本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種基于肽和光敏劑的光熱納米粒子、其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

光熱納米粒子是一種可以捕獲光并將光能轉(zhuǎn)換為熱量的新型納米粒子。光熱納米粒子具有廣泛的應(yīng)用前景，比如可以應(yīng)用于光聲成像和光熱治療試劑的制備。在光聲成像技術(shù)中，納米粒子將光轉(zhuǎn)換為熱，熱導(dǎo)致的膨脹進(jìn)一步生成超聲信號(hào)，從而結(jié)合了光的指向性和超聲檢測(cè)的高分辨特性，在腫瘤的檢查中展現(xiàn)出了檢測(cè)深度大、靈敏度高、安全性高的優(yōu)點(diǎn)?；谕瑯拥墓鉄徂D(zhuǎn)換過(guò)程，光熱納米粒子可以使其周?chē)募?xì)胞和組織的溫度升高，實(shí)現(xiàn)定向殺傷病變細(xì)胞的目的。與傳統(tǒng)的放射檢測(cè)和治療相比較，光聲成像和光熱治療中利用到的可見(jiàn)光和近紅外光對(duì)正常的細(xì)胞和組織沒(méi)有直接的殺傷作用。因此，光熱納米粒子為腫瘤的診斷和治療提供了一種高效、安全的途徑。

用于光聲成像和光熱治療的納米粒子需要具備在近紅外區(qū)吸收強(qiáng)、光熱轉(zhuǎn)換效率高的性質(zhì)。得到廣泛研究的光熱納米粒子包括金納米顆粒、石墨烯及氧化石墨烯、碳納米管等。這些無(wú)機(jī)納米粒子具有較大的光熱轉(zhuǎn)換效率和光穩(wěn)定性，但是其在體內(nèi)無(wú)法降解，長(zhǎng)期安全性沒(méi)有得到證實(shí)。為克服無(wú)機(jī)納米粒子存在的不可降解的問(wèn)題，人們發(fā)展了基于聚吡咯、聚苯胺等高分子聚合物的光熱納米粒子，但這些材料還存在表面修飾困難、降解機(jī)制復(fù)雜的問(wèn)題。

肽是生物體天然存在的重要結(jié)構(gòu)單元，肽分子的氨基酸序列決定了其在一定條件下可以自組裝形成各種形貌的納米粒子。肽分子不僅自身能自組裝形成納米粒子，包含肽分子結(jié)構(gòu)的共價(jià)復(fù)合物也能夠在肽分子的作用下形成各種有序結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在化療藥物的遞送等方面已經(jīng)展示了一些優(yōu)勢(shì)?；陔姆肿拥淖越M裝納米粒子用于生物醫(yī)藥方面具有無(wú)免疫原性、化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)。然而，如何設(shè)計(jì)合理的肽-光敏劑分子，并制備基于肽和光敏劑的光熱納米粒子，目前還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于肽和光敏劑的光熱納米粒子、其制備方法及用途；本發(fā)明形成的光熱納米粒子具有水體系中分散穩(wěn)定、粒徑分布均勻、大小可控、光熱轉(zhuǎn)換效率高、生物安全性高的特性。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種光熱納米粒子，該光熱納米粒子由肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物經(jīng)分子自組裝形成。

本發(fā)明中，所述納米粒子是由肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物在水體系中自組裝形成的，其中需要強(qiáng)調(diào)的是，所涉及的肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物是指肽鏈和光敏劑之間通過(guò)共價(jià)結(jié)合，不同于以往的肽和光敏劑分子的共組裝形式。

本發(fā)明通過(guò)采用以肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物的形式自組裝，能夠形成粒徑大小可控、在水體系中穩(wěn)定分散的光熱納米粒子，其突出的優(yōu)點(diǎn)是光熱轉(zhuǎn)換效率高，可達(dá)到40％以上，從而可以應(yīng)用于制備光聲成像試劑、光熱治療試劑等領(lǐng)域。

根據(jù)本發(fā)明，所述肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物由光敏劑分子通過(guò)烷基鏈以酰胺鍵共價(jià)連接于肽鏈上，例如可以連接于肽鏈的碳端，也可以連接于肽鏈的氮端。

本發(fā)明中，所述烷基鏈主要用于連接光敏劑分子和肽鏈，其可以選自含有0-10個(gè)碳原子的烷基鏈，例如0個(gè)、1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、9個(gè)或10個(gè)，當(dāng)碳原子個(gè)數(shù)為0時(shí)，即光敏劑分子和肽鏈之間不含有烷基鏈。

