本發(fā)明涉及一種基于糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法。

背景技術(shù)：

1型糖尿病是一種自身免疫性疾病。該疾病由機(jī)體免疫系統(tǒng)功能障礙，導(dǎo)致胰島β-細(xì)胞壞死，引起糖代謝功能障礙。盡管據(jù)International Diabetes Federation(IDF)統(tǒng)計(jì)，1型糖尿病患者僅占總糖尿病患者的10％。但1型糖尿病發(fā)病較早，多發(fā)于兒童及青少年，因此患病時(shí)間較長，如血糖控制不當(dāng)會引發(fā)包括心臟、腎臟、肝臟、神經(jīng)及眼部等多重器官并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并對社會及家庭造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，注射胰島素是主要的治療1型糖尿病的方法，該方法雖可以有效控制患者血糖，卻無法根治1型糖尿病，也無法對患者代謝功能紊亂等做出更為精準(zhǔn)的控制。另外，長期服用胰島素也會造成體重增加，不利于進(jìn)行血糖檢測及對其他心血管并發(fā)癥的調(diào)控。

胰島移植可被認(rèn)為是治療1型糖尿病手段中最具有潛力的治愈性治療手段。自2000年Edmonton胰島移植方法成功使7名糖尿病患者實(shí)現(xiàn)100％脫離對胰島素的依賴后，胰島移植這一手段成為有可能完全治愈1型糖尿病最具潛力的途徑。但Edmonton protocol主要通過直接向肝臟門靜脈注射胰島的方法進(jìn)行胰島移植，隨后的臨床結(jié)果表明，在接受治療的糖尿病患者中，胰島移植術(shù)后，超過90％的患者在5年內(nèi)均病情復(fù)發(fā)，重新進(jìn)行胰島素治療。導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)的主要原因在于移植后的胰島在患者體內(nèi)，因胰島移植位置、免疫反應(yīng)等諸多原因無法及時(shí)完成血運(yùn)重建，導(dǎo)致胰島流失加速，從而加大胰島移植手術(shù)在所需胰島數(shù)量上的要求。而胰島移植手術(shù)的另一個(gè)瓶頸恰恰是供體數(shù)量有限，因此造成惡性循環(huán)，使目前胰島移植無法前行。因此如何完善胰島移植手段，使胰島能夠更好的被納入接受移植患者的循環(huán)系統(tǒng)，從而解決胰島流失問題，是現(xiàn)階段針對胰島移植研究的重點(diǎn)方向。

采用生物材料輔助胰島移植的相關(guān)研究也在近年來被廣泛關(guān)注。目前胰島移植所采用的生物材料眾多且各有優(yōu)缺，可大體分為包裹型材料和半包裹型材料兩大類。半包裹材料中的多孔支架類生物材料，能夠?yàn)橐葝u移植創(chuàng)造除傳統(tǒng)移植點(diǎn)之外的新移植部位，但無法從根本解決接受胰島移植患者免疫排斥等基本問題。包裹型材料包括水凝膠、微膠囊等，因?yàn)檫@類材料可以將胰島完全包裹，因此能夠解決移植手術(shù)后患者機(jī)體對移植胰島的免疫排斥反應(yīng)。但同時(shí)，也由于這類材料對胰島的完全包裹，不利于毛細(xì)血管的形成，因此在胰島移植后血運(yùn)重建等方面有所欠缺。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種反應(yīng)條件溫和，操作簡便易行的基于糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法。

