本發(fā)明涉及制備用于軟骨損傷修復的組合物的方法。
背景技術：
關節(jié)軟骨(articular cartilage，AC)損傷是骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)發(fā)生的一個主要危險因素，OA是不可逆的，當病情發(fā)展到晚期時要通過關節(jié)置換來減輕痛苦和恢復功能。由于關節(jié)軟骨的修復能力是有限的，必須早期干預以防止發(fā)展成為OA。當前的治療方式旨在通過主要治療、鄰近組織刺激和移植來修復關節(jié)軟骨。通過合理的修復治療可以在短期到中期獲得較理想的結果，但較長一段時間后，容易復發(fā)。近年來，基于生物工程組織的細胞水平的組織工程技術得到廣泛的研究，這種生物工程組織可以重現(xiàn)透明軟骨的特性，并與原來的組織融為一體，對于修復關節(jié)軟骨損傷意義重大。
然而，目前的生物工程組織修復軟骨損傷方面的研究仍有待加強。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種方便獲得、安全可靠，能夠有效修復軟骨損傷的手段。
需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
目前應用較廣泛的細胞水平的軟骨修復技術之一是自體軟骨細胞移植(Autologous chondrocyte implantation，ACI)技術。該技術包含體內(nèi)手術治療和體外細胞培養(yǎng)技術：首先，在受損關節(jié)的非承重區(qū)域進行手術獲取軟骨切片，并將其轉移到可儲存及運輸?shù)臒o菌營養(yǎng)液中；然后，在細胞培養(yǎng)室中使用膠原酶消化軟骨組織，得到軟骨細胞，采用單層培養(yǎng)將軟骨細胞培養(yǎng)擴增至可用于移植的數(shù)量，由外科醫(yī)生來進行軟骨缺陷的填充。在該手術過程中，將體外擴增的軟骨細胞注射到缺陷處。為了使軟骨細胞停留在移植部位，防止大量漂走，可以進一步將滑膜瓣縫合在損傷部位。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，自體軟骨細胞移植存在以下缺陷：1、自體軟骨細胞移植需要兩次侵入性手術，對病人傷害較大。2、軟骨細胞在體外單層擴增期間，這些細胞群失去了它的表型，膠原蛋白的生產(chǎn)由II型(典型的透明軟骨)向I型和III型(典型的纖維軟骨)的轉變。這些表型的改變的結果是具有較差的生物機械性能的細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。3、供體部位提供大量的軟骨細胞的能力有限。4、供體部分的發(fā)病率也是自體軟骨細胞的主要障礙。
而自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植也是目前應用較廣泛的細胞水平的軟骨修復技術。該技術在病人的髂骨進行骨髓穿刺，收集骨髓；將樣品轉移至潔凈室進行細胞分離；向骨髓穿刺液中添加磷酸鹽緩沖液，然后轉移至淋巴細胞分離液中，離心并收集單個核細胞并計數(shù)，用PBS洗滌，然后接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以便將所得細胞擴增培養(yǎng)，傳到第二代準備移植；移植前采用集落形成單位(Colony-forming unit,CFU)以及流式細胞術檢測細胞的克隆形成能力以及細胞表面標記的表達；然后，將第二代的MSCs用胰酶消化下來，并重懸于生理血清中，并裝載到無菌注射器中，透視下，將細胞注射到病人的膝蓋損傷處。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植存在以下缺陷：1、骨髓穿刺給病人帶來痛苦。2、細胞直接注射到損傷處，沒有做其他措施，細胞可能會大量漂走。3、短中期效果理想，但長時間之后病人的損傷處疼痛有所上升，行動能力也有所下降。
而間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是一種很有前景的策略，因為MSCs具有高增殖能力并且具有分化為軟骨細胞的潛能，進而形成軟骨。MSCs是梭形細胞，具有快速增殖和自我更新能力，存在于大量組織中，包括骨髓、滑膜組織、血液、脂肪組織和骨膜組織。它們具有多系分化潛能，可以分化為多種細胞類型以創(chuàng)建和修復間充質(zhì)組織。MSCs可以向成軟骨、成骨、脂肪發(fā)生途徑分化。調(diào)節(jié)因子可以促進MSC的軟骨發(fā)生，例如轉化生長因子(TGF-β)和地塞米松，這已經(jīng)用簡單的體外模型得到了證實。