根據(jù)本發(fā)明，所述肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物中，光敏劑分子可以是親水性和/或疏水性光敏劑分子，然而采用疏水性光敏劑分子時(shí)所形成的光熱納米粒子，其在光熱轉(zhuǎn)換效率上表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明中，所述光敏劑分子為卟啉、卟啉衍生物或卟啉類(lèi)似物，優(yōu)選四苯基卟啉、二氫卟吩E6、焦脫鎂葉綠酸、細(xì)菌葉綠素、葉綠素a、四羥基苯基二氫卟酚、紅紫素、苯并二氫卟酚、萘并二氫卟酚、酮二氫卟酚、氮雜二氫卟酚、細(xì)菌二氫卟酚、甲苯基卟啉、苯并細(xì)菌二氫卟酚、酞菁、萘酞菁、卟啉烯或反轉(zhuǎn)卟啉中的任意一種或至少兩種的混合物，典型但非限制性的混合物為：卟啉和卟啉衍生物、細(xì)菌葉綠素和葉綠素a、萘并二氫卟酚和酮二氫卟酚。

根據(jù)本發(fā)明，所述肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物中的肽鏈?zhǔn)怯杀奖彼?、酪氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、組氨酸或精氨酸中的任意一種、兩種或三種組合的寡肽序列。

本發(fā)明中的肽鏈選擇氨基酸在1-3的寡肽序列，其有助于形成的光熱納米粒子發(fā)揮更大的光熱轉(zhuǎn)換效率。

本發(fā)明中，所述肽鏈可以選自L-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬氨酸-L-天冬氨酸、L-天冬氨酸-L-天冬氨酸-L-天冬氨酸、L-組氨酸、L-組氨酸-L-組氨酸或L-組氨酸-L-組氨酸-L-組氨酸中的任意一種，優(yōu)選含有L-苯丙氨酸的肽鏈。

本發(fā)明中的光熱納米粒子形貌為球形，其直徑在10-200nm范圍內(nèi)。

示例性地，本發(fā)明中的肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)式如下所示：

第二方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的光熱納米粒子的制備方法，其包括以下步驟：

(1)將肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物于良溶劑中配成溶液；

(2)將步驟(1)得到的溶液加入不良溶劑中，得到基于肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物的光熱納米粒子。

本發(fā)明中，步驟(1)所述肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物在良溶劑中的濃度為0.1-100mg/mL，例如0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、90mg/mL或100mg/mL，優(yōu)選1-50mg/mL。

本發(fā)明中，步驟(2)所述肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物在不良溶劑中的濃度為0.01-20mg/mL，例如0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、15mg/mL、18mg/mL或20mg/mL，優(yōu)選0.1-15mg/mL。

本發(fā)明中，步驟(1)所述良溶劑為二甲基亞砜、乙醇、甲醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺或乙腈中的任意一種或至少兩種的混合物；步驟(2)所述不良溶劑為水、磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、醋酸-醋酸銨緩沖液、氨-氯化銨緩沖液或枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液中的任意一種或至少兩種的混合物。

具體地，本發(fā)明提供的光熱納米粒子的制備方法，可以包括以下步驟：

(1)將肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物于良溶劑中配制成0.1-100mg/mL的溶液；

所述良溶劑為二甲基亞砜、乙醇、甲醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺或乙腈中的任意一種或至少兩種的混合物；

(2)將上述溶液加入不良溶劑中，所述肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物在不良溶劑中濃度為0.01-20mg/mL，得到基于肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物的光熱納米粒子；

所述不良溶劑為水、磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、醋酸-醋酸銨緩沖液、氨-氯化銨緩沖液或枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液中的任意一種或至少兩種的混合物。

示例性地，所述光熱納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

(1)將肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物于二甲基亞砜中配制成10mg/mL的溶液；

(2)將上述溶液加入水中，所述肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物在不良溶劑中濃度為5mg/mL，得到基于肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物的光熱納米粒子。

或者，所述光熱納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

(1)將肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物于乙醇中配制成50mg/mL的溶液；

(2)將上述溶液加入磷酸鹽緩沖溶液中，所述肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物在不良溶劑中濃度為10mg/mL，得到基于肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物的光熱納米粒子。

第三方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明第一方面所述的光熱納米粒子作為制備光熱治療制劑中的應(yīng)用。

