本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動(dòng)態(tài)過程，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量合成、分泌，而降解絕對(duì)或相對(duì)不足，使ECM在肝臟內(nèi)彌漫沉積。其起始于肝細(xì)胞(HC)壞死，隨之是炎癥反應(yīng)、纖維生成介質(zhì)釋放，肝星狀細(xì)胞(FSC)激活，最終以肝臟結(jié)締組織成分的合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預(yù)后的重要因素。

過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長足進(jìn)展，證實(shí)肝纖維化與一定程度的肝硬化都是可逆的。近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學(xué)藥、生物制劑、中藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏(劉平.加強(qiáng)抗肝纖維化作用機(jī)制的研究.中華肝病雜志，2005,8(13)：561)。目前防治肝纖維的關(guān)鍵是針對(duì)與肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)的環(huán)節(jié)，主要是：減輕肝損傷；抑制星狀細(xì)胞激活，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生；調(diào)節(jié)細(xì)胞因子紊亂，促進(jìn)活化肝星狀細(xì)胞凋亡；抑制肝臟成纖維細(xì)胞的增殖以及星狀細(xì)胞激活大量分泌誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的增殖。

從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。

本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2009年發(fā)表(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的化合物，我們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗肝纖維化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗肝纖維化活性。

由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子會(huì)誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為65％和35％。

本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽具有同樣的藥效。

進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗成纖維細(xì)胞增殖的活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。

進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的活性，組合物是一個(gè)極具開發(fā)潛力的化合物,它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 化合物Harrisotone A的制備

化合物Harrisotone A(I)的制備方法參照Sheng Yin等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Sheng Yin et al.,2009.Harrisotones A–E,five novel prenylated polyketides with a rare spirocyclic skeleton from Harrisonia perforata.Tetrahedron 65(2009)1147–1152)的方法。

實(shí)施例2 Harrisotone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(472mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌3h。3h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌2次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(602mg，76％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ5.18(s,2H),4.56(s,2H),3.93(d,J＝16.7Hz,4H),3.79(s,2H),3.62(d,J＝0.9Hz,4H),3.15(s,2H),2.48(s,2H),2.41(d,J＝9.4Hz,4H),2.27(s,1H),1.95(s,1H),1.88–1.80(m,8H),1.77(d,J＝15.5Hz,7H),1.68(s,1H),1.61(s,1H),1.51(s,1H),1.25(d,J＝58.1Hz,1H),1.15–0.75(m,6H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.46(s),198.24(s),195.44(s),190.27(s),135.27(s),120.09(s),115.02(s),84.45(s),76.58(s),74.12(s),63.67(s),62.76(s),60.36(s),50.96(s),45.22(s),39.69(s),36.61(s),34.40(s),32.63(s),30.81(d,J＝8.9Hz),28.77(s),25.30(s),24.09(d,J＝19.2Hz),22.77(s),18.20(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₄H₅₀Br₃O₆:793.1137；found 793.1134.

實(shí)施例3 Harrisotone A的O-(二乙氨基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和二乙胺(2920mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的淡黃色固體(246.1mg,64％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.13(s,2H),4.19(s,2H),3.52(d,J＝5.3Hz,4H),3.21(s,2H),3.04(s,2H),2.85(s,12H),2.64(d,J＝13.5Hz,4H),2.33(s,3H),2.18(s,1H),2.11(s,2H),2.04(s,1H),1.98(s,1H),1.88(s,1H),1.77(d,J＝5.0Hz,7H),1.70(d,J＝15.5Hz,7H),1.61(s,1H),1.54(s,1H),1.44(s,1H),1.37(s,1H),1.10(s,24H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.18(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.15(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),52.53(s),51.93(s),50.76(s),47.69(s),45.04(s),39.51(s),36.43(s),30.63(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.57(s),18.04(s),12.27(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₈₀N₃O₆:770.6047；found:770.6044。