進而，發(fā)明人通過一系列研究發(fā)現(xiàn)，采用臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(Umbilical Cord Mesenchymal stem cells,UCMSC)移植到病人的膝關節(jié)損傷處，能夠有效治療軟骨損傷。并且，目前已有成熟的UCMSC分離培養(yǎng)方法，并且臍帶易獲取，不需要對病人采取侵入性手術，也不需要在其它位置提取軟骨，能夠有效減少病人的痛苦。且MSC能夠快速增殖和自我更新，具有成軟骨分化的潛能，能夠保證新生軟骨細胞的活力，并且不存在發(fā)病率的隱患。
進一步，發(fā)明人在移植前，對部分UCMSC進行成軟骨誘導分化，以促進UCMSC向軟骨方向分化，并將UCMSC和誘導的軟骨細胞與透明質(zhì)酸(HA)以及溫敏型水凝膠復合，結果能夠有效防止細胞大面積遷移，達到長期治療的效果。其中，溫敏型聚乳酸水凝膠在37℃以下為液體，在達到37℃后將形成凝膠，起著外源性細胞載體的作用，可以促進細胞的移動、黏附、增殖及分化，并提供結構支持，使得細胞在缺損處活動，不會大面積移動。
因而，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種制備用于軟骨損傷修復的組合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：(1)將間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞混合并重懸于透明質(zhì)酸溶液中，以便獲得細胞懸液；以及(2)將所述細胞懸液與溫敏型水凝膠進行混合，以便得到所述用于軟骨損傷修復的組合物。
發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該方法操作方便、易于實施，獲得的用于軟骨損傷修復的組合物安全可靠，向軟骨細胞分化的效率高，能夠為軟骨損傷部位提供組織修復所必需的細胞，而溫敏型水凝膠具有很好的外源性細胞載體的作用，能夠使組合物中的細胞充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移，從而能夠有效促進軟骨損傷部位快速、有效地修復及愈合。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，在所述細胞懸液中，所述間充質(zhì)干細胞和所述軟骨細胞的混合比例為1:1～4:1。由此，制備獲得的用于軟骨損傷修復的組合物向軟骨細胞分化的效率高，能夠為軟骨損傷部位提供組織修復所必需的細胞。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，在所述細胞懸液中，透明質(zhì)酸的含量為5～30mg/ml。由此，制備獲得的用于軟骨損傷修復的組合物中，細胞混合物與透明質(zhì)酸以及溫敏型水凝膠的復合效果好，能夠有效防止細胞大面積遷移，從而可以達到長期治療的效果。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細胞懸液和所述溫敏型水凝膠的體積比為1:1～2。由此，制備獲得的用于軟骨損傷修復的組合物中，溫敏型水凝膠對細胞懸液中的間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞混合物的承載效果好，進而能夠使組合物中的細胞充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移，從而能夠有效促進軟骨損傷部位快速、有效地修復及愈合。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述溫敏型水凝膠為溫敏型聚乳酸水凝膠。由此，能夠有效承載間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞混合物，并使其充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述溫敏型聚乳酸水凝膠為MPEG-PLGA。由此，其作為外源性細胞載體的作用好，能夠使獲得的組合物中的細胞充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移，從而能夠有效促進軟骨損傷部位快速、有效地修復及愈合。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述間充質(zhì)干細胞為臍帶間充質(zhì)干細胞。由此，間充質(zhì)干細胞來源廣泛，易獲得，安全無害，且向軟骨分化的效率高。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述軟骨細胞是通過間充質(zhì)干細胞優(yōu)選臍帶間充質(zhì)干細胞誘導獲得的。并且，軟骨細胞的誘導方法不受特別限制，只要能夠從間充質(zhì)干細胞優(yōu)選臍帶間充質(zhì)干細胞有效誘導獲得軟骨細胞即可。由此，獲得的用于軟骨損傷修復的組合物，向軟骨細胞分化的效率高，能夠為軟骨損傷部位提供組織修復所必需的細胞。
