本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體涉及一系列三萜化合物在制備用于抑制腸道apoB48合成、分泌的藥物中的應(yīng)用。特別是在制備抗高血脂癥藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗動(dòng)脈粥樣硬化疾病藥物等方面的用途。

背景技術(shù)：

高血脂癥是指血清脂質(zhì)水平異常升高的狀態(tài)，主要表現(xiàn)為血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平過高以及高密度脂蛋白水平過低，被認(rèn)為是誘發(fā)心腦血管疾病如腦中風(fēng)、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞等重要的危險(xiǎn)因素。全球每年因高血脂誘發(fā)的心腦血管疾病死亡率占所有疾病死亡率的30～40％。

人體血脂來(lái)源于內(nèi)源性自身合成以及外源性從膳食中攝入。隨著生活水平的提高，人們傾向于攝入過多的高脂飲食。因此，外源性脂質(zhì)過度吸收已成為引發(fā)高血脂癥的重要原因，而控制外源性脂質(zhì)攝入成為調(diào)控血脂水平的重要策略之一。臨床上抑制脂質(zhì)吸收的藥物如依折麥布、阿伐麥布等，均可通過選擇性抑制膽固醇的吸收起到降血脂作用。但上述藥物仍存在一定的毒副作用，如肝腎毒性、肌肉毒性以及各種胃腸道反應(yīng)，臨床應(yīng)用存在一定局限性。因此，開發(fā)新的調(diào)控脂質(zhì)吸收的藥物具有重要的臨床意義和應(yīng)用前景。

載脂蛋白B48(apoB48)是小腸吸收脂質(zhì)所必須的載脂蛋白。膳食中的脂質(zhì)由小腸上皮細(xì)胞攝取，與apoB48合成乳糜微粒后，經(jīng)淋巴循環(huán)分泌入血。apoB48是腸源性脂蛋白公認(rèn)的的特征標(biāo)志。研究表明在某些病理情況下，如高脂血癥、冠心病、胰島素抵抗、糖尿病等代謝疾病，患者表現(xiàn)為空腹血漿apoB48水平異常。血漿apoB48水平升高，引起富含甘油三酯脂蛋白殘粒在血管壁沉積，形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。因此，調(diào)節(jié)小腸apoB48水平有助于改善外源性脂質(zhì)吸收，從而降低高脂血癥引起的心血管疾病等發(fā)生危險(xiǎn)。而目前針對(duì)調(diào)控腸道apoB48的藥物開發(fā)有限，并沒有特征性抑制apoB48水平的藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)目前調(diào)控腸道apoB48的藥物開發(fā)的局限性，公開了青錢柳三萜化合物在制備用于抑制腸道apoB48合成、分泌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所涉及的三萜化合物，其特征在于：從青錢柳中獲得或從商業(yè)途徑購(gòu)買得到，具有由通式I、II或III所示的三萜化合物。

更優(yōu)選的通式I、II、III所述的三萜化合物是下述三萜化合物中的任一種或多種的組合。

13：(12R，20S，24S)-20，24-dihydroxy-3，4-secodammara-2(28)，25-dien-3-oic acid-12-O-α-L-arabino pyranoside

14：(20S，24R)-(3β，12β)-20，24-epoxydammara-25-ol-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-α-L-arabinopyranoside

15：(20S，24R)-(3α，12β)-20，24-epoxydammara-25-ol-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-α-L-arabinopyranoside

16：(23E)-(12R，20S)-20-hydroxy-3，4-secodammarane-4(28)，23，25-trien-3-oic acid-12-O-β-D-quinovopyranoside

其中：Ra：β-D-Xyl(p)-(1→3)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Ara(p)；Rb：α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glu-(1→6)-β-D-Glu

本發(fā)明提供抑制腸道apoB48合成、分泌的藥物包括權(quán)利要求2通式I、II、III或權(quán)利要求3所述的三萜化合物中任意一種或多種的組合與藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的制劑。

本發(fā)明提供抑制腸道apoB48合成、分泌的藥物可以是片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、糖漿劑、口服液或注射劑。

附圖說(shuō)明

圖1為青錢柳三萜單體化合物對(duì)Caco-2細(xì)胞分泌(A)和胞內(nèi)(B)的apoB48的影響

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。在本發(fā)明中，一下所述的實(shí)施例是為了更好的闡述本發(fā)明，而不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1 青錢柳三萜化合物的制備

干燥的青錢柳葉48.5kg，用80％乙醇加熱回流提取3次，每次提取2h，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，殘留物加水混懸后，依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，分別回收溶劑后得氯仿部位(3.65kg)、乙酸乙酯部位(120g)和剩余水部位。

