本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種由紫花苜蓿制備紫花苜蓿總黃酮提取物的方法。

背景技術(shù)：

紫花苜蓿，又名紫苜蓿、苜蓿、南苜蓿、金花菜、光風(fēng)草、草頭等，為豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionatae Taub)車軸草族(Trib.trifolieae Bronn)苜蓿屬(Medicaga L)的多年生草本植物，該屬約有70余種，分布于地中海區(qū)域、西南亞、中亞和非洲。紫花苜蓿在我國分布非常廣泛，產(chǎn)量高，適應(yīng)性強、營養(yǎng)極為豐富，主要在畜牧業(yè)作為飼料應(yīng)用，享有“牧草之王”的美譽，其作為良好的天然植物資源備受重視。民間作為傳統(tǒng)的草藥用于治療細(xì)菌性痢疾、肺熱咳嗽、黃疸、膀胱結(jié)石等癥，其中黃酮類化合物是主要功效成分類群。

黃酮類化合物((Flavonoids))是一類植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛分布植物中。黃酮被證實具有許多生理活性如抗氧化性，抗癌活性，肝保護作用，雌激素作用等。紫花苜蓿屬植物的黃酮類化合物成分主要有以下幾種：黃酮及其苷類、黃酮醇及其苷類、異黃酮類、異黃烷、查耳酮、二氫黃酮和二氫異黃酮等。其糖基部分大多為葡萄糖或葡萄糖醛酸，也有半乳糖和鼠李糖的報道，還有的阿魏?；蚩Х弱；?。苜蓿黃酮是苜蓿植物提取物的主要成分之一，其生物功效是多方面的，能有效去除人體自由基，具有輕度雌激素樣的作用，在一定范圍內(nèi)增加機體的繁殖力和免疫力，同時苜蓿黃酮可以作為功能性食品的添加劑，動物飼料的添加劑，因此，苜蓿黃酮提取物在食品添加劑、天然藥物、功能性食品等領(lǐng)域前景廣闊。

現(xiàn)有提取紫花苜?？傸S酮的報道尚不多見，主要側(cè)重于紫花苜蓿黃酮的含量測定。如徐文燕發(fā)表的“紫花苜蓿不同品種和不同季節(jié)黃酮量的比較研究”，該文獻(xiàn)采用苜蓿素為對照品，對不同品種的紫花苜蓿在不同采收期的黃酮量進行測定比較。文獻(xiàn)“苜蓿黃酮的分離及其生物轉(zhuǎn)化研究進展”中提及了苜蓿黃酮的分離純化方法有樹脂吸附法、溶劑萃取法及逆流色譜等手段，但未對其進行進一步具體敘述。

專利CN201110117883.0公開了一種紫花苜?？傸S酮的制備方法，該工藝步驟包括：將紫花苜蓿藥材粉碎，采用乙醇液回流提取1～3次，合并提取液經(jīng)超濾膜濾過，收集濾過液，調(diào)堿后再經(jīng)納濾膜濃縮，濃縮液調(diào)酸沉淀，濾出沉淀，用熱水分散，放冷后用石油醚萃取1～3次，除去脂溶性雜質(zhì)，萃余液蒸干，再采用乙醇回流溶解結(jié)晶，干燥即得紫花苜蓿總黃酮。但是該方法需要使用超濾膜進行過濾和濃縮，工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高，并且根據(jù)文獻(xiàn)所述的方法制得的黃酮提取物純度低，與文獻(xiàn)聲稱的結(jié)果不符。

專利CN201110135630.6涉及一種從紫花苜蓿中同時提取總皂苷和總黃酮的方法，該方法包括以下步驟：(1)將紫花苜蓿切段，加入碳酸鈉，再加入水，在80～100℃溫度下提取數(shù)次，合并濾液；(2)將濾液減壓濃縮后，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4～6，得到酸性溶液；(3)將酸性溶液放入液液連續(xù)萃取塔內(nèi)，并加入正丁醇進行萃取，得到萃取液；(4)萃取液減壓濃縮成稠膏，該稠膏經(jīng)真空減壓干燥后粉碎，過篩，即得紫花苜蓿提取物。然而該方法所用有機溶劑較多，容易對環(huán)境造成污染，并且有機溶劑容易殘留在產(chǎn)物中，不利用進一步的應(yīng)用。進一步地，該方法所得到的黃酮提取物純度低。

