本發(fā)明涉及高分子生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種絲素蛋白納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著基因工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，基因和藥物載體的制備技術(shù)備受關(guān)注?？山到獾母叻肿宇w粒載體穩(wěn)定性好、裝載率高、能夠可持續(xù)釋放，廣泛應(yīng)用于基因載體、藥物緩控釋等領(lǐng)域。尤其，亞細胞尺寸的納米顆粒比表面積大、細胞吞噬效率高，是藥物釋放載體領(lǐng)域的研究熱點之一。

蠶絲絲素蛋白是由蠶后部絹絲腺的內(nèi)皮細胞分泌的高純度蛋白質(zhì)，不含細胞器和其他生物雜質(zhì)，生物安全性高。蠶絲絲素蛋白由乙氨酸、丙氨酸、絲氨酸等二十種氨基酸組成，生物相容性好，可被生物降解且最終降解產(chǎn)物為多肽和游離氨基酸容易被機體代謝。因此，絲素蛋白納米顆粒作為藥物載體前景廣闊。

目前，常用的制備絲素蛋白載體顆粒的方法有鹽析法、乳化法、化學(xué)誘導(dǎo)組裝（通過離子、pH、醇等誘導(dǎo)絲素組裝）、靜電噴射法（凝固浴收集、噴霧干燥）等。這些方法大多需要添加有機溶劑或者鹽等化學(xué)試劑，從而限制了絲素蛋白顆粒在臨床上的應(yīng)用。專利號為ZL 200410016856.4報道了通過凍融的方法制備絲素蛋白納米微球，避免了引發(fā)劑、表面活性劑和交聯(lián)劑的使用，但仍然需要添加一定量的有機溶劑作為變性劑誘導(dǎo)絲素蛋白組裝。通過靜電噴射的方法制備絲素蛋白顆粒雖然可以避免添加化學(xué)試劑，但其生產(chǎn)效率較低。

鑒于以上缺陷，本發(fā)明人通過積極研究并加以創(chuàng)新，設(shè)計了一種溶液濃度調(diào)控和超低溫快速冷凍的方法誘導(dǎo)絲素蛋白形成納米顆粒的方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)化上的利用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決以上技術(shù)問題，提供一種絲素蛋白納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用，實現(xiàn)綠色、溫和的條件下制備絲素蛋白納米顆粒。

為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種絲素蛋白納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：

S1. 取純化的絲素蛋白溶液，將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.01-0.6%，在液氮環(huán)境中冷凍至完全固化，得到絲素蛋白冷凍體；

S2.將絲素蛋白冷凍體進行冷凍干燥處理，得到絲素蛋白納米顆粒粉體；

S3.將絲素蛋白納米顆粒粉體加入質(zhì)量濃度為50-100 %的醇溶液中，依次進行超聲波分散、離心處理，得到上下分層的混合液，收集上層混合液；

S4. 將上層液體依次進行離心處理、洗滌和超聲波分散，得到分散性良好的絲素蛋白納米顆粒。

進一步地，所述絲素蛋白為家蠶、柞蠶或者天蠶的絲素蛋白。

進一步地，所述步驟S3中醇溶液為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇中的至少一種。

更進一步地，所述醇溶液為乙醇。

進一步地，所述步驟S1中冷凍時間為15-60min；所述步驟S2中冷凍干燥的時間為24-48h；所述步驟S3中超聲分散的時間為1-5min，離心是以轉(zhuǎn)速1000-2000rpm/min處理5-10min。

更進一步地，所述步驟S4的步驟為：將上層液體依次進行離心處理、洗滌和超聲波分散，得到絲素蛋白納米顆粒。

更進一步地，所述離心處理是以10000-20000rpm/min的轉(zhuǎn)速處理10-30min。

一種絲素蛋白納米顆粒，由上述的制備方法制備而成。

進一步地，所述絲素蛋白納米顆粒為球形，直徑為50-1000nm，具有生物降解性能。

上述絲素蛋白納米顆粒的應(yīng)用，所述絲素蛋白納米顆粒為傳遞載體，應(yīng)用于藥物或基因領(lǐng)域。

本發(fā)明的原理是：在較稀的絲素蛋白溶液中，絲素蛋白大分子呈線團狀結(jié)構(gòu)，并具有向膠體納米顆粒狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的趨勢，液氮的超低溫快速冷凍過程中的冰晶作用會誘導(dǎo)絲素蛋白大分子進一步組裝成納米顆粒狀結(jié)構(gòu)，最終形成納米顆粒冷凍體。經(jīng)冷凍干燥后即可形成納米顆粒粉體，進一步的醇和超聲波處理可以獲得不溶于水的、分散良好的絲素蛋白納米顆粒。

本發(fā)明一種絲素蛋白納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其突出的特點和優(yōu)異的效果在于：

1.本發(fā)明利用簡單的調(diào)控絲素蛋白溶液濃度和冷凍干燥的制備方法得到粒徑在50~1000 nm之間的絲素蛋白納米顆粒；該方法工藝過程簡單、產(chǎn)量高，能夠滿足藥物緩釋、生物制藥、酶固定材料等多種領(lǐng)域的應(yīng)用需求；

2.本發(fā)明采用冷凍干燥方法制備的絲素蛋白納米顆粒，在納米顆粒形成過程中無需添加任何輔助試劑，不會引起化學(xué)試劑的殘留，具有更高的生物安全性，在生物醫(yī)用方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢；