取氯仿部位浸膏3kg，經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(100∶0、100∶5、5∶1、0∶100)梯度洗脫，每個(gè)梯度為合并到一起，得4個(gè)流分(Fr.1～4)。Fr.2(400g)再經(jīng)硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(100∶3→0∶100)梯度洗脫，TLC檢視，合并得4個(gè)亞流分(Fr.2a～2d)。Fr.2a經(jīng)硅膠柱色譜以三氯甲烷-甲醇(100∶0→1∶1)梯度洗脫，Sephadex LH-20柱色譜以三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，制備HPLC(85％甲醇-水)分離，經(jīng)氯仿-甲醇反復(fù)重結(jié)晶，得化合物23(15mg)、32(10mg)、30(700mg)、34(35mg)、35(900mg)、37(600mg)、47(20mg)。Fr.2b經(jīng)硅膠柱色譜以三氯甲烷-甲醇(100∶3→1∶1)梯度洗脫，得5個(gè)亞流分(Fr.2b-1～Fr.2b-5)。其中Fr.2b-2經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜以三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，ODS反相柱色譜以甲醇-水(50∶50→100∶0)梯度洗脫，經(jīng)氯仿-甲醇反復(fù)重結(jié)晶，得化合物31(1000mg)、36(4mg)、46(15mg)、48(30mg)。Fr.2b-3經(jīng)ODS反相柱色譜以甲醇-水以(50∶50→100∶0)梯度洗脫，制備HPLC以甲醇-水73％等度洗脫，得化合物50(5mg)、51(2mg)。Fr.2c經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜以三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，ODS反相柱色譜，甲醇-水(50∶50→100∶0)梯度洗脫，通過制備HPLC(65％甲醇-水)等度洗脫，得49(3mg)。Fr.3(100g)經(jīng)硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇(100∶5、7∶1、5∶1、1∶1、0∶100)梯度洗脫，TLC檢視合并樣品，得5個(gè)亞流分(Fr.3a～3e)。Fr.3b經(jīng)ODS反相柱色譜以甲醇-水(40∶60→100∶0)梯度洗脫，合并得4個(gè)亞流分(Fr.3b-1～3b-4)。Fr.3b-1經(jīng)硅膠柱色譜三氯甲烷-甲醇(20∶1)等度洗脫，得化合物22(18mg)。Fr.3b-2經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜以三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫，反復(fù)硅膠柱以三氯甲烷-甲醇(10∶1)等度洗脫，得化合物4(35mg)、11(60mg)、14(25mg)。Fr.3b-3上5％減活硅膠柱，以三氯甲烷-甲醇(100∶5→0∶100)梯度洗脫，制備HPLC(80％甲醇-水)等度洗脫，得到化合物20(10mg)、21(5mg)。Fr.3c反復(fù)經(jīng)ODS反相柱色譜甲醇-水(60∶40)等度洗脫，硅膠柱以氯仿-甲醇(10∶1)等度洗脫，制備HPLC(50％乙腈-水)制備得化合物18(60mg)、19(40mg)。

實(shí)施例2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)

50 3β，23-二羥基-1，12-二氧-齊墩果酸(3β，23-dihydroxy-1，12-dioxo-olean-28-oic acid)

白色粉末(甲醇)，mp 287～289℃，(c 0.095MeOH)，易溶于氯仿、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性，香草醛-濃硫酸顯藍(lán)紫色。IR(KBr)cm^-1：3441，2946，1696，1050；UVλ_max(CH₃OH)：203nm。HR-TOF-MS m/z：501.3218[M-H]^-(C₃₀H₄₅O₆，calcd.501.3216)，分子式為C₃₀H₄₆O₆，分子量為502。UV光譜顯示在處有最大吸收峰。IR光譜顯示有強(qiáng)的羥基吸收峰(cm^-1)、C-H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰(cm^-1)、羰基吸收峰(cm^-1)和C-O鍵伸縮振動(dòng)吸收峰(cm^-1)。¹H NMR(C₅D₅N，600MHz)和¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)數(shù)據(jù)見表1。

51 3β，23，27-三羥基-1-氧-12-烯-28-齊墩果酸(3β，23，27-trihydroxy-1-oxo-olean-12-ene-28-oic acid)

白色粉末(甲醇)，mp 261～263℃，(c 0.063，MeOH)。易溶于氯仿、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽(yáng)性，香草醛-濃硫酸顯藍(lán)紫色。IR(KBr)cm^-1：3441，2945，1696，1633；UVλ_max(CH₃OH)：204nm。HR-ESI-MS m/z：520.3625[M+NH₄]⁺(C₃₀H₅₀NO₆，calcd.520.3633)，分子式為C₃₀H₄₆O₆，分子量為502。¹H NMR(C₅D₅N，500MHz)和¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)數(shù)據(jù)見表1。