據(jù)研究，適時收獲的苜蓿莖葉干物質(zhì)中，黃酮含量約為0.53％，而沿用傳統(tǒng)的工藝提取苜蓿黃酮時，得率少，純化困難，研究報道所得紫花苜蓿提取物中黃酮含量僅為13.69％，限制了苜蓿黃酮在生產(chǎn)中的應(yīng)用和其功能的進一步研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的目的是提供一種由紫花苜蓿制備紫花苜?？傸S酮提取物的方法。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用醇提水沉方法，可以實現(xiàn)對紫花苜蓿中總黃酮最大程度的提取，然后通過大孔樹脂可以實現(xiàn)對黃酮類化合物的選擇性分離，并經(jīng)過濃縮、干燥處理，得到總黃酮含量大于18％的紫花苜?？傸S酮提取物。本發(fā)明提供的方法工藝簡潔，操作簡單，不需要使用太多的有機試劑，適合工業(yè)化應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

本發(fā)明提供一種由紫花苜蓿制備紫花苜?？傸S酮提取物的方法，所述方法包括以下步驟：

1)材料處理：取紫花苜蓿地上部分，去雜，烘干，粉碎，過篩，得到紫花苜蓿粉；

2)初提：將步驟1)得到的紫花苜蓿粉使用乙醇溶液熱回流，收集提取液，減壓蒸餾以回收乙醇，得到浸膏；

3)浸膏處理：將步驟2)得到的浸膏用蒸餾水進行復(fù)溶水沉，離心后取上清液，在室溫下，使用石油醚對上清液進行萃取，除去石油醚層，收集水層；

4)純化：調(diào)節(jié)步驟3)得到的水層中總黃酮的濃度和pH值，然后過大孔樹脂柱，所述大孔樹脂柱先用蒸餾水沖洗至無色，然后用體積比為50-60％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓蒸餾以回收乙醇，得到浸膏，將浸膏干燥，得到紫花苜?？傸S酮提取物。

優(yōu)選地，在所述步驟1)中：所述烘干在35℃-65℃下進行，優(yōu)選地，所述烘干在65℃下進行；優(yōu)選地，所述烘干進行12-48小時，更優(yōu)選地進行24小時；優(yōu)選地，烘干后所述紫花苜蓿中含有的水分小于6wt％；優(yōu)選地，所述篩為40目篩，更優(yōu)選地，所述40目篩的篩孔尺寸為425μm。

優(yōu)選地，所述步驟2)是通過包括下述步驟的方法進行的：

將步驟1)得到的紫花苜蓿粉使用乙醇溶液熱回流提取2-4次，得到提取液，將所述提取液合并，減壓蒸餾以回收乙醇至無醇味，得到比重為1.1～1.3的浸膏。

優(yōu)選地，在所述步驟2)中，所述乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為50％-70％；優(yōu)選地，所述紫花苜蓿粉和所述乙醇溶液的料液比為1:6-10(g：mL)，更優(yōu)選地為1:7-8(g：mL)；優(yōu)選地，所述步驟2)在60℃-80℃的溫度下提取3次，每次提取3-5小時；優(yōu)選地，所述減壓蒸餾在65℃和-0.1MPa的條件下進行。

優(yōu)選地，所述步驟3)是通過包括下述步驟的方法進行的：

在4℃下，將步驟2)得到的浸膏加入蒸餾水混合均勻，靜置10-24小時后，離心取上清液，棄沉淀；將得到的上清液濃縮至比重為1.1～1.3，然后在室溫下，按照體積比1:1-3加入石油醚萃取1-3次，收集水層。

優(yōu)選地，在所述步驟3)中，所述浸膏與蒸餾水的體積比為1:3-10，更優(yōu)選地為1:5；優(yōu)選地，所述靜置時間為12小時；優(yōu)選地，所述離心條件為在3000r/min下進行10分鐘；優(yōu)選地，在使用石油醚萃取后，收集石油醚層并回收石油醚；更優(yōu)選地，所述回收在45℃，-0.1MPa的條件下進行；優(yōu)選地，用于萃取的石油醚的溫度為30～60℃。

優(yōu)選地，所述步驟4)是通過包括下述步驟的方法進行的：

將得到的水層用3-6倍體積的蒸餾水稀釋，調(diào)節(jié)pH值為4，然后過大孔樹脂，上樣速度為2BV/h，先用2-6BV的蒸餾水沖洗至無色，然后用2-6BV的50-60％乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓蒸餾以回收乙醇，得浸膏；

將得到的浸膏減壓干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，得到紫花苜?？傸S酮提取物。

優(yōu)選地，在所述步驟4)中，所述樹脂為苯乙烯型大孔樹脂，優(yōu)選為D101、DM-130、AB-8或HPD100；優(yōu)選地，所述水洗或醇洗的速度為2BV/h；優(yōu)選地，所述減壓蒸餾在65℃和-0.1MPa的條件下進行。優(yōu)選地，所述浸膏比重為1.1～1.3。

