本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種通過給藥方式以及給藥劑量的過程，構(gòu)建一種口腔黏膜下纖維化小鼠模型的方法。

背景技術(shù)：

口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis，OSF)是一種慢性、隱匿性、具有惡變傾向的口腔黏膜病，可以發(fā)生口腔黏膜的任何部分。追蹤研究顯示，口腔黏膜下纖維化隨著檳榔的商業(yè)化發(fā)展，發(fā)病率逐年增加，但是目前臨床針對OSF尚無好的治療方法。因此OSF模型的研究一直受到重視?，F(xiàn)今國內(nèi)外關(guān)于OSF的動物模型研究的報道極少，極大的制約了OSF研究的進一步深入。1960年，Sirsat等采用2％的辣椒素在大鼠腭黏膜進行表面涂誘發(fā)出了OSF樣病變。但其病理表現(xiàn)欠典型，且無明顯的臨床表現(xiàn)。另有國內(nèi)外學(xué)者都通過在頰黏膜進行注射和表面涂布檳榔提取液的方式誘發(fā)了大、小鼠OSF，但是方法繁瑣且時間過長，基本都在600天以上，而且均未見明顯的后期玻璃樣變。因此，現(xiàn)有的OSF動物模型的構(gòu)建難以模擬人OSF發(fā)生發(fā)展的病變關(guān)系，而且無法滿足現(xiàn)今的基礎(chǔ)實驗要求。從目前文獻看，還未能獲得令人滿意的OSF模型。如果要探索OSF發(fā)生發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸，現(xiàn)有模型都不具有確實的可行性，可靠性。本模型首次采用高濃度檳榔堿飲水法進行建模，避免了注射和涂布可能造成的混雜因素影響，減少成模時間，提高了成摸成功率，而且誘發(fā)的OSF與人OSF具有高度相似性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種口腔黏膜下纖維化小鼠模型的構(gòu)建方法，建立小鼠與人類OSF具有高度相似性的OSF模型，該方法簡單，發(fā)病率高，誘導(dǎo)時間短，以該模型為基礎(chǔ)，為人類OSF的治療和防治提供有力的支持。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種口腔黏膜下纖維化小鼠模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)動物選擇及分組：取8周齡雄性Balb/c小鼠40只為實驗小鼠，并隨機平均分成實驗組和對照組；

(2)檳榔堿飲水劑配制：將常溫下保存的檳榔堿，用自來水配成濃度500～2000mg/L的檳榔堿飲水劑，將檳榔堿飲水劑置于實驗組小鼠飲水瓶內(nèi)自由飲用；對照組小鼠以自來水自由飲用；

(3)動物喂養(yǎng)及處死：實驗組采用檳榔堿飲水劑喂養(yǎng)8～20周，對照組同期給予自來水喂養(yǎng)，每4周隨機處死各組4只小鼠，20周剩余小鼠全部處死；

(4)實驗觀察：對實驗組和對照組分別進行一般觀察，處死小鼠后，取口腔黏膜組織，采取蘇木精—伊紅染色法觀察、MASSON三色染色和Van Gieson染色法觀察，免疫組化譜I/III型膠原蛋白與免疫組化CD34染色觀察；

(5)構(gòu)建小鼠OSF模型：通過步驟(1)至(4)步驟，得出檳榔堿化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立小鼠OSF模型，并建立檔案構(gòu)成模型。

優(yōu)選地，所述檳榔堿飲水劑的濃度為2000mg/L。

所述實驗小鼠為：8周齡雄性Balb/c小鼠，SPF級，體重(18.52±1.15)g，在室溫18～25℃、濕度30％～50％、標準飼料喂養(yǎng)、24h光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)。

所述一般觀察為：實驗過程中每天觀察小鼠精神狀況、活動度、飲水量等情況，每周記錄小鼠飲水量及體重變化。每4周處死小鼠后，觀察口腔內(nèi)變化，記錄口腔內(nèi)黏膜色澤，質(zhì)地等是否改變，是否有斑塊、潰瘍或腫物出現(xiàn)，觀察纖維條索的范圍、張口受限情況。

所述蘇木精–伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,簡稱HE染色)