根據(jù)本發(fā)明的基于糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法，包括如下步驟：S101：將糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠溶解于酸性緩沖溶液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％～50％的溶液后，去除所述溶液中的氧氣，然后依次向所述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，去除氧氣后活化15分鐘～45分鐘，以得到活化后的溶液；S102：將多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇溶解于水中并去除氧氣，然后加入到所述活化后的溶液中，室溫下反應(yīng)30分鐘～120分鐘；S103：向所述步驟S102處理過的溶液中加入熒光染色試劑，避光反應(yīng)25分鐘～35分鐘；S104：將所述步驟S103處理過的溶液冷凍干燥，以得到胰島培養(yǎng)支架；其中，所述糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠與所述N-羥基丁二酰亞胺的物質(zhì)的量之比為(1:1)～(1:10)；所述糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠與所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺的物質(zhì)的量之比為(1:1)～(1:10)。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的基于糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法，采用多臂聚乙二醇胺和/或多臂聚氧乙烯胺交聯(lián)肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素以及透明質(zhì)酸等糖胺聚糖類的細(xì)胞外基質(zhì)仿生水凝膠，糖胺聚糖類的細(xì)胞外基質(zhì)仿生水凝膠的生物相容性很好，多臂聚乙二醇、多臂聚氧乙烯胺以及糖胺聚糖類的細(xì)胞外基質(zhì)仿生水凝膠均為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)用材料，并且能比較全面的模擬胰島細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境。利用糖胺聚糖靜電作用力以及預(yù)先設(shè)下的N-羥基琥珀酰亞胺活化酯殘基，通過層層自組裝的物理方法，成功將胰島細(xì)胞團(tuán)包裹在凝膠中，通過在凝膠本體連接小分子熒光基團(tuán)，再次證明凝膠與胰島的結(jié)合。本發(fā)明操作簡便易行，反應(yīng)條件溫和，易于工業(yè)化，且化學(xué)/生物性狀穩(wěn)定，也適用于臨床應(yīng)用。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的基于糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

優(yōu)選地，所述糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠為肝素；所述步驟S102為：將多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧氣，然后加入到所述活化后的溶液中，室溫下反應(yīng)30分鐘～120分鐘；其中，所述肝素與所述多臂聚乙二醇胺的質(zhì)量比為(10:1)～(1:10)。

優(yōu)選地，所述多臂聚乙二醇胺為四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。

進(jìn)一步地，所述肝素的相對分子質(zhì)量為8000～14000，所述多臂聚乙二醇胺的相對分子質(zhì)量為2000～20000。

優(yōu)選地，所述糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠為硫酸軟骨素；所述步驟S102為：將多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧氣，然后加入到所述活化后的溶液中，室溫下反應(yīng)30分鐘～120分鐘；其中，所述硫酸軟骨素與所述多臂聚乙二醇的質(zhì)量比為(10:1)～(1:10)。

優(yōu)選地，所述多臂聚乙二醇為四臂聚乙二醇胺和/或八臂聚乙二醇胺。

進(jìn)一步地，所述硫酸軟骨素的相對分子質(zhì)量為2000～20000，所述多臂聚乙二醇的相對分子質(zhì)量為2000～20000。

進(jìn)一步地，所述酸性緩沖溶液的pH值為6.0～7.0。

進(jìn)一步地，所述酸性緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液。

進(jìn)一步地，所述熒光染色試劑為5-FAM-活化酯，且所述5-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺與所述糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的物質(zhì)的量之比為(1:900)～(1:1100)。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)原理圖以及反應(yīng)組分的分子式；

圖2是經(jīng)5-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯標(biāo)記的多臂聚乙二醇和/或多臂聚氧乙烯胺交聯(lián)肝素水凝膠包裹胰島的組織切片顯微圖片；

圖3是經(jīng)5-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯標(biāo)記的多臂聚乙二醇和/或多臂聚氧乙烯胺交聯(lián)肝素水凝膠包裹胰島在體外培養(yǎng)過程中，使用倒置熒光顯微鏡觀察到的圖像；

圖4為胰島經(jīng)不同肝素濃度復(fù)合的水凝膠(肝素濃度分別為3mg/mL、7.5mg/mL、15mg/mL)在體外培養(yǎng)過程中的壞死及凋亡情況統(tǒng)計(jì)；

圖5表明包裹水凝膠的胰島與胰腺內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后倒置熒光顯微鏡下的圖片(圖中亮點(diǎn)為CSFE熒光標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，白色虛線圈指示胰島位置)；

圖6表明包裹水凝膠的胰島相對于未包裹水凝膠的胰島，高濃度葡萄糖刺激后胰島素分泌能力對照圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