第四方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明第一方面所述光熱納米粒子作為制備光聲成像制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的光熱納米粒子由肽-光敏劑共價(jià)復(fù)合物自組裝形成；其中光敏劑發(fā)揮吸收光能的作用；肽分子的作用是調(diào)控光敏劑的自組裝，一方面使形成的納米粒子中光敏劑分子呈有序聚集狀態(tài)，增強(qiáng)光能向熱的轉(zhuǎn)換，另一方面抑制光敏劑分子的進(jìn)一步聚集，使得到的納米粒子在水體系中穩(wěn)定分散；與現(xiàn)有的光熱納米粒子相比較，本發(fā)明基于肽和光敏劑的光熱納米粒子具有分子結(jié)構(gòu)明確、生物可降解、生物安全性高、無(wú)免疫原性的優(yōu)點(diǎn)，避免了基于無(wú)機(jī)納米顆粒和高分子聚合物應(yīng)用于人體時(shí)潛在的毒副作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的光熱納米粒子具有40％以上的光熱轉(zhuǎn)換效率；

(2)本發(fā)明提供的光熱納米粒子具有粒徑大小可控、在水體系中穩(wěn)定分散和生物可降解、生物安全性高、無(wú)免疫原性的優(yōu)點(diǎn)，避免了基于無(wú)機(jī)納米顆粒和高分子聚合物應(yīng)用于人體時(shí)潛在的毒副作用。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中的光熱納米粒子的透射電子顯微鏡圖片；

圖2為實(shí)施例2中的光熱納米粒子的粒徑分布圖；

圖3為實(shí)施例3中的光熱納米粒子的電位分布圖；

圖4為實(shí)施例4中的光熱納米粒子的原子力顯微鏡圖片；

圖5為實(shí)施例5中的光熱納米粒子在光照下的升溫曲線圖；

圖6為實(shí)施例6中的光熱納米粒子的升溫和降溫曲線圖；

圖7為實(shí)施例7中的光熱納米粒子在溶液中的光聲信號(hào)；

圖8為實(shí)施例8中的光熱納米粒子用于活體光聲成像的光聲信號(hào)強(qiáng)度圖；

圖9為實(shí)施例9中的光熱納米粒子用于光熱治療時(shí)的熱成像圖；

圖10為實(shí)施例10中的光熱納米粒子用于光熱治療殺滅細(xì)胞的效果圖；

圖11為實(shí)施例11中的光熱納米粒子用于活體光熱治療時(shí)腫瘤體積的變化曲線。

下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡(jiǎn)易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不僅限于下述實(shí)施例。

實(shí)施例1

取如下所示結(jié)構(gòu)式的化合物2mg，溶解于1mL二甲基亞砜，配制成5mg/mL的溶液，加入10mL水，得到光熱納米粒子的分散液。取樣品滴于銅網(wǎng)，透射電子顯微鏡測(cè)試得到圖1所示結(jié)構(gòu)，其表明該光熱納米粒子為直徑30nm左右的球體。

實(shí)施例2

取如下所示結(jié)構(gòu)式的化合物100mg，溶解于1mL乙醇，配制成100mg/mL的溶液，加入磷酸鹽緩沖液，使化合物濃度為20mg/mL，得到光熱納米粒子的分散液。取樣品進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試，結(jié)果如圖2所示，其表明納米粒子的直徑為100納米左右。

實(shí)施例3

取如下所示結(jié)構(gòu)式的化合物0.1mg，溶解于1mL甲醇，配制成0.1mg/mL的溶液，加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，使化合物濃度為0.01mg/mL，得到光熱納米粒子的分散液，經(jīng)測(cè)試其粒徑為10納米左右。取樣品進(jìn)行電位測(cè)試，結(jié)果如圖3所示，表明納米粒子的電位為-20毫伏左右。

實(shí)施例4

取如下所示結(jié)構(gòu)式的化合物10mg，溶解于1mL四氫呋喃，配制成10mg/mL的溶液，加入醋酸-醋酸銨緩沖液，使化合物濃度為1mg/mL，得到光熱納米粒子的分散液。取樣品負(fù)載于云母片表面進(jìn)行原子顯微鏡測(cè)試，結(jié)果如圖4所示，其表明納米粒子為直徑200納米左右的球體。