觀察為：處死小鼠后立即取口腔組織黏膜(帶部分深部肌肉組織)，食管、胃、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸等組織，用10％的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4μm切片，蘇木素伊紅染色，進行組織病理學(xué)觀察?？谇火つげ∽兘M織按OSF病理學(xué)標準進行分期，即最早期、早期、中期、晚期。

所述MASSON三色染色和Van Gieson染色觀察為：處死小鼠取得口腔組織黏膜，用10％的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4μm切片，分別按MASSON試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)和Van Gieson試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)染色觀察口腔黏膜早期纖維變化情況。

所述免疫組化廣譜I/III型膠原蛋白觀察膠原情況與免疫組化CD34染色觀察上皮下血管數(shù)量為：采用免疫組化ABC法，按照常規(guī)操作：小鼠口腔黏膜組織蠟塊以4μm的厚度切片，經(jīng)水化，抑制內(nèi)源性過氧化物酶，消除非特異性染色后,分別滴加一抗CD34(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:100稀釋)、I型膠原蛋白(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:250稀釋)、III型膠原蛋白(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:180稀釋)、同時，陽性對照釆用對照組小鼠口腔黏膜組織,陰性對照釆用PBS代替一抗，4℃過夜；后期顯色采用SP試劑盒(羊抗鼠抗兔通用型，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色,脫水透明封片。結(jié)果判定：CD34陽性反應(yīng)物為淺棕色至深棕色顆粒，分布于血管內(nèi)皮細胞。結(jié)果判定：I、III型膠原蛋白陽性反應(yīng)物為淺棕色至深棕色顆粒，分布于黏膜固有層。

本發(fā)明口腔黏膜下纖維化小鼠模型的構(gòu)建方法，使用500～2000mg/L的檳榔堿飲水劑喂養(yǎng)Balb/c小鼠20周，獲得小鼠OSF模型與人類OSF具有高度相似性，即病變發(fā)生、發(fā)展的完整性，可以觀察到最早期-早期-中期-晚期OSF各階段的臨床癥狀和病理學(xué)表現(xiàn)。而且采用多種檢測方法，相互驗證，排除了其它相關(guān)口腔纖維病變的干擾，提高了診斷的準確性和可重復(fù)性。該動物模型發(fā)病率高(100％)、發(fā)病部位多樣化，口腔內(nèi)各部位黏膜均可發(fā)病，誘導(dǎo)的方法簡便自然，通過小鼠自由飲水，防止了物理刺激及其它化學(xué)藥物刺激的影響，效果理想，誘導(dǎo)時間短，為人類OSF的治療和防治提供有力的工具。

附圖說明

圖1：小鼠不同時間段舌部(舌根)黏膜的組織病理學(xué)變化(HE×200)圖。各時間段實驗組(D、E、F)與對照組(A、B、C)對比：可見上皮萎縮、黏膜固有層、黏膜下層膠原堆積和微血管病變，并隨給藥時間的延長，逐漸加重，最后可見固有層明顯的玻璃樣變。說明構(gòu)建模型成功。

圖2：不同時間段小鼠舌黏膜的膠原組織病理學(xué)變化(Masson×200，V.G×200)。對照組：Masson染色(A)和V.G染色(E)，膠原纖維細長，走向平直，排列疏松(黑色箭頭)；實驗組:8周Masson染色(A)和V.G染色(E)顯示少量藍染和紅染區(qū)域，隨給藥時間延長,12周Masson染色(C)和V.G染色(G)可見較為致密的膠原纖維帶，至16周Masson染色(D)和V.G染色(H)，緊貼著上皮下方的膠原排列成明顯致密的膠原纖維帶，膠原纖維與對照組相比明顯增多，膠原纖維染色顏色深且明顯，藍色區(qū)域和淡紅色區(qū)域相呼應(yīng)。

