.5)。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述超聲抽提通過如下方式進行：將樣品放置到燒杯中，用無水乙醇完全浸沒至少2小時后；超聲波清洗，2至10min(例如2、5、7或10分鐘)后倒掉清洗液，再重復(fù)超聲2至5次后；裝入離心機裝載過濾袋，離心一次(3至20秒)(例如3、5、7、10、15或20秒)，離心機轉(zhuǎn)速為1000至4000r/min(例如1000、2000、3000或4000r/min)，然后進行真空干燥。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述滅菌通過采用15kgy至40kgy(例如15、20、25、30、35或40kgy)的鈷-60輻照劑量進行。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述礦化膠原干粉為本發(fā)明第一方面所述的方法制得。

本發(fā)明在第五方面還提供了一種制備礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)使用酸液將I型膠原纖維配制成濃度為0.0001至0.001g/ml的膠原溶液；

(2)以0.08至0.12摩爾鈣離子/克膠原的量向所述膠原溶液中加入含鈣離子水溶液，從而制得鈣/膠原復(fù)合溶液；

(3)以Ca/P＝1.2～1.8的量向所述鈣/膠原復(fù)合溶液中加入含磷酸根離子水溶液，從而制得鈣/磷/膠原復(fù)合溶液；

(4)將鈣/磷/膠原復(fù)合溶液調(diào)節(jié)至pH值為8，攪拌、分離沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5，從而獲得沉淀物；

(5)使用純化水洗滌沉淀物并抽濾，獲得濾餅；

(6)在常壓下將濾餅于-30～-20℃進行預(yù)凍，再在真空條件下于-10～0℃進行升華，從而對濾餅進行冷凍干燥；

(7)將經(jīng)過冷凍干燥的濾餅研磨成粒徑不大于80目的礦化膠原干粉；

(8)配制質(zhì)量體積濃度為0.05至0.10g/ml的高分子聚合物溶液，使用的溶劑為選自由1,4-二氧六環(huán)、氯仿或二甲基亞砜組成的組中的任一種；

(9)向所述高分子聚合物溶液中加入礦化膠原干粉，制得聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液，所述礦化膠原干粉與所述高分子聚合物的質(zhì)量比為1:2～3:2(例如1:2、2:2或3:2)；

(10)在常壓下將聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液于-30～-20℃(例如-30、-25或-20℃)進行預(yù)凍，再在真空條件下于-10～0℃(例如-10、-5或0℃)進行升華；

(11)通過超聲抽提的方式除去凍干后殘留的有機溶劑并干燥；

(12)對去除了有機溶劑的材料進行滅菌，從而制得所述礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料。

在一些優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中的所述酸液選自由鹽酸水溶液、硝酸水溶液和乙酸水溶液組成的組，優(yōu)選的是乙酸水溶液。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述酸液的濃度為0.45至0.55mM。

在一些優(yōu)選的實施方式中，步驟(4)中的pH使用氫氧化鈉水溶液來調(diào)節(jié)，優(yōu)選的是，所述氫氧化鈉水溶液的濃度為0.9M至1.1M。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述含鈣離子水溶液和/或含磷酸根離子水溶液的加入采用邊緩慢滴加邊攪拌的方式進行。

在一些優(yōu)選的實施方式中，在步驟(4)中將pH調(diào)節(jié)至8之后，再攪拌8至24小時，形成白色懸濁液，靜置12至24小時，除去上清，再加純化水至原體積后攪拌5至10次，靜置1至3小時后除去上清，連續(xù)清洗3至7次，直到上清液的pH值在7.0～7.5之間。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述含鈣離子水溶液的濃度為0.45M至0.55M。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述含磷酸根離子水溶液的濃度為0.4M至0.6M。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述I型膠原纖維為非凝膠狀態(tài)的I型牛膠原纖維。

在一些優(yōu)選的實施方式中，用于制備所述含鈣離子水溶液的鈣鹽和含磷酸根離子水溶液的鈣鹽和用于制備含磷酸根離子水溶液的磷鹽為藥用或藥用輔料輔料級別的鈣鹽和磷鹽。

