本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術：
單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus，HSV-1)和單純皰疹病毒2型(Herpes simplex virus，HSV-2)屬于皰疹科病毒，HSV-1和HSV-2不僅引起口唇或生殖粘膜皰疹，同時也是引起腦炎、肝炎、全身嚴重感染甚至宮內感染的重要病原。
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要引起呼吸系統(tǒng)感染，在嬰幼兒、老年以及免疫缺陷人群引起嚴重肺炎，是人類上呼吸道感染的重要病原之一。
甲型流感病毒(Influenza A virus，F(xiàn)lu-A)屬于正粘科病毒，在人類和其他生物每年都有小范圍的流行，引起上呼吸系統(tǒng)感染。大流行時，可引起嚴重呼吸系統(tǒng)感染，甚者引起肺炎、腦炎甚至死亡。
上述三種病毒的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個2009年發(fā)表(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物，并對該組合物抗病毒活性進行了評價，其具有抗病毒活性。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質量百分數(shù)分別為15％和85％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
藥效學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗病毒作用。本發(fā)明的藥學上可接受的鹽具有同樣的藥效。
組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A 的活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗病毒藥物。
以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。
具體實施方式
實施例1 化合物Harrisotone A的制備
化合物Harrisotone A(I)的制備方法參照Sheng Yin等人發(fā)表的文獻(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的方法。
實施例2 Harrisotone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(472mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌3h。3h之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌2次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(602mg，76％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.18(s,2H),4.56(s,2H),3.93(d,J＝16.7Hz,4H),3.79(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,4H),3.15(s,2H),2.48(s,2H),2.41(d,J＝9.4 Hz,4H),2.27(s,1H),1.95(s,1H),1.88–1.80(m,8H),1.77(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.25(d,J＝58.1Hz,1H),1.15–0.75(m,6H). 13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.24(s),195.44(s),190.27(s),135.27(s),120.09(s),115.02(s),84.45(s),76.58(s),74.12(s),63.67(s),62.76(s),60.36(s),50.96(s),45.22(s),39.69(s),36.61(s),34.40(s),32.63(s),30.81(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.30(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.77(s),18.20(s).
HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C34H50Br3O6:793.1137；found 793.1134.
實施例3 Harrisotone A的O-(二乙氨基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙胺(2920mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應結束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的淡黃色固體(246.1mg,64％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.13(s,2H),4.19(s,2H),3.52(d,J＝5.3Hz,4H),3.21(s,2H),3.04(s,2H),2.85(s,12H),2.64(d,J＝13.5Hz,4H),2.33(s,3H),2.18(s,1H),2.11(s,2H),2.04(s,1H),1.98(s,1H),1.88(s,1H),1.77(d,J＝5.0Hz,7H),1.70(d,J＝15.5Hz,7H),1.61(s,1H),1.54(s,1H),1.44(s,1H),1.37(s,1H),1.10(s,24H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.18(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.15(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),52.53(s),51.93(s),50.76(s),47.69(s),45.04(s),39.51(s),36.43(s),30.63(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.57(s),18.04(s),12.27(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H80N3O6:770.6047；found:770.6044。
實施例4 Harrisotone A的O-(哌嗪基)乙基衍生物的合成
將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于16mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和無水哌嗪(6892mg，80mmol)，混合物加熱回流1h。反應結束后將反應液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集淡棕色集中洗脫帶即得到化合物IV的淡棕色固體(286.9mg,71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.14(s,2H),4.21(s,2H),3.53(d,J＝6.2Hz,4H),3.09(s,2H),3.05(s,2H),2.66(s,12H),2.57–2.53(m,4H),2.33(d,J＝15.0Hz,15H),2.24(s,1H),2.14(s,2H),2.10(s,1H),2.00(s,1H),1.88(d,J＝10.5Hz,3H),1.79(d,J＝5.0Hz,7H),1.71(d,J＝15.5Hz,7H),1.63(s,1H),1.55(s,1H),1.46(s,1H),1.15–1.05(m,8H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.28(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.25(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),54.35(s),54.16(s),53.66(s),50.78(s),45.24(s),45.06(s),39.49(s),36.45(s),30.61(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.58(s),18.04(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H77N6O6:809.5905；found:809.5901。
實施例5 組合物抗病毒活性
(一)實驗例：組合物對皰疹病毒的作用研究：
(1)細胞株與病毒株：
人胚腎細胞(HEK293，為HSV-1、HSV-2病毒敏感細胞)購自美國Clontech公司；單純皰疹病毒1型(HSV-1)Sm44株、單純皰癥病毒2型(HSV-2)333株引自中國CDC病毒病研究所。
(2)細胞毒性測定：
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的15mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的85mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將各樣品以 2倍比做系列稀釋(20～-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復3孔(A、B、C行)，平行設微孔板D的1～6孔為細胞對照，7～12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞對照組OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD50)。