實(shí)施例4 Harrisotone A的O-(哌嗪基)乙基衍生物的合成

將化合物II(396mg，0.5mmol)溶于16mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和無水哌嗪(6892mg，80mmol)，混合物加熱回流1h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入15mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為：石油醚/丙酮＝100:1.5，v/v)，收集淡棕色集中洗脫帶即得到化合物IV的淡棕色固體(286.9mg,71％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ5.14(s,2H),4.21(s,2H),3.53(d,J＝6.2Hz,4H),3.09(s,2H),3.05(s,2H),2.66(s,12H),2.57–2.53(m,4H),2.33(d,J＝15.0Hz,15H),2.24(s,1H),2.14(s,2H),2.10(s,1H),2.00(s,1H),1.88(d,J＝10.5Hz,3H),1.79(d,J＝5.0Hz,7H),1.71(d,J＝15.5Hz,7H),1.63(s,1H),1.55(s,1H),1.46(s,1H),1.15–1.05(m,8H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ206.30(s),198.04(s),195.28(s),190.07(s),135.11(s),119.89(s),114.86(s),84.25(s),76.42(s),66.70(s),62.58(s),60.18(s),59.97(s),54.35(s),54.16(s),53.66(s),50.78(s),45.24(s),45.06(s),39.49(s),36.45(s),30.61(d,J＝8.9Hz),28.61(s),25.10(s),23.93(d,J＝19.2Hz),22.58(s),18.04(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₆H₇₇N₆O₆:809.5905；found:809.5901。

實(shí)施例5 組合物抗肝纖維化活性

由于肝臟星狀細(xì)胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子會(huì)誘導(dǎo)肝臟成纖維細(xì)胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個(gè)重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細(xì)胞增殖的藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞的增殖，篩選常常在成纖維細(xì)胞上進(jìn)行，NIH/3T3細(xì)胞是最常用的細(xì)胞株。

組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的65mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的35mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時(shí)用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

實(shí)驗(yàn)例1：組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3增殖的抑制作用

一、實(shí)驗(yàn)方法：

NIH/3T3細(xì)胞株購自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫。

將對(duì)數(shù)生長期的亞融合的NIH/3T3細(xì)胞用0.25％胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)制成1×10⁴cell/ml的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定存活率大于95％，按每孔100ul加入96孔板中，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。棄去培養(yǎng)液，加入150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀490nm處讀取OD值，結(jié)果以O(shè)D₄₉₀表示。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、形態(tài)學(xué)觀察

NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細(xì)胞增殖的速度快；而加組合物24h后，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物增多?；衔颕II和化合物IV無此作用。

MTT法檢測(cè)組合物對(duì)NIH/3T3細(xì)胞增殖的抑制作用。

表1：MTT法檢測(cè)組合物對(duì)NIH/3T3增殖的抑制作用

注：*，與細(xì)胞陰性對(duì)照P<0.05

結(jié)果：組合物在20ug/ml對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。表明組合物體外對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用?；衔颕II和化合物IV無此作用。

實(shí)驗(yàn)例2：組合物對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β₁(TGF-β₁)誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用

TGF-β₁是促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原生成的強(qiáng)活性因子，在細(xì)胞中加入TGF-β₁10ng/ml刺激細(xì)胞增殖，再檢測(cè)藥物對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制作用，以分析判斷組合物的作用機(jī)理。

表2：MTT法檢測(cè)組合物對(duì)TGF誘導(dǎo)NIH/3T3增殖的抑制作用

注：*，與細(xì)胞+TGF對(duì)照P<0.05

結(jié)果：組合物在20ug/ml對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，化合物III和化合物IV無此作用。表明組合物體外對(duì)纖維細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過干預(yù)TGF信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

結(jié)論：組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用；組合物對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。組合物可以用來制備抗肝纖維化藥物?；衔颕II和化合物IV對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細(xì)胞增殖無顯著的抑制作用，對(duì)成纖維細(xì)胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細(xì)胞增殖無顯著的抑制作用，不可以用來制備抗肝纖維化藥物。

實(shí)施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。

實(shí)施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。