圖3：不同時間段I型膠原蛋白和III膠原蛋白在舌部表現(xiàn)(×200)。I型膠原蛋白(A-D)，III膠原蛋白(E-H)。正常舌黏膜(A，E)；8周(B，F(xiàn))；16周(C，G)；20周(D，H)。I型膠原與疾病的發(fā)展相一致，以呈彌漫的、散在的方式分布在固有層和黏膜下層(B-D)。8周III型膠原(F)在固有層輕微免疫陽性。到16周時，III型膠原明顯表達(G)，而在20周(H)表達完全喪失。

圖4：不同時間段血管計數(shù)。實驗組血管數(shù)量先緩慢增加，至第12周兩組對比有統(tǒng)計學(xué)意義，然后實驗組血管數(shù)量下降，至20周兩組對比有統(tǒng)計學(xué)意義(配對“t”檢驗，*<0.05)。

具體實施方式

實施例1

(1)動物選擇及分組：取8周齡雄性Balb/c小鼠40只為實驗小鼠，并隨機平均分成實驗組和對照組；

實驗小鼠的條件為：所述的實驗小鼠為：8周齡雄性Balb/c小鼠，SPF級，體重(18.52±1.15)g，在室溫18～25℃、濕度30％～50％、標準飼料喂養(yǎng)、24h光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)；

(2)檳榔堿飲水劑配制：將常溫下保存的檳榔堿(arecoline)，用自來水配成濃度2000mg/L藥物置于實驗組小鼠飲水瓶內(nèi)自由飲用。對照組小鼠以自來水自由飲用；

(3)動物喂養(yǎng)及處死：實驗組采用檳榔堿飲水劑喂養(yǎng)20周，對照組同期給予自來水喂養(yǎng)，每4周隨機處死各組4只小鼠，20周剩余小鼠全部處死；

(4)實驗觀察：對實驗組和對照組分別進行一般觀察，處死小鼠后，取口腔黏膜組織，采取蘇木精–伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,簡稱HE染色)觀察、MASSON三色染色和Van Gieson染色法觀察，免疫組化譜I/III型膠原蛋白與免疫組化CD34染色觀察；

一般觀察為：

實驗過程中每天觀察小鼠精神狀況、活動度、飲水量等情況，每周記錄小鼠飲水量及體重變化。每4周處死小鼠后，觀察口腔內(nèi)變化，記錄口腔內(nèi)黏膜色澤，質(zhì)地等是否改變，是否有斑塊、潰瘍或腫物出現(xiàn)，觀察纖維條索的范圍、張口受限情況。

HE染色觀察為：

處死小鼠后立即取口腔組織黏膜(帶部分深部肌肉組織)，食管、胃、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸等組織，用10％的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4μm切片，蘇木素伊紅染色，進行組織病理學(xué)觀察?？谇火つげ∽兘M織按OSF病理學(xué)標準進行分期，即最早期、早期、中期、晚期。

MASSON三色染色和Van Gieson染色觀察為：

處死小鼠取得口腔組織黏膜，用10％的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4μm切片，分別按MASSON試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)和Van Gieson試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)染色觀察口腔黏膜早期纖維變化情況。

免疫組化廣譜I/III型膠原蛋白觀察膠原情況與免疫組化CD34染色觀察上皮下血管數(shù)量為：

采用免疫組化ABC法，按照常規(guī)操作：小鼠口腔黏膜組織蠟塊以4μm的厚度切片,經(jīng)水化,抑制內(nèi)源性過氧化物酶,消除非特異性染色后,分別滴加一抗CD34(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:100稀釋)、I型膠原蛋白(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1：250稀釋)、III型膠原蛋白(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:180稀釋)、同時，陽性對照釆用對照組小鼠口腔黏膜組織,陰性對照釆用PBS代替一抗，4℃過夜；后期顯色采用SP試劑盒(羊抗鼠抗兔通用型，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色，脫水透明封片。結(jié)果判定：CD34陽性反應(yīng)物為淺棕色至深棕色顆粒，分布于血管內(nèi)皮細胞。結(jié)果判定：I、III型膠原蛋白陽性反應(yīng)物為淺棕色至深棕色顆粒，分布于黏膜固有層。