此外，還需要說明的是，本發(fā)明具有下列優(yōu)點的至少之一：
1、本發(fā)明方法，由廢棄物臍帶獲取間充質(zhì)干細胞，來源廣泛，可大量獲取，且不會對病人造成傷害。
2、本發(fā)明對部分UCMSC進行軟骨細胞方向的誘導分化，促進了UCMSC向軟骨分化的效率。
3、溫敏型水凝膠能夠起到很好的外源性細胞載體的作用，使得細胞能夠充分填充軟骨損傷處，而又不向其它地方遷移。
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1
參照本發(fā)明的方法，按照以下步驟制備用于軟骨損傷修復的組合物，并對軟骨損傷病人進行移植修復：
1、UCMSC的分離培養(yǎng)
將取到的新鮮臍帶送入GMP生產(chǎn)車間，分離得到UCMSC。將UCMSC培養(yǎng)擴增；并取出部分細胞進行成軟骨細胞誘導，得到一定數(shù)量的軟骨細胞后擴增，準備移植。
2、移植前準備
將上述得到的UCMSC與誘導分化得到的軟骨細胞，用0.25％的胰酶消化下來，并用生理鹽水洗滌，然后將UCMSC與軟骨細胞按照1:1～4:1的比例混合并重懸于透明質(zhì)酸溶液中，以便得到細胞懸液，其中細胞懸液中透明質(zhì)酸的含量為5～30mg/ml。將該細胞懸液與溫敏型聚乳酸水凝膠MPEG-PLGA以1∶1～2的體積比混合，置于搖床一段時間使其充分混勻，以便得到本發(fā)明的用于軟骨損傷修復的組合物。
然后，對本發(fā)明的用于軟骨損傷修復的組合物中的細胞取樣進行微生物、病毒五項、支原體、內(nèi)毒素以及細胞功能檢測，以確保安全性。
3、移植
采用關節(jié)腔注射法。其中，病人在接受注射前進行關節(jié)鏡檢查，確定關節(jié)損傷處的大小、厚度等，以每平方厘米5×106細胞的密度進行注射。
4、移植后效果觀察
治療后，定期采用核磁共振成像檢查膝關節(jié)功能的改善情況。
結果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的用于軟骨損傷修復的組合物中的細胞能夠充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移，軟骨損傷部位修復愈合快速、有效。
對比例1
按照實施例1的方法制備用于軟骨損傷修復的組合物，并對軟骨損傷病人進行移植修復，區(qū)別僅在于：
不對UCMSC進行軟骨誘導，即細胞懸液中的細胞全部采用UCMSC。
移植后觀察到，病人軟骨損傷部位軟骨樣組織，病人疼痛緩解，損傷有一定程度愈合。
對比例2
按照實施例1的方法制備用于軟骨損傷修復的組合物，并對軟骨損傷病人進行移植修復，區(qū)別僅在于：
細胞懸液中的UCMSC與軟骨細胞的比例為1：3。
移植后觀察到，病人軟骨損傷部位修復愈合速度慢。
對比例3
按照實施例1的方法制備用于軟骨損傷修復的組合物，并對軟骨損傷病人進行移植修復，區(qū)別僅在于：
細胞懸液與溫敏型聚乳酸水凝膠MPEG-PLGA的比例為1∶3。
移植后觀察到，病人軟骨損傷部位軟骨細胞形成效率較低，從而修復愈合速度慢。
對比例4
按照實施例1的方法制備用于軟骨損傷修復的組合物，并對軟骨損傷病人進行移植修復，區(qū)別僅在于：
細胞懸液與溫敏型聚乳酸水凝膠MPEG-PLGA的比例為1：3。
移植后觀察到，病人軟骨損傷部位軟骨細胞形成效率較低，修復愈合速度慢。
對比例5
按照實施例1的方法制備用于軟骨損傷修復的組合物，并對軟骨損傷病人進行移植修復，區(qū)別僅在于：
不采用溫敏型聚乳酸水凝膠MPEG-PLGA(即僅采用細胞懸液進行注射移植)。
移植后觀察到，組合物中的細胞大量漂走，病人軟骨損傷部位軟骨細胞形成效率較低，修復愈合速度慢。
對比例6
按照實施例1的方法制備用于軟骨損傷修復的組合物，并對軟骨損傷病人進行移植修復，區(qū)別僅在于：
采用生理鹽水替代透明質(zhì)酸溶液。
移植后觀察到，組合物中的細胞大量漂走，病人軟骨損傷部位軟骨細胞形成效率較低，修復愈合速度慢。
在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。