表1 化合物50和51NMR數(shù)據(jù)(C₅D₅N，J in Hz)

20 20S，24-內(nèi)酯-達(dá)瑪-(3α，12β)-12-O-β-D-雞納吡喃糖基-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖苷[20S，24-lactone-dammar-(3α，12β)-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-α-L-arabinofuranoside]

白色粉末(甲醇)，mp 140～142℃，(c 0.081，MeOH)，易溶于甲醇、乙腈，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性，香草醛-濃硫酸顯紫紅色。IR(KBr)cm^-1：3439，2929，1640，1070；UVλ_max(CH₃OH)：203nm。HR-ESI-MS m/z：728.4607[M+NH₄]⁺(C₃₈H₆₆NO₁₂，calcd.728.4580)，分子式為C₃₈H₆₂O₁₂，分子量為710。¹H NMR(C₅D₅N，500MHz)和¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)見表2和表3。

21 20S，24-內(nèi)酯-達(dá)瑪-(3α，12β)-12-O-β-D-雞納吡喃糖基-3-O-(5′-O-乙?；?-α-L-阿拉伯呋喃糖苷[20S，24-lactone-dammar-(3α，12β)-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-(5′-O-acetyl)-α-L-arabinofuranoside]

白色粉末(甲醇)，mp 136～138℃，(c 0.104，MeOH)，易溶于甲醇、乙腈，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性，香草醛-濃硫酸顯紫紅色。IR(KBr)em^-1：3442，2929，1643，1068；UVλ_max(CH₃OH)：224、203nm。HR-ESI-MS m/z：775.4277[M+NH₄]⁺(C₄₀H₆₈NO₁₃，calcd.770.4716)，分子式為C₄₀H₆₄O₁₃，分子量為752。¹H NMR(C₅D₅N，600MHz)和¹³C NMR(C₅D₅N，150MHz)見表2和表3。

22(20S，24R)-環(huán)氧-達(dá)瑪烷(3β，12β)-25-羥基-12-O-β-D-吡喃雞納糖基-3-O-(4′-O-乙?；?-β-D-呋喃雞納糖苷[(20S，24R)-epoxydammarane(3β，12β)-25-hydroxyl-12-O-β-D-quinovopyranosyl-3-O-(4′-O-acetyl)-β-D-quinovopyranoside]

白色無(wú)定形粉末(甲醇)，mp 146～148℃，(c 0.086，MeOH)，易溶于甲醇、乙腈，Liebermann-Burchard和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性，濃硫酸-香草醛反應(yīng)顯紫紅色。IR(KBr)cm^-1：3441，1642，1071；UVλ_max(CH₃OH)：225、203nm。HR-ESI-MS m/z：828.5473[M+NH₄]⁺(C₄₄H₇₈NO₁₃，calcd.828.5468)，分子式為C₄₄H₇₄O₁₃，分子量為810。¹H NMR(C₅D₅N，500MHz)和¹³C NMR(C₅D₅N，125MHz)見表2和表3。

表2 化合物20～22苷元NMR數(shù)據(jù)(C₅D₅N，J in Hz)

表3 化合物20～22糖基NMR數(shù)據(jù)(C₅D₅N，J in Hz)

實(shí)施例3 青錢柳三萜化合物調(diào)節(jié)Caco-2細(xì)胞分泌apoB48的活性

1.材料

1.1 供試品

供試品為青錢柳中分離得到的22個(gè)三萜化合物，編號(hào)為4、11、14、18～23、30～32、34～37和46～51，結(jié)構(gòu)式如前所述。供試品儲(chǔ)備液：取三萜化合物1mg，溶解于100μL的二甲基亞砜(DMSO)中，再用PBS稀釋10倍，于4℃保存，待用。

1.2 藥品與試劑

Caco-2細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司(批號(hào)20151019)。

表4 實(shí)驗(yàn)試劑及藥品

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Caco-2細(xì)胞模型的建立

(1)Caco-2細(xì)胞的復(fù)蘇

將前期凍存的Caco-2細(xì)胞放入37℃溫水中使其融化，用含10％FBS的完全DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋，1000rpm離心10min，棄掉上清，重新加入含10％FBS的DMEM吹勻后，轉(zhuǎn)移至25cm²透氣培養(yǎng)瓶中于5％CO₂、37℃條件下靜置培養(yǎng)。如培養(yǎng)基若發(fā)生pH值、顏色變化，更換新鮮培養(yǎng)基。