觀察結(jié)果(如圖1、2、3、4)：

實驗第2周起發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠出現(xiàn)體重下降，但第4周后發(fā)現(xiàn)體重緩慢增加，待實驗第8周后，實驗組小鼠體重趨于穩(wěn)定，平均體重為(17.52±1.15)g。對照組小鼠平均體重為(27.52±1.23)g。實驗組小鼠后期出現(xiàn)毛色暗啞，活動度降低，不愿進食等。對照組小鼠毛色鮮亮、食欲、活動度良好。實驗組小鼠口腔黏膜從實驗第8周起開始逐漸出現(xiàn)發(fā)白、僵硬，至實驗第20周所有小鼠黏膜均不同程度的出現(xiàn)上述變化，但未見明顯的纖維條索形成。對照組口腔黏膜顏色、質(zhì)地變化不明顯。隨著時間的推移,實驗組小鼠張口度逐漸減小，對照組小鼠張口度逐漸增加，從實驗第16周開始，兩組小鼠的張口度差異顯著。實驗組小鼠第8周起，舌部組織開始出現(xiàn)了OSF樣改變，12周后，頰腭部組織也出現(xiàn)了OSF樣改變。實驗組小鼠早期口腔黏膜上皮開始呈現(xiàn)異常正角化，角化層萎縮，纖維細胞可見飽滿的細胞核，淋巴細胞浸潤，固有層增厚，血管數(shù)量增加，血管充血明顯，管徑改變。隨用藥時間延長，上皮釘突逐漸變淺、小鼠，固有層厚度增厚越加明顯，上皮下血管出現(xiàn)先充血擴張后萎縮消失的漸變過程，藥物誘導(dǎo)至第20周，上皮厚度持續(xù)降低，可見萎縮性外觀。固有層膠原呈無序、波狀的外形排序纖維致密，細胞數(shù)量減少，基底層細胞破壞明顯。膠原纖維密度增加區(qū)域，可見類玻璃樣變。固有層血管缺乏，被纖維組織包繞，黏膜下肌肉可見纖維包裹，大多數(shù)情況可見肌層萎縮。Masson染色顯示膠原呈藍紫色分布，對照組少量染色陽性的藍紫色彈性纖維分布在黏膜固有層，膠原纖維細長，走向平直，排列疏松，較粗的彈性纖維發(fā)出許多微細長的纖維延伸至乳頭結(jié)締組織內(nèi)。這些彈性纖維的微細終末支在上皮的基底細胞下方交織成彈性纖維網(wǎng)。實驗組頰黏膜固有層厚度變寬，膠原纖維在此處沉積得厚而致密，粗細不等，緊貼著上皮下方的膠原排列成明顯致密的膠原纖維帶，隨著時間增加(8周、12周、16周)，膠原纖維與對照組相比明顯增多，膠原纖維染色后顏色亦變的更深。此外，通過Van Gieson染色顯示鮮紅色的密集膠原與Masson染色相對應(yīng)，并有類似的膠原變化，相互印證。由以上結(jié)果可知，8周時，舌部組織出現(xiàn)OSF早期病變，12周時，頰、腭部組織相繼出現(xiàn)OSF早期病變，至16周，舌、腭、頰部組織出現(xiàn)OSF中期病變，誘導(dǎo)致20周，舌、腭部組織出現(xiàn)OSF晚期病變。通過CD34計數(shù)上皮下血管數(shù)量，在顯微鏡高倍視野下對實驗、對照組小鼠口腔黏膜下血管進行計數(shù)后發(fā)現(xiàn)：隨著時間增加，2組血管數(shù)量均逐漸增加，而且實驗組增加更為明顯，到12周后，2組血管數(shù)量差異明顯，表現(xiàn)為實驗組血管計數(shù)明顯多于對照組；但是隨著給藥時間延長，實驗組血管數(shù)量反而開始出現(xiàn)下降，到20周時2組血管差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組表現(xiàn)為明顯減少。與臨床人OSF血管變化相一致。通過I、III型膠原含量半定量分析，發(fā)現(xiàn)I型膠原隨誘導(dǎo)時間延長，含量明顯增加，與對照組差異明顯，而III型膠原無明顯變化，這與人OSF I、III型病變一致，均表現(xiàn)為膠原堆積增加，降解減少為主的膠原病變情況。