根據(jù)本發(fā)明的基于糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法，包括如下步驟：

S101：將糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠溶解于酸性緩沖溶液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％～50％的溶液后，去除所述溶液中的氧氣，然后依次向所述溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，去除氧氣后活化15分鐘～45分鐘，以得到活化后的溶液，其中，所述糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠與所述N-羥基丁二酰亞胺的物質(zhì)的量之比為(10:1)～(1:10)；所述糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠與所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺的物質(zhì)的量之比為(1:1)～(1:10)。糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠可以為肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素以及透明質(zhì)酸等糖胺聚糖類的細(xì)胞外基質(zhì)仿生水凝膠，其均為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)用材料，并且能比較全面的模擬胰島細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境。優(yōu)選地，酸性緩沖溶液的pH值為6.0～7.0，優(yōu)選地，酸性緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液。

S102：將多臂聚氧乙烯胺和/或多臂聚乙二醇胺溶解于水中并去除氧氣，然后加入到所述活化后的溶液中，室溫下反應(yīng)30分鐘～120分鐘。多臂聚乙二醇胺、多臂聚氧乙烯胺均為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)用材料。利用糖胺聚糖靜電作用力以及預(yù)先設(shè)下的N-羥基琥珀酰亞胺活化酯殘基，通過層層自組裝的物理方法，成功將胰島細(xì)胞團(tuán)包裹在凝膠中，如圖1所示。優(yōu)選地，采用多臂聚氧乙烯胺與肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸接枝，肝素與多臂聚氧乙烯胺的質(zhì)量比為(10:1)～(1:10)；進(jìn)一步地，多臂聚氧乙烯胺為四臂聚氧乙烯胺和/或八臂聚氧乙烯胺；進(jìn)一步地，肝素的相對分子質(zhì)量為8000～14000，多臂聚氧乙烯胺的相對分子質(zhì)量為2000～20000。優(yōu)選地，采用多臂聚乙二醇與肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸接枝，硫酸軟骨素與多臂聚乙二醇的質(zhì)量比為(10:1)～(1:10)；進(jìn)一步地，多臂聚乙二醇為四臂聚乙二醇和/或八臂聚乙二醇；進(jìn)一步地，肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的相對分子質(zhì)量為8000～14000，多臂聚乙二醇的相對分子質(zhì)量為2000～20000。

S103：向所述步驟S102處理過的溶液中加入熒光染色試劑，避光反應(yīng)25分鐘～35分鐘。通過在凝膠本體連接小分子熒光基團(tuán)，再次證明凝膠與胰島的結(jié)合。其中，熒光染色試劑可以為5-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯或6-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯等可以與糖類物質(zhì)通過酰胺鍵連接的熒光染色試劑。優(yōu)選地，熒光染色試劑為5-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯，且5-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯與糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的物質(zhì)的量之比約為(1:900)～(1:1100)。

S104：將所述步驟S103處理過的溶液冷凍干燥，以得到胰島培養(yǎng)支架。

下面通過具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。

實(shí)施例一

實(shí)施例一是采用肝素作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：將相對分子質(zhì)量為8000～14000的肝素溶解于pH為6.0～7.0的Tris-HCl緩沖溶液中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％～50％的溶液，低溫超聲溶解并除去反應(yīng)器中的氧氣，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，按照物質(zhì)的量比為肝素：N-羥基丁二酰亞胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺為1:1:2的比例投放原料，除氧，低溫活化15分鐘～45分鐘。

步驟二：將相對分子質(zhì)量2000～20000的四臂和/或八臂聚氧乙烯胺溶解于雙蒸水中，低溫脫氣后加入到步驟一的溶液中，控制肝素與多臂聚氧乙烯胺的質(zhì)量比為(10:1)～(1:10)，室溫反應(yīng)30分鐘～120分鐘。

步驟三：將5-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯綠色熒光分子按照與肝素物質(zhì)的量比以(1:900)～(1:1100)加入步驟二的溶液中，避光反應(yīng)30分鐘，如圖2所示，可以看到經(jīng)包裹得胰島經(jīng)冰凍固定及切片處理后，在共聚焦顯微鏡下可發(fā)出FAM熒光，且胰島形態(tài)完好。