本發(fā)明方法采用醇提水沉的方法，盡可能將苜蓿中黃酮類物質(zhì)提取出來，實現(xiàn)了對紫花苜蓿中總黃酮最大程度的提取，從而提高了粗提物中黃酮的得率，然后通過適合分離黃酮類化合物的大孔樹脂將黃酮類物質(zhì)從提取液中分離出來，并經(jīng)過濃縮、干燥處理，得到總黃酮含量大于18％的紫花苜?？傸S酮提取物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明主要具有以下優(yōu)勢：

首先，本發(fā)明的制備方法主要采用水和乙醇提取，制備方法操作簡單，產(chǎn)品含量較高，易于產(chǎn)業(yè)化，可以大大改善了紫花苜?？傸S酮的提取現(xiàn)狀；

其次，本發(fā)明的提取物的收率達(dá)到3％以上，提取物中總黃酮的含量為18％以上，極大地提高了對紫花苜蓿的利用率；

再次，實驗證明用本發(fā)明方法制備的總黃酮純度高，成本低廉，應(yīng)用前景良好。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均已標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

紫花苜蓿原料購自內(nèi)蒙古土默特左旗大青山養(yǎng)殖專業(yè)合作社；

大孔樹脂：AB-8購自天津市南開大學(xué)化工廠；

D101購自天津市南開大學(xué)化工廠；

HPD100購自天津市南開大學(xué)化工廠。

實施例1紫花苜蓿總黃酮的制備

1.將紫花苜蓿去除薄膜、柴棒等雜質(zhì)，然后在65℃下烘干24小時至水分小于6％，粉碎過40目篩，得到紫花苜蓿粉。

2.稱取上述得到的紫花苜蓿粉100g，使用體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液回流法，分別按照料液比1:8，1:8，1:7(g：mL)在80℃下提取3次，每次提取4小時，合并提取液，在65℃和-0.1MPa的條件下減壓蒸餾以回收乙醇，得到比重1.1～1.3的浸膏。

3.在步驟2中得到的浸膏中加入5倍體積的蒸餾水，混合均勻，在4℃下靜置12h，3000r/min離心10min，得上清液，棄沉淀，將上清液濃縮比重為1.1～1.3，冷卻至室溫，按照體積比1:2加入30～60℃的石油醚萃取2次。收集石油醚層，在45℃和-0.1MPa的條件下回收石油醚；收集水層。

4.將步驟3得到的水層稀釋4倍，調(diào)節(jié)pH值為4。以2BV/h速度加入裝有AB-8大孔樹脂的柱子中進行吸附。先后用4BV蒸餾水以2BV/h的流速沖洗，至洗脫液不渾濁，再用4BV的50％乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，在65℃和-0.1MPa的條件下回收乙醇，得比重1.1～1.3的浸膏，將浸膏冷凍干燥，得到總黃酮純度為25.28％的紫花苜?？傸S酮提取物干粉3.48g，得率為3.48％。

實施例2紫花苜蓿總黃酮的制備

1.使用如實施例1的紫花苜蓿粉。

2.稱取紫花苜蓿粉100g，使用50％的乙醇回流法，分別按照料液比1:6，1:8(g：mL)在60℃下提取2次，每次提取5h，合并提取液，在65℃，-0.1MPa的條件下減壓蒸餾以回收乙醇，得到比重1.1～1.3的浸膏。

3.在步驟2中得到的浸膏中加入3倍體積的蒸餾水，混合均勻，在4℃下靜置24h，3000r/min離心10min，得上清液，棄沉淀，將上清液濃縮比重為1.1～1.3，冷卻至室溫，按照體積比1:3加入30～60℃石油醚萃取3次。收集石油醚層，在45℃和-0.1MPa的條件下回收石油醚；收集水層。

4.將步驟3得到的水層稀釋5倍，調(diào)節(jié)pH值為4。以2BV/h速度加入裝有D101大孔樹脂的柱子中進行吸附。先后用2BV蒸餾水以2BV/h的流速沖洗，至洗脫液不渾濁，再用3BV的55％乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，在65℃和-0.1MPa的條件下回收乙醇，得比重1.1～1.3的浸膏，將浸膏冷凍干燥，得到總黃酮純度為23.4％的紫花苜?？傸S酮總提取物干粉3.14g，得率為3.14％。

實施例3紫花苜?？傸S酮的制備

1.使用如實施例1的紫花苜蓿粉。

2.稱取紫花苜蓿粉100g，使用50％乙醇回流法，分別按照料液比1:8，1:7，1:8，1:8(g：mL)在80℃下提取4次，每次提取3h，合并提取液，在65℃和-0.1MPa的條件下回收乙醇，得比重1.1～1.3的浸膏。

3.在步驟2中得到的浸膏中加入3倍體積的蒸餾水，混合均勻，在4℃下靜置24h，3000r/min離心10min，得上清液，棄沉淀，將上清液濃縮比重為1.1～1.3，冷卻至室溫，按照體積比1:3加入30～60℃石油醚萃取3次。收集石油醚層，在45℃和-0.1MPa的條件下回收石油醚；收集水層。