(2)Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代

細(xì)胞傳代：細(xì)胞接種后，每天觀察生長(zhǎng)密度，待匯合度80～90％(5～7d)，PBS清洗細(xì)胞；用0.25％胰蛋白酶消化(37℃孵育4～5min)，顯微鏡觀察，至細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞質(zhì)收縮，快速加入血清終止消化；加培養(yǎng)基后適度吹打細(xì)胞至細(xì)胞完全脫落，離心，均勻接種于干凈的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

(3)Transwell小室模型的建立

當(dāng)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)至細(xì)胞融合時(shí)，胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，將4×10⁴～5×10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²接種于6孔Transwell培養(yǎng)槽中(24mm，0.4μm)，向頂孔和基底孔小室(分別對(duì)應(yīng)腸腔側(cè)及漿膜側(cè))各加入定量的完全DMEM培養(yǎng)基，隔天換液，于接種后15～20d，通過細(xì)胞電阻儀測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻，確定細(xì)胞單層的完整性。

2.2 MTT篩選三萜化合物給藥劑量

用PBS配制MTT儲(chǔ)存液(5mg/mL)，過0.22μm濾膜除菌，于4℃保存，待用。

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞，接種到96孔板上，每孔加入細(xì)胞懸液200μl，使密度為5×10³～1×10⁴，于37℃、5％CO₂條件培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，加入三萜單體化合物(梯度濃度：10～100μM)，各濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中，37℃、5％CO₂及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入10μL MTT(10mg/mL)，繼續(xù)孵育3h，洗掉上清液，加入100μL DMSO，震蕩10min使晶體物充分溶解，在490nm處，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處結(jié)晶溶液的OD值。根據(jù)調(diào)零孔、空白孔及樣品孔OD值，計(jì)算給藥組細(xì)胞存活率(高于90％)，確定三萜化合物無(wú)細(xì)胞毒活性的劑量小于25μM。

2.3 Elisa測(cè)定apoB48含量

(1)細(xì)胞培養(yǎng)和藥物干預(yù)

用不完全培養(yǎng)基或PBS清洗細(xì)胞，按照以下各組給予對(duì)應(yīng)藥物處理：空白對(duì)照組(Blank)，模型組(Control)，三萜單體化合物(10μM)，陽(yáng)性組辛伐他汀(Statin，10μM)。取已培養(yǎng)于Transwell小室內(nèi)的分化Caco-2細(xì)胞，對(duì)照組用0.1％牛血清白蛋白的不完全培養(yǎng)基孵育，模型組、給藥組和陽(yáng)性組用不完全培養(yǎng)基溶解的油酸-牛血清白蛋白(4∶1)孵育細(xì)胞，刺激apoB48的合成與分泌。同時(shí)，給藥組于頂孔中分別加入待測(cè)化合物，37℃、5％CO₂的條件下，在不完全DMEM培養(yǎng)基中共培養(yǎng)24h。

(2)蛋白提取和含量測(cè)定

細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，分別收集頂室和底室的培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解緩沖液，用移液槍吹打細(xì)胞至細(xì)胞完全脫落、裂解并釋放蛋白，離心(10,000～14,000g)約3～5min，取上清液于-80℃保存待測(cè)。

(3)ELISA測(cè)定Caco-2細(xì)胞apoB48的分泌

取細(xì)胞分泌液及裂解上清液，參照apoB48ELISA試劑盒說(shuō)明書，用酶標(biāo)儀在450nm下測(cè)定OD值，分別計(jì)算胞內(nèi)及胞外分泌的apoB48含量。

3.結(jié)果

青錢柳中三萜單體化合物對(duì)Caco-2細(xì)胞分泌和胞內(nèi)的apoB48調(diào)節(jié)作用如圖1所示。相比空白組，油酸刺激能夠增加Caco-2細(xì)胞分泌(圖1A)和胞內(nèi)合成(圖1B)的apoB48。圖1A中，與模型組比較，三萜苷元23、30、31、35、36、37、50和三萜皂苷14、18、19、22能顯著降低apoB48的分泌水平(p＜0.05)，其中化合物14、22、34、36、37、50降低apoB48水平達(dá)25.3％、26.8％、27.5％、25.1％、27.1％、27.3％，陽(yáng)性對(duì)照辛伐他汀同樣能顯著降低apoB48分泌水平(p＜0.05)；而34增加apoB48的分泌水平約27.5％(p＜0.01)?；衔?8、19和50顯著降低Caco-2細(xì)胞胞內(nèi)apoB48水平約29.7％、33.5％和35.3％(p＜0.05)，辛伐他汀給藥后，具有相似結(jié)果(p＜0.05)；而化合物47增加胞內(nèi)合成apoB48約17.8％(p＜0.05)；其它三萜化合物對(duì)胞內(nèi)apoB48水平影響較小，均無(wú)顯著性影響，如圖1B所示。