步驟四：將上述溶液倒入細(xì)胞培養(yǎng)板并冷凍干燥，得到胰島培養(yǎng)支架。

試驗(yàn)方法：通過膽管灌注膠原酶的方法，經(jīng)Histopaque分離獲取取成年雄性ICR小鼠胰島，進(jìn)行材料包裹后在體外培養(yǎng)環(huán)境中體外培養(yǎng)14天后，使用死活熒光染色試劑盒對包裹組胰島及未包裹的對照組胰島進(jìn)行染色。同時(shí)對包裹組及對照組胰島固定、包埋后進(jìn)行冰凍切片染色，以證實(shí)材料對胰島的包裹程度。如圖3所示，可以看到經(jīng)包裹得胰島可發(fā)出FAM熒光，且胰島形態(tài)完好，表明水凝膠包裹胰島作為體內(nèi)成像示蹤探針的可行性，同時(shí)也說明該水凝膠對胰島無明顯毒副作用。從圖5中可以明顯看出，肝素包裹的胰島周圍內(nèi)皮細(xì)胞顯著多于未包裹對照組。而且隨著時(shí)間的推移，肝素包裹胰島周圍的內(nèi)皮細(xì)胞也逐漸增多，相反，未包裹的胰島周圍內(nèi)皮細(xì)胞相對減少，表明肝素水凝膠在促進(jìn)胰島內(nèi)皮化、血管化方面的積極作用。在對包裹組及對照組胰島培養(yǎng)過程中的第14天進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)，即在兩組胰島中加入20毫摩爾每升的高濃度葡萄糖溶液，觀察胰島在高糖刺激下胰島素釋放的能力，用于評價(jià)胰島功能及活力。如圖4所示，水凝膠包裹組的胰島細(xì)胞活力顯著優(yōu)于未包裹對照組胰島，PI陽性死細(xì)胞數(shù)量也明顯低于對照組。且水凝膠在保存胰島細(xì)胞活力，阻礙胰島細(xì)胞凋亡的作用隨著肝素濃度的增加增強(qiáng)。

試驗(yàn)結(jié)果：

1)通過死活染色的方法發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞在該仿生合成凝膠中14天后存活率接近100％，大大超過已有商業(yè)化的培養(yǎng)支架。

2)與胰腺內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)過程中胰島細(xì)胞呈現(xiàn)周圍血管化組織，顯著優(yōu)于對照組，表明包裹并釋放肝素的胰島在培養(yǎng)環(huán)境中更易于血管化。

3)如圖6所示，包裹水凝膠的胰島相對于未包裹水凝膠的胰島，高濃度葡萄糖刺激后胰島素分泌能力也優(yōu)于對照組，指示水凝膠包裹的胰島可最大程度保存胰島功能。胰島素釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞釋放胰島素功能增強(qiáng)，胰島功能明顯優(yōu)于對照組。

與現(xiàn)有包裹胰島進(jìn)行胰島移植的海藻酸鈉相比，本實(shí)施例中使用的材料為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證，并可結(jié)合肝素等具有生物活性的因子，促進(jìn)移植后胰島在體內(nèi)的血管化，改善胰島移植后胰島的功能及存活性；胰島移植使用的現(xiàn)有材料海藻酸鈉在制備過程中，由于制備條件及原材料差異，批次間有較大差異，對胰島移植術(shù)后胰島及接受胰島移植患者體內(nèi)條件均有不同程度的影響。而該水凝膠具有良好的生物相容性，并可批量化生產(chǎn)，且化學(xué)/生物性狀穩(wěn)定，更適用于臨床應(yīng)用。該水凝膠與細(xì)胞外基質(zhì)成分類似，仿生效果大大優(yōu)于現(xiàn)有胰島移植材料。