(5)構(gòu)建小鼠OSF模型：通過步驟(1)至(4)，得出檳榔堿化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立小鼠OSF模型，并建立檔案構(gòu)成模型。

實施例2

(1)動物選擇及分組：取8周齡雄性Balb/c小鼠40只為實驗小鼠，并隨機平均分成實驗組和對照組；

實驗小鼠的條件為：所述的實驗小鼠為：8周齡雄性Balb/c小鼠，SPF級，體重(18.52±1.15)g，在室溫18～25℃、濕度30％～50％、標準飼料喂養(yǎng)、24h光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)；

(2)檳榔堿飲水劑配制：將常溫下保存的檳榔堿(arecoline)，用自來水配成濃度500mg/L藥物置于實驗組小鼠飲水瓶內(nèi)自由飲用。對照組小鼠以自來水自由飲用；

(3)動物喂養(yǎng)及處死：實驗組采用檳榔堿飲水劑喂養(yǎng)20周，對照組同期給予自來水喂養(yǎng)，每4周隨機處死各組4只小鼠，20周剩余小鼠全部處死；

(4)實驗觀察：對實驗組和對照組分別進行一般觀察，處死小鼠后，取口腔黏膜組織，采取蘇木精–伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,簡稱HE染色)觀察、MASSON三色染色和Van Gieson染色法觀察，免疫組化譜I/III型膠原蛋白與免疫組化CD34染色觀察；

一般觀察為：

實驗過程中每天觀察小鼠精神狀況、活動度、飲水量等情況，每周記錄小鼠飲水量及體重變化。每4周處死小鼠后，觀察口腔內(nèi)變化，記錄口腔內(nèi)黏膜色澤，質(zhì)地等是否改變，是否有斑塊、潰瘍或腫物出現(xiàn)，觀察纖維條索的范圍、張口受限情況。

HE染色觀察為：

處死小鼠后立即取口腔組織黏膜(帶部分深部肌肉組織)，食管、胃、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸等組織，用10％的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4μm切片，蘇木素伊紅染色，進行組織病理學(xué)觀察?？谇火つげ∽兘M織按OSF病理學(xué)標準進行分期，即最早期、早期、中期、晚期。

MASSON三色染色和Van Gieson染色觀察為：

處死小鼠取得口腔組織黏膜，用10％的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4μm切片，分別按MASSON試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)和Van Gieson試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)染色觀察口腔黏膜早期纖維變化情況。

免疫組化廣譜I/III型膠原蛋白觀察膠原情況與免疫組化CD34染色觀察上皮下血管數(shù)量為：

采用免疫組化ABC法，按照常規(guī)操作：小鼠口腔黏膜組織蠟塊以4μm的厚度切片,經(jīng)水化,抑制內(nèi)源性過氧化物酶,消除非特異性染色后,分別滴加一抗CD34(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:100稀釋)、I型膠原蛋白(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1：250稀釋)、III型膠原蛋白(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:180稀釋)、同時，陽性對照釆用對照組小鼠口腔黏膜組織,陰性對照釆用PBS代替一抗，4℃過夜；后期顯色采用SP試劑盒(羊抗鼠抗兔通用型，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色，脫水透明封片。結(jié)果判定：CD34陽性反應(yīng)物為淺棕色至深棕色顆粒，分布于血管內(nèi)皮細胞。結(jié)果判定：I、III型膠原蛋白陽性反應(yīng)物為淺棕色至深棕色顆粒，分布于黏膜固有層。