在一些優(yōu)選的實施方式中，在步驟(11)和(12)之間還包括有機溶劑殘留量是否處在合格殘留值范圍內(nèi)的檢測步驟。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述合格殘留值范圍為小于或者等于50ppm。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述檢測步驟通過如下方式進行：稱取1.0g的二次凍干膠原復(fù)合物，檢測有機溶劑殘留量是否小于或者等于50ppm(例如不大于50、40、30、20或10ppm)，如果大于50ppm，則重復(fù)步驟(d)，直至有機溶劑殘留量小于或者等于50ppm。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述高分子聚合物為PLA和/或PCL。在一些更優(yōu)選的實施方式中，所述PLA的分子量為100,000～300,000(例如為100,000、200,000或300,000)。在另外一個優(yōu)選的實施方式中，所述PCL的特性粘度1.0至2.5dl/g(例如為1.0、1.5、2.0或2.5)。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述超聲抽提通過如下方式進行：將樣品放置到燒杯中，用無水乙醇完全浸沒至少2小時后；超聲波清洗，2至10min(例如2、5、7或10分鐘)后倒掉清洗液，再重復(fù)超聲2至5次后；裝入離心機裝載過濾袋，離心一次(3至20秒)(例如3、5、7、10、15或20秒)，離心機轉(zhuǎn)速為1000至4000r/min(例如1000、2000、3000或4000r/min)，然后進行真空干燥。

在一些優(yōu)選的實施方式中，所述滅菌通過采用15kgy至40kgy的鈷-60輻照劑量進行。

在一些更具體的實施方式中，本發(fā)明的用于制備礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料的方法包括如下步驟：

(1)配制成I型膠原纖維的酸溶液，其中的酸選自由鹽酸、硝酸或乙酸組成的組中的任何一種，酸溶液中的膠原的濃度為0.0001至0.001g/ml；

(2)在酸溶液中緩慢滴加含有鈣離子的溶液，滴加量為每克膠原滴加鈣離子0.08至0.12mol，滴加的同時攪拌；

(3)在上述的溶液中邊攪拌邊緩慢滴加含有磷酸根離子的水溶液，加入的磷酸根離子的量與加入的鈣離子的量的摩爾比為Ca：P＝1.2至1.8；

(4)在滴加了磷酸根離子的溶液中邊攪拌邊滴加NaOH溶液至pH值為8，再攪拌8至24小時，形成白色懸濁液，靜置12至24小時，除去上清，再加純化水至原體積攪拌，靜置1至3小時后除去上清，連續(xù)清洗5至10次，直到上清液的pH值在7.0～7.5之間；

(5)開啟抽濾設(shè)備，分批倒入沉淀物，進行抽濾，用純化水重復(fù)洗滌濾餅2至4次；

(6)放入凍干機內(nèi)于-30～-20℃進行預(yù)凍(不抽真空)，-10～0℃進行升華(抽真空)干燥；

(7)隨后研磨制得礦化膠原干粉，80目不銹鋼篩網(wǎng)篩分備用；

(8)將分子量為100,000～300,000的PLA或特性粘度1.0至2.5dl/g的PCL置于反應(yīng)釜中，加入溶劑，在室溫下配制質(zhì)量體積濃度為0.05至0.10g/ml的溶液，其中，溶劑為1,4-二氧六環(huán)、氯仿或二甲基亞砜中的任何一種；

(9)向聚合物溶液中加入礦化膠原干粉，混合均勻，其中，礦化膠原干粉與聚合物的質(zhì)量比為1:2～3:2，制得聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液；

(10)將獲得的溶液進行凍干，參數(shù)同礦化膠原干粉制備時所采用的條件；

(11)通過超聲抽提的方式，除去凍干后殘留的有機溶劑，其中將樣品放置到燒杯中，用無水乙醇完全浸沒至少2小時后；超聲波清洗，2至10min后倒掉清洗液，再重復(fù)超聲2至5次后；裝入離心機裝載過濾袋，離心一次(3至20秒)，離心機轉(zhuǎn)速為1000至4000r/min，后進行真空干燥；

(12)采用40kgy以下的鈷-60輻照劑量進行滅菌加工，即可獲得礦化膠原/高分子復(fù)合多孔骨材料。

本發(fā)明在第六方面提供了本發(fā)明第四方面或第五方面所述方法制得的礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料。

本發(fā)明第七方面提供了本發(fā)明第六方面所述的礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料在制造骨植入物中的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，本發(fā)明人至少在如下方面進行了改進并取得了相應(yīng)的技術(shù)效果：

(1)采用每克膠原滴加鈣離子0.08至0.12mol；現(xiàn)有技術(shù)中有時候會滴加過少的鈣離子，有時甚至低至0.01mol；有時候又滴加過多的鈣離子，有時高至0.16mol/g；過多的鈣離子會導(dǎo)致鈣鹽的浪費或者材料中殘留多余的游離鈣離子，使得后續(xù)的清洗變得復(fù)雜甚至困難，如果鈣離子過少，則可能導(dǎo)致膠原礦化不足，強度變低，材料與骨組織差異大，影響材料的骨引導(dǎo)性和誘導(dǎo)性。