(3)抑毒試驗：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序(2-3～-14)橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設F行作為病毒對照，E行的1～12作為細胞對照。37℃、5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
(4)結果：
①樣品TD50的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化合物III和化合物IV的TD50在HEK293分別為2-2.24、2-2.13、2-2.78。
②抑毒實驗：對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSV-1、HSV-2病毒對照組分別在第3d、3d出現(xiàn)90％以上的CPE，HSV 1和HSV 2在HEK293CPE則以腫脹、多細胞融合(HSV 1致多個細胞融和成大泡，而HSV 2致融合為小泡)、變圓、脫落為主要特征。
而組合物抑毒試驗各組細胞，按照組合物樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE：HSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第9稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-3～-6濃度范圍內才觀察到抑制病毒的效應。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病 毒對照組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得組合物的TI：抑制HSV-1、HSV-2在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC50分別為2-11.16、2-11.52，TI分別為484.4、694.6。化合物III的TI：對應的IC50分別為2-3.77、2-4.86，TI分別為3.1、6.6?；衔颕V的TI：對應的IC50分別為2-4.92、2-4.75，TI分別為4.4、3.9。
結論：組合物具有顯著的抗皰疹科病毒(包括HSV-1、HEV-2)的作用，而且安全性高，因此組合物在治療皰疹病毒感染疾病中具有廣泛的應用背景?；衔颕II和化合物IV不具有顯著的抗皰疹科病毒(包括HSV-1、HEV-2)的作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療皰疹病毒感染疾病中沒有應用背景。
(二)實驗例：組合物對呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
(1)組合物、化合物III和化合物IV的配置：將藥物溶于細胞維持液(含2％新生牛血清的MEM，GIBICO公司產品)中備用。
(2)細胞株與病毒株：
人胚腎細胞(HEK293，RSV病毒敏感細胞)購自美國Clontech公司；呼吸道合胞病毒(RSV)Long株引自中國CDC病毒病研究所。
(3)細胞毒性測定：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品以2倍比做系列稀釋(20～-6)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復3孔(A、B、C行)，平行設微孔板D的1～6孔為細胞對照，7～12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞對照組OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD50)。
(4)抑毒試驗：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序(2-2～-13)橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設F行作為病毒對照，E行的1～12作為細胞對照。37℃、5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
(5)結果：
①樣品TD50的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化合物III和化合物IV對HEK293的TD50分別為2-2.07、2-2.18、2-2.29。
②抑毒實驗：對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RSV病毒對照組在第2d出現(xiàn)90％以上的CPE，RSV在HEK293CPE以折光性增強、變圓、脫落、破碎為主要特征。
而組合物抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE：
RSV-HEK293試驗組細胞在第9稀釋度之前，細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-3～-6濃度范圍內才觀察到抑制病毒的效應。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得TI：組合物抑制RSV在HEK293細胞發(fā)生CPE，IC50為2-11.36，TI為626.0；化合物III的IC50為2-4.28，TI為4.3；化合物IV的IC50為2-4.16，TI為3.7。
結論：組合物具有顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可以用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物?；衔颕II和化合物IV無顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，不可以用來制備抗副粘科病毒呼吸 道合胞病毒RSV藥物。
(三)實驗例：組合物對甲型流感病毒的作用研究：
(1)細胞株與病毒株：狗腎細胞(MDCK，流感病毒敏感細胞)引自中國CDC病毒病研究所；流感病毒甲型(Flu A)1995.AII：32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。
(2)細胞毒性測定：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋(2-1～-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復3孔(A、B、C行)，平行設微孔板D的1～6孔為細胞對照，7～12孔不接種細胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細胞對照組OD值相比計算細胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細胞中毒濃度(TD50)。
(3)抑毒試驗：
參照文獻(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學學報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96板孔中的單層細胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL作為試驗組，D行補充等容量細胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設F行作為病毒對照，E行的1～12作為細胞對照。37℃、5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細胞對照組A值相比，獲得細胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
(4)結果：
①樣品TD50的測定：對照組細胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。 組合物、化合物III和化合物IV對的TD50在MDCK分別為2-2.31、2-2.24、2-2.15。
②抑毒實驗：對照組細胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lu A在MDCK CPE以折光性增強、壞死、破碎為主要特征。
而組合物抑毒試驗各組細胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE：FluA-MDCK組細胞在第8稀釋度之前細胞完全被保護，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-3～-6濃度范圍內才觀察到抑制病毒的效應。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對照組A值后，各實驗組A值與細胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得TI：組合物抑制Flu A在MDCK細胞發(fā)生CPE，IC50為2-11.77，TI為704.3；化合物III的IC50為2-4.89，TI為6.3；化合物IV的IC50為2-4.12，TI為3.9。
結論：組合物對甲型流感病毒具有很強的抑制作用，而且安全，因此組合物在治療甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應用背景?；衔颕II和化合物IV對甲型流感病毒沒有顯著的抑制作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療甲型流感病毒感染疾病中沒有應用背景。
實施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
實施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。