觀察結(jié)果(如圖1、2、3、4)：

實驗第6周起發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠出現(xiàn)體重下降，但第8周后發(fā)現(xiàn)體重緩慢增加，待實驗第10周后，實驗組小鼠體重趨于穩(wěn)定，平均體重為(19.31±0.87)g。對照組小鼠平均體重為(26.89±1.57)g。實驗組小鼠后期出現(xiàn)毛色暗啞，活動度降低，不愿進食等。對照組小鼠毛色鮮亮、食欲、活動度良好。實驗組小鼠口腔黏膜從實驗第14周起開始逐漸出現(xiàn)發(fā)白、僵硬，至實驗第20周所有小鼠黏膜均不同程度的出現(xiàn)上述變化，但未見明顯的纖維條索形成。對照組口腔黏膜顏色、質(zhì)地變化不明顯。隨著時間的推移,實驗組小鼠張口度逐漸減小，對照組小鼠張口度逐漸增加，至實驗第20周，兩組小鼠的張口度差異顯著。實驗組小鼠第12周起，舌部組織開始出現(xiàn)了OSF樣改變，16周后，頰腭部組織也出現(xiàn)了OSF樣改變。實驗組小鼠早期口腔黏膜上皮開始呈現(xiàn)異常正角化，角化層萎縮，纖維細胞可見飽滿的細胞核，淋巴細胞浸潤，固有層增厚，血管數(shù)量增加，血管充血明顯，管徑改變。隨用藥時間延長，上皮釘突逐漸變淺、小鼠，固有層厚度增厚越加明顯，上皮下血管出現(xiàn)先充血擴張后萎縮消失的漸變過程，藥物誘導(dǎo)至第20周，上皮厚度持續(xù)降低，可見萎縮性外觀。固有層膠原呈無序、波狀的外形排序纖維致密，細胞數(shù)量減少，基底層細胞破壞明顯。膠原纖維密度增加區(qū)域，但未見明顯類玻璃樣變。固有層血管缺乏，被纖維組織包繞，黏膜下肌肉可見纖維包裹，大多數(shù)情況可見肌層萎縮。Masson染色顯示膠原呈藍紫色分布，對照組少量染色陽性的藍紫色彈性纖維分布在黏膜固有層，膠原纖維細長，走向平直，排列疏松，較粗的彈性纖維發(fā)出許多微細長的纖維延伸至乳頭結(jié)締組織內(nèi)。這些彈性纖維的微細終末支在上皮的基底細胞下方交織成彈性纖維網(wǎng)。實驗組頰黏膜固有層厚度變寬，膠原纖維在此處沉積得厚而致密，粗細不等，緊貼著上皮下方的膠原排列成明顯致密的膠原纖維帶，隨著時間增加(12周、16周、20周)，膠原纖維與對照組相比明顯增多，膠原纖維染色后顏色亦變的更深。此外，通過Van Gieson染色顯示鮮紅色的密集膠原與Masson染色相對應(yīng)，并有類似的膠原變化，相互印證。由以上結(jié)果可知，12周時，舌部組織出現(xiàn)OSF早期病變，16周時，頰、腭部組織相繼出現(xiàn)OSF早期病變，至20周，舌、腭部組織出現(xiàn)OSF中期病變。通過CD34計數(shù)上皮下血管數(shù)量，在顯微鏡高倍視野下對實驗、對照組小鼠口腔黏膜下血管進行計數(shù)后發(fā)現(xiàn)：隨著時間增加，2組血管數(shù)量均逐漸增加，而且實驗組增加更為明顯，到16周后，2組血管數(shù)量差異明顯，表現(xiàn)為實驗組血管計數(shù)明顯多于對照組；但是隨著給藥時間延長，實驗組血管數(shù)量反而開始出現(xiàn)下降，到20周時2組血管差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組表現(xiàn)為明顯減少。與臨床人OSF血管變化相一致。通過I、III型膠原含量半定量分析，發(fā)現(xiàn)I型膠原隨誘導(dǎo)時間延長，含量明顯增加，與對照組差異明顯，而III型膠原無明顯變化，這與人OSF I、III型病變一致，均表現(xiàn)為膠原堆積增加，降解減少為主的膠原病變情況。

(5)構(gòu)建小鼠OSF模型：通過步驟(1)至(4)，得出檳榔堿化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立小鼠OSF模型，并建立檔案構(gòu)成模型。

實施例3

(1)動物選擇及分組：取8周齡雄性Balb/c小鼠40只為實驗小鼠，并隨機平均分成實驗組和對照組；

實驗小鼠的條件為：所述的實驗小鼠為：8周齡雄性Balb/c小鼠，SPF級，體重(18.52±1.15)g，在室溫18～25℃、濕度30％～50％、標準飼料喂養(yǎng)、24h光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)；