(2)采用膠原溶液濃度為0.0001至0.001g/ml，在該膠原濃度下，整體溶液粘度更加適中，避免因粘度造成局部離子濃度過大或過小所帶來的影響。

(3)采用鈣磷摩爾投料比為Ca：P＝1.2至1.8，使得材料的無機鹽成份更加符合羥基磷灰石的理論鈣磷比1.667，提高了鈣鹽和磷鹽的利用率，減少鈣離子和/或磷酸根離子在材料中的殘留，降低后續(xù)洗滌等操作難度，提高時間效率，避免游離鈣離子或磷酸根離子殘留造成的材料強度不足的問題。

(4)采用pH值為8的沉淀終點，使得礦化膠原沉淀得更加快速更加充分，顯著減少了攪拌和靜置時間；現(xiàn)有技術(shù)中甚至采用高達9或低至7的pH，使得僅靜置時間甚至長達5天時間。另外，由于過去經(jīng)常滴加NaOH溶液至混合體系pH＝6～8，并觀察到當pH＝5～6時，混合體系開始出現(xiàn)沉淀，當pH＝7時，混合體系出現(xiàn)白色懸濁液，因此經(jīng)常滴加NaOH至pH在7左右。本發(fā)明人經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，滴加NaOH溶液至混合體系pH＝8，沉淀后再洗滌至7.0至7.5，反而可以提高沉淀效果并降低所需時間。

(5)采用80目以下的礦化膠原干粉與高分子聚合物混合，該目數(shù)下的干粉更容易在聚合物溶液體系中進行分散。

(6)采用高分子聚合物與有機溶劑的質(zhì)量體積比為0.05至0.10g/ml，根據(jù)作為組織工程用的多孔支架，不同的組織細胞對孔徑有不同的要求，而骨和軟骨組織工程則需要100至250μm的孔徑，對于可降解多孔支架材料200至400μm為佳，故該濃度下有機溶劑造孔孔徑接近理論值，且孔隙率為70至95％；

(7)采用了室溫對高分子聚合物進行在良溶劑下的溶脹，因采用了聚合物的良溶劑，故在室溫下即可完成溶脹，減少了溫度較高下溶劑揮發(fā)以及毒性等風險；

(8)采用了40kgy以下的輻照劑量進行滅菌加工，因為材料為可吸收聚合物和膠原等對于輻照敏感的材料，為了不明顯降低材料的力學(xué)性能和降解時間，采用低的輻照劑量進行滅菌是非常必要的。

另外，本發(fā)明人還在質(zhì)量體系建立過程中，對部分原材料進行了如下改進并取得了相應(yīng)的技術(shù)效果：

(1)采用了I型膠原蛋白，非凝膠狀態(tài)的纖維作為膠原原料，避免因為凝膠中固含量的不一致，造成投料量不一致；同時Ⅰ型膠原是在動物體中發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，是自體骨的主要有機組成部分。I型膠原蛋白是脊柱動物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是成骨過程中成骨細胞分泌的細胞外基質(zhì)，是鈣鹽沉積的支架和骨基質(zhì)礦化的促進劑、礦化的模板；能促進細胞遷移、吸附、分化，并能調(diào)節(jié)細胞生長，作為生物材料已被美國FDA認可，并有一系列膠原植入產(chǎn)品，包括骨植入產(chǎn)品。

(2)采用了藥用或藥用輔料級別的鈣鹽、磷鹽，避免因為原料的級別造成雜質(zhì)、重金屬、灰分的超標，也影響材料的生物相容性。

(3)以左旋聚乳酸(PLA)和聚己內(nèi)酯(PCL)代替PLGA作為高分子支架材料，因為PLGA的降解時間隨著PGA段的共聚到PLA段上，降解時間較快，不利于骨再生，本發(fā)明單獨使用PLA和PCL使得降解時間與骨重建匹配。

另外，本發(fā)明人還采用抽濾方式進行上清液與沉淀物的分離，并清洗到中性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有技術(shù)中的離心方式相比，如此可以使得多孔材料得到重新與純化水接觸的機會，其內(nèi)外部經(jīng)過多次洗滌后，浸提液的pH值能夠趨近于中性。

此外，本發(fā)明人通過分段凍干的方式，除去溶劑并造孔，即在常壓下(不抽真空)在凍干機中在-30～-20℃先進行預(yù)凍，然后在真空條件才在-10～0℃進行升華，使得材料能夠在較低溫度下固化，在稍高溫度下升華，顯著地縮短了凍干時間。

此外，所制得的修復(fù)材料中有機溶劑殘留一直是技術(shù)難題。本發(fā)明人通過超聲抽提的方式，除去凍干后有機溶劑的殘留(1,4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、氯仿)，較采用真空解析多孔材料時易產(chǎn)生的傳質(zhì)平衡以及時間長、效率較低(殘留量有時高達150ppm)等缺點，超聲使得提取液充分進入而接觸材料內(nèi)部，大大縮短了時間，超聲抽提之后，提高了效率，并且殘留量小于50ppm。