4.將步驟3得到的水層稀釋6倍，調(diào)節(jié)pH值為4。以2BV/h速度加入裝有HPD100大孔樹脂的柱子中進行吸附。先后用2BV蒸餾水以2BV/h的流速沖洗，至洗脫液不渾濁，再用5BV的60％乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，在65℃和-0.1MPa的條件下回收乙醇，得比重1.1～1.3的浸膏，將浸膏冷凍干燥，得到總黃酮純度為18.6％苜?？傸S酮提取物干粉3.28g，得率為3.28％。

對比例1：本發(fā)明的方法和現(xiàn)有技術(shù)方法的比較

分別采用CN201110117883.0、CN201210223127.0的方法以及本申請的方法的實施例1的方法提取總黃酮，并測定提取物的得率以及提取物中總黃酮的含量，測定結(jié)果如下表1。

所采用的方法如CN201110117883.0實施例1所示：

1.使用如實施例1的紫花苜蓿粉。

2.稱取上述得到的苜蓿草粉660g，采用60％乙醇液回流提取，分別按照料液比1:10，1:8，1:8提取3次，每次0.5h，合并提取液。

3.將提取液在4000r/min離心20min，棄沉淀，得上清液并過濾。

4.將濾過液加入氧化鋁陶瓷膜中超濾，截留量為20nm，進膜壓力為0.34MPa，出膜壓力為0.3MPa，收集超濾液加5％氫氧化鈉調(diào)至pH值為9。

5.將超濾液再加入分子截留量250的PVDF復(fù)合納濾膜中濃縮，進膜壓力為2500Kpa，出膜壓力為1500KPa，收集濃縮液加3％鹽酸調(diào)酸至pH值為4，沉淀。

6.濾出沉淀，用熱水溶解，放冷后用等量石油醚萃取3次，除去脂溶性雜質(zhì)，萃余液蒸干，再采用乙醇回流溶解結(jié)晶2次，干燥即得紫花苜蓿總黃酮5.224g，得率為0.79％，其中總黃酮純度為4.97％。

需要說明的是，步驟4與CN201110117883.0實施例1中的條件略有不同，是由于所選用的超濾裝置不同所致，步驟5與CN201110117883.0實施例1中的條件略有不同，是由于所選用的復(fù)合納濾膜參數(shù)不同所致，對實際結(jié)果并無顯著影響。

所采用的方法如CN201210223127.0實施例1所示：

1.將苜蓿草去除雜質(zhì)(薄膜、柴棒等)，然后在65℃下烘干24小時，粉碎過40目篩(0.425mm)得到苜蓿草粉。

2.稱取上述得到的苜蓿草粉100g，按照固液比1:25的比例加入去離子水，水溶液加熱至90-100℃，然后冷卻至30-50℃以下，用4％NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.65，沸水浴煮40min，并不斷攪拌，然后過濾；將濾渣按照1:10加沸騰的去離子水，然后攪拌、過濾，到得濾液。

3.將所述濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.22，靜置至上清液完全澄清，棄上清，過濾沉淀物，用去離子水將沉淀物沖洗至無色，得到酸沉淀物。

4.將沉淀物用60％乙醇溶解；過濾，收集濾液，減壓濃縮為稠膏1.080g。

5.將大孔樹脂用90％乙醇浸泡48h，用去離子水沖洗至無醇味，用4％鹽酸溶液

浸泡4h，用去離子水沖洗至中性，用4％NaOH浸泡4h，用去離子水沖洗至中性，在4℃的條件下保存密封備用。

6.將制備的稠膏按照4g/150mL的比例溶于60％乙醇，然后按照3:1比例加入去離子水，將pH調(diào)至5.35，按照lg/10mL的比例加入上樣液，吸附所用的大孔樹脂為：海D101。靜態(tài)吸附12h，每隔2h輕微搖動一次，使大孔樹脂充分吸附。

7.將吸附后的大孔樹脂用去離子水沖洗至無色，然后用60％乙醇將大孔樹脂進行沖洗，至沖洗液為無色，最后按照lg/10mL的比例加入90％乙醇溶液，密封，25-35℃于搖床中50轉(zhuǎn)/min，12h，將解吸液濃縮干燥，得到棕黃色苜蓿總黃酮提取物75mg，得率為0.075％，其中總黃酮純度為4.31％。

表1

從實驗結(jié)果中可以看出，采用本發(fā)明的方法提取總黃酮，提取物得率高，提取物中總黃酮純度高，從這一點來看本申請樣品質(zhì)量(即樣品有效成分含量)與對比專利相比具有顯著的優(yōu)勢。