(2)檳榔堿飲水劑配制：將常溫下保存的檳榔堿(arecoline)，用自來水配成濃度1000mg/L藥物置于實驗組小鼠飲水瓶內(nèi)自由飲用。對照組小鼠以自來水自由飲用；

(3)動物喂養(yǎng)及處死：實驗組采用檳榔堿飲水劑喂養(yǎng)20周，對照組同期給予自來水喂養(yǎng)，每4周隨機處死各組4只小鼠，20周剩余小鼠全部處死；

(4)實驗觀察：對實驗組和對照組分別進行一般觀察，處死小鼠后，取口腔黏膜組織，采取蘇木精–伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,簡稱HE染色)觀察、MASSON三色染色和Van Gieson染色法觀察，免疫組化譜I/III型膠原蛋白與免疫組化CD34染色觀察；

一般觀察為：

實驗過程中每天觀察小鼠精神狀況、活動度、飲水量等情況，每周記錄小鼠飲水量及體重變化。每4周處死小鼠后，觀察口腔內(nèi)變化，記錄口腔內(nèi)黏膜色澤，質(zhì)地等是否改變，是否有斑塊、潰瘍或腫物出現(xiàn)，觀察纖維條索的范圍、張口受限情況。

HE染色觀察為：

處死小鼠后立即取口腔組織黏膜(帶部分深部肌肉組織)，食管、胃、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸等組織，用10％的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4μm切片，蘇木素伊紅染色，進行組織病理學(xué)觀察?？谇火つげ∽兘M織按OSF病理學(xué)標準進行分期，即最早期、早期、中期、晚期。

MASSON三色染色和Van Gieson染色觀察為：

處死小鼠取得口腔組織黏膜，用10％的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4μm切片，分別按MASSON試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)和Van Gieson試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)染色觀察口腔黏膜早期纖維變化情況。

免疫組化廣譜I/III型膠原蛋白觀察膠原情況與免疫組化CD34染色觀察上皮下血管數(shù)量為：

采用免疫組化ABC法，按照常規(guī)操作：小鼠口腔黏膜組織蠟塊以4μm的厚度切片,經(jīng)水化,抑制內(nèi)源性過氧化物酶,消除非特異性染色后,分別滴加一抗CD34(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:100稀釋)、I型膠原蛋白(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1：250稀釋)、III型膠原蛋白(小鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，按1:180稀釋)、同時，陽性對照釆用對照組小鼠口腔黏膜組織,陰性對照釆用PBS代替一抗，4℃過夜；后期顯色采用SP試劑盒(羊抗鼠抗兔通用型，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色，脫水透明封片。結(jié)果判定：CD34陽性反應(yīng)物為淺棕色至深棕色顆粒，分布于血管內(nèi)皮細胞。結(jié)果判定：I、III型膠原蛋白陽性反應(yīng)物為淺棕色至深棕色顆粒，分布于黏膜固有層。