實(shí)施例二

實(shí)施例二是采用硫酸軟骨素作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：將相對分子質(zhì)量為8000～14000的硫酸軟骨素溶解于pH為6.0～7.0的Tris-HCl緩沖溶液中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％～50％的溶液，低溫超聲溶解并除去反應(yīng)器中的氧氣，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，按照物質(zhì)的量比為肝素：N-羥基丁二酰亞胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺為1:1:2的比例投放原料，除氧，低溫活化15分鐘～45分鐘。

步驟二：將相對分子質(zhì)量2000～20000的四臂和/或八臂聚乙二醇胺溶解于雙蒸水中，低溫脫氣后加入到步驟一的溶液中，控制硫酸軟骨素與多臂聚乙二醇的質(zhì)量比為(10:1)～(1:10)，室溫反應(yīng)30分鐘～120分鐘。

步驟三：將6-FAM-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯綠色熒光分子按照與肝素物質(zhì)的量比以(1:900)～(1:1100)加入步驟二的溶液中，避光反應(yīng)35分鐘。

步驟四：將上述溶液倒入細(xì)胞培養(yǎng)板并冷凍干燥，得到胰島培養(yǎng)支架。

試驗(yàn)方法：通過膽管灌注膠原酶的方法，經(jīng)Histopaque分離獲取取成年雄性ICR小鼠胰島，進(jìn)行材料包裹后在體外培養(yǎng)環(huán)境中體外培養(yǎng)14天后，使用死活熒光染色試劑盒對包裹組胰島及未包裹的對照組胰島進(jìn)行染色。同時(shí)對包裹組及對照組胰島固定、包埋后進(jìn)行冰凍切片染色，以證實(shí)材料對胰島的包裹程度。在對包裹組及對照組胰島培養(yǎng)過程中的第14天進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)，及在兩組胰島中加入20毫摩爾每升的高濃度葡萄糖溶液，觀察胰島在高糖刺激下胰島素釋放的能力，用于評價(jià)胰島功能及活力。

試驗(yàn)結(jié)果：

1)通過死活染色的方法發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞在該仿生合成凝膠中14天后存活率接近100％，大大超過已有商業(yè)化的培養(yǎng)支架。

2)與胰腺內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)過程中胰島細(xì)胞呈現(xiàn)周圍血管化組織，顯著優(yōu)于對照組，表明包裹并釋放肝素的胰島在培養(yǎng)環(huán)境中更易于血管化。

3)胰島素釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞釋放胰島素功能增強(qiáng)，胰島功能明顯優(yōu)于對照組。

與現(xiàn)有包裹胰島進(jìn)行胰島移植的海藻酸鈉相比，本實(shí)施例中使用的材料為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證，并可結(jié)合硫酸軟骨素等具有生物活性的因子，促進(jìn)移植后胰島在體內(nèi)的血管化，改善胰島移植后胰島的功能及存活性；胰島移植使用的現(xiàn)有材料海藻酸鈉在制備過程中，由于制備條件及原材料差異，批次間有較大差異，對胰島移植術(shù)后胰島及接受胰島移植患者體內(nèi)條件均有不同程度的影響。而該水凝膠具有良好的生物相容性，并可批量化生產(chǎn)，且化學(xué)/生物性狀穩(wěn)定，更適用于臨床應(yīng)用。該水凝膠與細(xì)胞外基質(zhì)成分類似，仿生效果大大優(yōu)于現(xiàn)有胰島移植材料。

實(shí)施例三

實(shí)施例三是采用透明質(zhì)酸作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：將相對分子質(zhì)量為8000～14000的透明質(zhì)酸溶解于pH為6.0～7.0的Tris-HCl緩沖溶液中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％～50％的溶液，低溫超聲溶解并除去反應(yīng)器中的氧氣，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基丁二酰亞胺，按照物質(zhì)的量比為肝素：N-羥基丁二酰亞胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺為1:1:2的比例投放原料，除氧，低溫活化15分鐘～45分鐘。

步驟二：將相對分子質(zhì)量2000～20000的四臂和/或八臂聚乙二醇胺溶解于雙蒸水中，低溫脫氣后加入到步驟一的溶液中，控制透明質(zhì)酸與多臂聚乙二醇胺的質(zhì)量比為(10:1)～(1:10)，室溫反應(yīng)30分鐘～120分鐘。