實(shí)施例5

取如下所示結(jié)構(gòu)式的化合物2mg，溶解于1mL乙腈，配制成2mg/mL的溶液，加入氨-氯化銨緩沖液，使化合物濃度為0.2mg/mL，得到光熱納米粒子的分散液。取1mL 0.2mg/mL的樣品置于1厘米的正方形比色皿中，使用700納米波長(zhǎng)的激光進(jìn)行照射，激光功率0.2瓦/平方厘米，以純水作為對(duì)照組，以溫度探測(cè)儀測(cè)試溶液溫度的變化，結(jié)果如圖5所示，其表明納米粒子在激光照射下能迅速轉(zhuǎn)換光能為熱量，光熱轉(zhuǎn)換效率為80％。

實(shí)施例6

取如下所示結(jié)構(gòu)式的化合物5mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺，配制成5mg/mL的溶液，加入枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液，使化合物濃度為1mg/mL，得到光熱納米粒子的分散液。取1mL 1mg/mL的樣品置于1厘米的正方形比色皿中，使用650納米波長(zhǎng)的激光進(jìn)行照射，激光功率0.2瓦/平方厘米，照射10分鐘后關(guān)閉激光，整個(gè)過(guò)程中以溫度探測(cè)儀測(cè)試溶液溫度的變化，結(jié)果如圖6所示，其表明納米粒子在激光照射下能迅速轉(zhuǎn)換光能為熱量，光熱轉(zhuǎn)換效率計(jì)算為46％。

實(shí)施例7

取如下所示結(jié)構(gòu)式的化合物5mg，溶解于1mL二甲基亞砜，配制成5mg/mL的溶液，加入水，使化合物濃度為0.5mg/mL，得到光熱納米粒子的分散液。測(cè)試其光熱轉(zhuǎn)換效率為40％。取0.5mg/mL的樣品置于進(jìn)行光聲成像測(cè)試，結(jié)果如圖7所示，其表明納米粒子在激光照射下能產(chǎn)生光聲信號(hào)。

實(shí)施例8

取如下所示結(jié)構(gòu)式的化合物5mg，溶解于1mL乙醇，配制成5mg/mL的溶液，加入水，使化合物濃度為0.5mg/mL，得到光熱納米粒子的分散液。取200微升0.5mg/mL的樣品經(jīng)過(guò)尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，24小時(shí)后將小鼠置于光聲成像儀中進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖8所示，腫瘤部位光聲信號(hào)較強(qiáng)，而正常組織中光聲信號(hào)較弱，表明該納米粒子在活體中在腫瘤部位富集，并能夠顯示腫瘤的位置。

實(shí)施例9

如實(shí)施例2中制備的光熱納米粒子，配制為1mg/mL的樣品，取200微升經(jīng)過(guò)尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，24小時(shí)后使用700納米波長(zhǎng)的激光照射腫瘤位置，激光功率0.2瓦/平方厘米，照射過(guò)程中使用熱成像儀檢測(cè)小鼠溫度的變化，結(jié)果如圖9所示，其表明腫瘤部分溫度上升，而其他部位無(wú)明顯變化。

實(shí)施例10

取實(shí)施例8中制備的光熱納米粒子，與乳腺癌細(xì)胞MFC-7共孵育，光熱納米粒子在培養(yǎng)液中的濃度為0.05mg/mL，24小時(shí)后使用700納米波長(zhǎng)的激光照射細(xì)胞2分鐘，激光功率0.5瓦/平方厘米，照射后繼續(xù)孵育24小時(shí)并進(jìn)行細(xì)胞活度測(cè)試，結(jié)果如圖10所示，經(jīng)光熱治療的細(xì)胞活度明顯下降，而未經(jīng)納米粒子處理的細(xì)胞活度無(wú)明顯變化。

實(shí)施例11

取實(shí)施例1中制備的納米粒子，在5％葡萄糖水溶液中配制成0.8mg/mL的溶液。取20只小鼠，分成4組：對(duì)照組、僅激光組、僅納米粒子組、納米粒子+激光組(光熱治療組)。僅納米粒子組和納米粒子+激光組的小鼠通過(guò)尾靜脈注射200微升納米粒子，24小時(shí)后使用635納米波長(zhǎng)的激光照射腫瘤10分鐘，照射后每隔一天測(cè)試小鼠腫瘤體積的變化，結(jié)果如圖11所示。結(jié)果表明，光熱治療組的腫瘤得到較好的抑制，而其它幾組的腫瘤沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明該納米粒子用于光熱治療能很好地抑制腫瘤。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的產(chǎn)品及詳細(xì)制備方法，但本發(fā)明并不局限于上述產(chǎn)品和詳細(xì)制備方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述產(chǎn)品和詳細(xì)制備方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說(shuō)明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容。