需要特別指出的是，本說明書的數(shù)值范圍表示該數(shù)值范圍的上限值、下限值以及處在該數(shù)值范圍之內(nèi)的任何數(shù)值或者子范圍。因此，如果沒有特別說明，在本說明書中涉及數(shù)值范圍時就不再詳細列舉包含在該數(shù)值范圍內(nèi)的具體數(shù)值。

實施例

下文將通過實施例的形式對本發(fā)明進行舉例說明，但是本發(fā)明的保護范圍不應(yīng)被理解為限于這些實施例。

實施例1

(1)使用0.5M的乙酸溶液配制0.0005g/ml的I型膠原纖維的酸溶液；

(2)向所述酸溶液中邊攪拌邊緩慢滴加0.5M的含鈣離子水溶液，加入量為每克膠原滴加鈣離子0.10mol，從而形成鈣/膠原復(fù)合溶液；

(3)在鈣/膠原復(fù)合溶液中邊攪拌邊滴加0.5M的含磷酸根離子水溶液，加入的磷酸根離子的量與加入的鈣離子的量的摩爾比為Ca/P＝1.5；

(4)在滴加了磷酸根離子的溶液中邊攪拌邊滴加1M的NaOH水溶液至pH值為8，再攪拌16小時，形成白色懸濁液，靜置18小時，除去上清，再加純化水至原體積后攪拌，靜置2小時后除去上清，連續(xù)清洗5次，經(jīng)檢測，此時的上清液的pH值為7.2(處在7.0～7.5之間)，得到沉淀物；

(5)開啟抽濾設(shè)備，倒入沉淀物，進行抽濾，用純化水重復(fù)洗滌濾餅3次，得到濾餅；

(6)將濾餅放入冷凍干燥機內(nèi)在-25℃在常壓下進行預(yù)凍，在真空條件下-5℃進行升華從而實現(xiàn)冷凍干燥；

(7)在濾餅周邊四等分處以及濾餅中央位置進行五點取樣，觀察分析其均質(zhì)性；然后將經(jīng)過冷凍干燥的濾餅研磨，制得礦化膠原干粉，80目不銹鋼篩網(wǎng)篩分備用。

實施例2至4

除了下表1的內(nèi)容之外，以與實施例1基本相同的方式進行。

實施例5

除了下表1的內(nèi)容之外，以與實施例1基本相同的方式進行，其中沉淀時間36小時后測量pH。

實施例6

除了下表1的內(nèi)容之外，以與實施例1基本相同的方式進行，其中檢測pH達到7.2時所需要的靜置沉淀時間，如果pH沒有達到7.2，則重復(fù)添加水再靜置沉淀，記錄靜置所需的時間。

實施例7

(7')以與實施例1相同的方式制備礦化膠原干粉；

(8)將分子量為100,000PLA置于反應(yīng)釜中，加入溶劑，在室溫下配制質(zhì)量體積濃度為0.05g/ml的溶液，其中，溶劑為1,4-二氧六環(huán)；

(9)向PLA溶液中加入所述礦化膠原干粉，混合均勻，礦化膠原干粉與聚合物的質(zhì)量比為1:2，制得聚合物/鈣磷鹽/膠原/混合溶液；

(10)在常壓下將PLA/鈣磷鹽/膠原/混合溶液于-20℃進行預(yù)凍，再在真空條件下于-5℃進行升華；

(11)通過超聲抽提的方式，除去凍干后殘留的有機溶劑，其中將樣品放置到燒杯中，用無水乙醇完全浸沒2小時后；超聲波清洗，5min后倒掉清洗液，再重復(fù)超聲3次后；裝入離心機裝載過濾袋，離心一次10秒，離心機轉(zhuǎn)速為25000r/min，后進行真空干燥；取出約0.1g做有機溶劑殘留測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機溶劑殘留量小于50ppm；

(12)采用20kgy以下的鈷-60輻照劑量進行滅菌加工，即可獲得礦化膠原/高分子復(fù)合多孔骨材料。

然后測量所制得的礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料的平均孔徑和孔隙率。

實施例8-12

除了下表2所示內(nèi)容之外，以與實施例7相同的方式進行。

實施例13

除了下表2所示內(nèi)容之外，以與實施例7基本相同的方式進行，不過在步驟(12)中，不進行超聲抽提，而是通過抽真空來除去溶劑。

實施例14

以與實施例7基本相同的方式進行，區(qū)別在于采用60kgy的鈷-60輻照劑量進行滅菌加工，然后測量實施例7和實施例14所得的礦化膠原-高分子復(fù)合多孔骨材料的力學(xué)性能和降解時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者抗壓強度是后者的2倍，后者往往小于0.5MPa，降解時間前者是后者的1.5倍，后者往往小于3個月。