步驟三：將AF488-N-羥基琥珀酰亞胺活化酯綠色熒光分子按照與肝素物質(zhì)的量比以(1:900)～(1:1100)加入步驟二的溶液中，避光反應(yīng)30分鐘。

步驟四：將上述溶液倒入細(xì)胞培養(yǎng)板并冷凍干燥，得到胰島培養(yǎng)支架。

試驗(yàn)方法：通過膽管灌注膠原酶的方法，經(jīng)Histopaque分離獲取成年雄性ICR小鼠胰島，進(jìn)行材料包裹后在體外培養(yǎng)環(huán)境中體外培養(yǎng)14天后，使用死活熒光染色試劑盒對包裹組胰島及未包裹的對照組胰島進(jìn)行染色。同時(shí)對包裹組及對照組胰島固定、包埋后進(jìn)行冰凍切片染色，以證實(shí)材料對胰島的包裹程度。在對包裹組及對照組胰島培養(yǎng)過程中的第14天進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)，即在兩組胰島中加入20毫摩爾每升的高濃度葡萄糖溶液，觀察胰島在高糖刺激下胰島素釋放的能力，用于評價(jià)胰島功能及活力。

試驗(yàn)結(jié)果：

1)通過死活染色的方法發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞在該仿生合成凝膠中14天后存活率接近100％，大大超過已有商業(yè)化的培養(yǎng)支架。

2)與胰腺內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)過程中胰島細(xì)胞呈現(xiàn)周圍血管化組織，顯著優(yōu)于對照組，表明包裹并釋放肝素的胰島在培養(yǎng)環(huán)境中更易于血管化。

3)胰島素釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島細(xì)胞釋放胰島素功能增強(qiáng)，胰島功能明顯優(yōu)于對照組。

與現(xiàn)有包裹胰島進(jìn)行胰島移植的海藻酸鈉相比，本實(shí)施例中使用的材料為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證，并可結(jié)合肝素等具有生物活性的因子，促進(jìn)移植后胰島在體內(nèi)的血管化，改善胰島移植后胰島的功能及存活性；胰島移植使用的現(xiàn)有材料海藻酸鈉在制備過程中，由于制備條件及原材料差異，批次間有較大差異，對胰島移植術(shù)后胰島及接受胰島移植患者體內(nèi)條件均有不同程度的影響。而該水凝膠具有良好的生物相容性，并可批量化生產(chǎn)，且化學(xué)/生物性狀穩(wěn)定，更適用于臨床應(yīng)用。該水凝膠與細(xì)胞外基質(zhì)成分類似，仿生效果大大優(yōu)于現(xiàn)有胰島移植材料。

綜上，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的基于糖胺聚糖仿生細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠作為胰島培養(yǎng)支架的制備方法，采用多臂聚乙二醇和/或多臂聚氧乙烯胺交聯(lián)肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素以及透明質(zhì)酸等糖胺聚糖類的細(xì)胞外基質(zhì)仿生水凝膠，糖胺聚糖類的細(xì)胞外基質(zhì)仿生水凝膠的生物相容性很好，多臂聚乙二醇胺、多臂聚氧乙烯胺以及糖胺聚糖類的細(xì)胞外基質(zhì)仿生水凝膠均為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經(jīng)認(rèn)證的醫(yī)用材料，并且能比較全面的模擬胰島細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境。利用糖胺聚糖靜電作用力以及預(yù)先設(shè)下的N-羥基琥珀酰亞胺活化酯殘基，通過層層自組裝的物理方法，成功將胰島細(xì)胞團(tuán)包裹在凝膠中，通過在凝膠本體連接小分子熒光基團(tuán)，再次證明凝膠與胰島的結(jié)合。本發(fā)明操作簡便易行，反應(yīng)條件溫和，易于工業(yè)化，且化學(xué)/生物性狀穩(wěn)定，也適用于臨床應(yīng)用。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。