觀察結(jié)果(如圖1、2、3、4)：

實驗第3周起發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠出現(xiàn)體重下降，但第5周后發(fā)現(xiàn)體重緩慢增加，待實驗第6周后，實驗組小鼠體重趨于穩(wěn)定，平均體重為(18.12±0.32)g。對照組小鼠平均體重為(27.24±1.43)g。實驗組小鼠后期出現(xiàn)毛色暗啞，活動度降低，不愿進食等。對照組小鼠毛色鮮亮、食欲、活動度良好。實驗組小鼠口腔黏膜從實驗第12周起開始逐漸出現(xiàn)發(fā)白、僵硬，至實驗第20周所有小鼠黏膜均不同程度的出現(xiàn)上述變化，但未見明顯的纖維條索形成。對照組口腔黏膜顏色、質(zhì)地變化不明顯。隨著時間的推移,實驗組小鼠張口度逐漸減小，對照組小鼠張口度逐漸增加，從實驗第18周開始，兩組小鼠的張口度差異顯著。實驗組小鼠第8周起，舌部組織開始出現(xiàn)了OSF樣改變，12周后，頰腭部組織也出現(xiàn)了OSF樣改變。實驗組小鼠早期口腔黏膜上皮開始呈現(xiàn)異常正角化，角化層萎縮，纖維細胞可見飽滿的細胞核，淋巴細胞浸潤，固有層增厚，血管數(shù)量增加，血管充血明顯，管徑改變。隨用藥時間延長，上皮釘突逐漸變淺、小鼠，固有層厚度增厚越加明顯，上皮下血管出現(xiàn)先充血擴張后萎縮消失的漸變過程，藥物誘導(dǎo)至第20周，上皮厚度持續(xù)降低，可見萎縮性外觀。固有層膠原呈無序、波狀的外形排序纖維致密，細胞數(shù)量減少，基底層細胞破壞明顯。膠原纖維密度增加區(qū)域，腭部可見類玻璃樣變。固有層血管缺乏，被纖維組織包繞，黏膜下肌肉可見纖維包裹，大多數(shù)情況可見肌層萎縮。Masson染色顯示膠原呈藍紫色分布，對照組少量染色陽性的藍紫色彈性纖維分布在黏膜固有層，膠原纖維細長，走向平直，排列疏松，較粗的彈性纖維發(fā)出許多微細長的纖維延伸至乳頭結(jié)締組織內(nèi)。這些彈性纖維的微細終末支在上皮的基底細胞下方交織成彈性纖維網(wǎng)。實驗組頰黏膜固有層厚度變寬，膠原纖維在此處沉積得厚而致密，粗細不等，緊貼著上皮下方的膠原排列成明顯致密的膠原纖維帶，隨著時間增加(8周、12周、16周)，膠原纖維與對照組相比明顯增多，膠原纖維染色后顏色亦變的更深。此外，通過Van Gieson染色顯示鮮紅色的密集膠原與Masson染色相對應(yīng)，并有類似的膠原變化，相互印證。由以上結(jié)果可知，8周時，舌部組織出現(xiàn)OSF早期病變，12周時，頰、腭部組織相繼出現(xiàn)OSF早期病變，至16周，舌、腭部組織出現(xiàn)OSF中期病變，誘導(dǎo)致20周，舌、頰部處于OSF中期病變，腭部組織出現(xiàn)OSF晚期病變。通過CD34計數(shù)上皮下血管數(shù)量，在顯微鏡高倍視野下對實驗、對照組小鼠口腔黏膜下血管進行計數(shù)后發(fā)現(xiàn)：隨著時間增加，2組血管數(shù)量均逐漸增加，而且實驗組增加更為明顯，到12周后，2組血管數(shù)量差異明顯，表現(xiàn)為實驗組血管計數(shù)明顯多于對照組；但是隨著給藥時間延長，實驗組血管數(shù)量反而開始出現(xiàn)下降，到20周時2組血管差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗組表現(xiàn)為明顯減少。與臨床人OSF血管變化相一致。通過I、III型膠原含量半定量分析，發(fā)現(xiàn)I型膠原隨誘導(dǎo)時間延長，含量明顯增加，與對照組差異明顯，而III型膠原無明顯變化，這與人OSF I、III型病變一致，均表現(xiàn)為膠原堆積增加，降解減少為主的膠原病變情況。

(5)構(gòu)建小鼠OSF模型：通過步驟(1)至(4)，得出檳榔堿化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立小鼠OSF模型，并建立檔案構(gòu)成模型。

本發(fā)明口腔黏膜下纖維化小鼠模型的構(gòu)建方法分別采用濃度500mg/L、1000mg/L、2000mg/L的檳榔堿飲水劑喂養(yǎng)小鼠，通過三種實施例的結(jié)果與常規(guī)注射和涂布檳榔提取液誘導(dǎo)小鼠對比，對比數(shù)據(jù)如表1所示，從表1中可以看出：采用本發(fā)明口腔黏膜下纖維化小鼠模型的構(gòu)建方法成功獲得小鼠OSF模型與人類OSF具有高度相似性，即病變發(fā)生、發(fā)展的完整性，該動物模型發(fā)病率高(100％)，且成模時間短。

表1 本發(fā)明采用三個實施例與常規(guī)誘導(dǎo)數(shù)據(jù)比較

以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。