3.本發(fā)明的制備方法簡單，制備成本低廉，制得的絲素蛋白納米顆粒性能優(yōu)異，對促進絲素蛋白的應(yīng)用發(fā)展具有重要意義。

附圖說明

圖1為實施例1制備過程中絲素蛋白納米顆粒粉體的電鏡圖；

圖2為實施例1得到的絲素蛋白納米顆粒的5μm電鏡圖；

圖3為實施例1得到的絲素蛋白納米顆粒的1μm電鏡圖。

具體實施方式

以下通過具體實施方式和附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明的范圍僅限于以下的實例。在不脫離本發(fā)明上述方法思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均應(yīng)包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實施例1

將100 g家蠶生絲浸入5 L的0.05%NaCO₃溶液中，于98~100℃煮沸處理30 min，重復(fù)3次，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維；將絲素纖維加入到摩爾比1:2:8的CaCl₂/CH₃CH₂OH/H₂O三元溶液中，在72℃下攪拌溶解1 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；

將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到0.1 wt%，倒入不銹鋼盤，調(diào)整溶液厚度為4 mm，然后將不銹鋼盤置于液氮中，快速冷凍30 min形成絲素蛋白冷凍體；

將絲素蛋白冷凍體進行冷凍干燥處理，得到絲素蛋白納米顆粒粉體；

將絲素蛋白納米顆粒粉體加入到無水乙醇中，經(jīng)超聲波分散后得到納米顆粒懸液，以2000 r/min離心5 min，去除凍干過程表層形成的少量片狀結(jié)構(gòu)；

離心后的上清液以13000 r/min離心15 min，棄去上清液后用滅菌去離子水洗滌，重復(fù)3次，得到分散良好的絲素蛋白納米顆粒。

將實施例1制備過程中得到的絲素蛋白納米顆粒粉體做電鏡檢測，檢測結(jié)果如圖1所示；將實施例1得到的絲素蛋白納米顆粒做電鏡檢測，檢測結(jié)果如圖2和圖3所示。

實施例2

將脫膠的絲素纖維加入到9.3mol/L的LiBr溶液中，在60oC下攪拌溶解2 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析3天，得到純化的絲素蛋白溶液；

將絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到0.01 wt%，攪拌均勻后，倒入不銹鋼盤，調(diào)整溶液厚度為3 mm，然后將不銹鋼盤置于液氮中，快速冷凍20 min形成絲素蛋白冷凍體；

將絲素蛋白冷凍體進行冷凍干燥處理，得到絲素蛋白納米顆粒粉體；

將絲素蛋白納米顆粒粉體加入到90%甲醇溶液中，經(jīng)超聲波分散后得到納米顆粒懸液，以1000 r/min離心10 min，去除凍干過程表層形成的少量片狀結(jié)構(gòu)，得到上下分層的混合液，收集上層混合液；

將上層混合液進行以20000rpm./min離心處理10min，分層，去除上層液，洗滌，超聲分散，重復(fù)本段所述操作5次，得到絲素蛋白納米顆粒懸浮液；

將絲素蛋白納米顆粒懸液凍干，得到納米顆粒粉體。

實施例3

將100 g柞蠶生絲浸入5 L的0.25%Na₂CO₃溶液中，于98~100℃煮沸處理2 h，使蠶絲脫膠，充分洗滌干燥后得到純絲素纖維；將脫膠后的柞蠶絲素纖維加入到熔融的Ca(NO₃)₂溶液中在100℃攪拌溶解3 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋，用去離子水透析得到純化的柞蠶絲素蛋白溶液；

將柞蠶絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到0.05 wt%，攪拌均勻后，倒入不銹鋼盤，調(diào)整溶液厚度為3 mm，然后將不銹鋼盤置于液氮中，快速冷凍25 min形成絲素蛋白冷凍體。

將絲素蛋白冷凍體進行冷凍干燥處理，得到絲素蛋白納米顆粒粉體；

將絲素蛋白納米顆粒粉體加入到90%乙醇溶液中，經(jīng)超聲波分散后得到納米顆粒懸液，以1500 r/min離心10 min，去除凍干過程表層形成的少量片狀結(jié)構(gòu)，得到上下分層的混合液，收集上層混合液。

將上層混合液進行以10000rpm./min離心處理30min，分層，去除上層液，洗滌，超聲分散，重復(fù)本段所述操作5次，得到絲素蛋白納米顆粒懸浮液；

將絲素蛋白納米顆粒懸浮液凍干，得到納米顆粒粉體。

實施例4

將天蠶繭脫膠，然后將脫膠天然絲素纖維加入9.0 mol/L的LiSCN溶液中在45℃攪拌溶解1 h得到絲素蛋白混合溶液；將所得到的絲素蛋白混合溶液裝入透析袋中，用去離子水透析得到純化的天蠶蠶絲素蛋白溶液；

將天蠶蠶絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)整到0.2 wt%，攪拌均勻后，倒入不銹鋼盤，調(diào)整溶液厚度為3 mm，然后將不銹鋼盤置于液氮中，快速冷凍25 min形成絲素蛋白冷凍體；

將絲素蛋白冷凍體進行冷凍干燥處理，得到絲素蛋白納米顆粒粉體；

將絲素蛋白納米顆粒粉體加入到無水甲醇溶液中，經(jīng)超聲波分散后得到納米顆粒懸液，以2000 r/min離心5 min，去除凍干過程表層形成的少量片狀結(jié)構(gòu)，得到上下分層的混合液，收集上層混合液；

將上層混合液進行以20000rpm./min離心處理10min，分層，去除上層液，洗滌，超聲分散，重復(fù)本段所述操作3次，得到絲素蛋白納米顆粒。