專利名稱：胃腸腫瘤診斷和預(yù)示的新分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種胃腸癌癥標(biāo)志物及 其用途，胃腸道癌癥診斷、動(dòng)態(tài)檢測以及預(yù)后判斷的試劑或試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
近年來惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)上升，其中60%以上為消化系統(tǒng)腫瘤，以胃癌、大腸 癌最為常見。在全球范圍內(nèi)，胃癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中僅次于肺癌占第二位，在女性惡 性腫瘤中居第四位。而在我國死亡率居惡性腫瘤首位，年平均死亡率為每10萬人口中有 25. 53人。大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是近幾十年來發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)在世界大多數(shù)國家和 地區(qū)上升最快的腫瘤之一。近年的流行病學(xué)資料顯示，大腸癌已上升為全球第三位最常見 的癌癥，2000年全世界有70萬人患大腸癌，其中50萬人因此而死亡。早期發(fā)現(xiàn)胃腸道腫瘤，早期治療，是提高胃腸道惡性腫瘤療效的關(guān)鍵。腫瘤分期 越高，則表明發(fā)現(xiàn)越晚。據(jù)國外資料報(bào)道I、II、III、IV期直腸癌患者5年生存率則分別為 93%、84%、44%和8%。但是胃腸道惡性腫瘤的臨床癥狀常常不典型，往往被我們自認(rèn)為是 我們常說的胃炎、胃潰瘍、消化不良、便秘等，從而延誤診斷和治療。目前中國臨床診斷多為癥狀性篩選，即出現(xiàn)腹部不適、隱痛、泛酸、噯氣或消瘦、黑 便等癥狀后進(jìn)行內(nèi)鏡等檢查，最終檢出的癌絕大部分為進(jìn)展期癌?，F(xiàn)有的診斷方法如血清 學(xué)免疫檢測通常使用的標(biāo)志物如CEA、CA系列抗原，普遍存在靈敏度低、特異性差，尤其對 早期癌檢出率、有效性都很低。常用的細(xì)胞學(xué)檢測雖然低廉簡便，靈敏度同樣偏低，而影像 學(xué)檢測僅對有較大占位的惡變腫瘤有很高的診斷率。中國是發(fā)展中的人口大國，經(jīng)濟(jì)條件 欠發(fā)達(dá)，開展以影像為主的全民性普查篩選困難重重。另外，多數(shù)胃腸道癌癥患者臨床確診 時(shí)已屬中晚期，如何進(jìn)行手術(shù)后病人預(yù)后的監(jiān)測和有效治療方法的選擇，是改善預(yù)后的有 效方法。發(fā)展具有高靈敏度、特異性強(qiáng)的胃腸道診斷產(chǎn)品，是提高胃腸癌癥早期檢出率、 改善患者預(yù)后的關(guān)鍵之一。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，作為組織蛋白酶的天然抑制蛋白 Cystatin基因家族與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。在組織和體液中，Cystatin家族蛋白可逆 性地結(jié)合半胱氨酸蛋白酶，防止組織蛋白酶的活性過度。Cystatin C是組織蛋白酶B最強(qiáng) 的抑制蛋白，但是在卵巢癌和頭頸部癌癥中，cystatin C的表達(dá)有不同水平的上升。而在非 小細(xì)胞肺癌中，stefin A (cystatin家族成員)的表達(dá)水平有所增加；在腦膜瘤中，stef inB 在mRNA水平上有明顯降低；cystatin F(亦稱為Ieukocystatin或CMAP)在多種腫瘤中的 表達(dá)水平都有顯著增加。研究結(jié)果顯示，cystatin的幾個(gè)家族成員在不同腫瘤中的表達(dá)水 平有所上升，很可能是由于在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中需要組織蛋白酶的參與，先誘導(dǎo)其表達(dá) 量增加，再激活機(jī)體本身的應(yīng)激機(jī)制，導(dǎo)致cystatin的表達(dá)量上升以抑制過盛的蛋白酶活 性。但cystatin的表達(dá)量并不與腫瘤的發(fā)展成正相關(guān)的關(guān)系，因?yàn)樵谀z質(zhì)瘤中，cystatin C的低表達(dá)意味著疾病的晚期，病人的生存期較短，且易于復(fù)發(fā)，該結(jié)論在mRNA和蛋白水平 上都得到了驗(yàn)證。
本發(fā)明證實(shí)cystatin家族成員CSTl及其剪切子的表達(dá)水平與胃腸道腫瘤關(guān)系密 切。CST1，又名cystatin SN，是半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)家族成員，含141個(gè)氨 基酸，2個(gè)二硫鍵，16. 4Kda，分布于多種體液和分泌物中，如眼淚、唾液、血清、血漿等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種預(yù)示和提供診斷胃腸腫瘤信息的檢測方法，解決了現(xiàn)有 技術(shù)中胃腸腫瘤難以早期檢測的難題。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種提供胃腸腫瘤易感性信息的檢測方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)獲取待測樣品；(2)測定選自下列編碼mRNA或cDNA的基因在樣品中的表達(dá)水平是否過表達(dá)，所 述基因?yàn)榫哂蠸EQ ID No 39的CSTl基因；或特異性識別CSTl基因的mRNA、CSTl剪切子、 CSTl基因的cDNA、CSTl剪切子的cDNA的其中一種的引物或/和探針?biāo)R別的基因；或通過 至少一種CSTl剪切子引物對應(yīng)的擴(kuò)增子所鑒定的基因。其中CSTlmRNA有2中剪切拼接方 式，第一種(splicel) (SEQ ID No :43)，包含 CSTl 外顯子 1 ((SEQ ID No :40)、外顯子 2 (SEQ ID No :41)、外顯子3(SEQ ID No 42)；而第二種剪切方式(splice2) (SEQ ID No 44)僅包 含CSTl外顯子1( (SEQ ID No 40)和外顯子2 (SEQ ID No 41)；當(dāng)基因表達(dá)水平超過預(yù)定 閾值時(shí)則預(yù)示胃腸腫瘤易感或形成。優(yōu)選的，所述引物為具有SEQ ID No :1 2或SEQ ID No :4 21至少之一序列的 引物；所述探針為具有SEQ ID No 3序列的探針。優(yōu)選的，所述CSTl第一個(gè)剪切子引物對應(yīng)的擴(kuò)增子具有SEQ ID No 45的序列。優(yōu)選的，所述方法中特異性引物是具有SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示的序列 形成的引物對以及具有SEQ ID No :3所示序列的探針。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中檢測表達(dá)水平的方法采用基于核酸序列擴(kuò)增法的體 外RNA擴(kuò)增技術(shù)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中檢測表達(dá)水平的方法采用實(shí)時(shí)定量PCR法，所述實(shí)時(shí) 定量PCR法選自基于非特異性雙核苷酸染料的實(shí)時(shí)PCR或基于特殊熒光探針的實(shí)時(shí)PCR。本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測胃腸功能的試劑盒，其特征在于所述試劑盒 包括用于捕獲SEQ ID No 39的CSTl基因和/或CSTl基因剪切子(SEQ ID No :43，44)的 引物或探針以及使CSTl和/或其剪切子及其捕獲引物或探針混合物可視化的反應(yīng)試劑。優(yōu)選的，所述反應(yīng)試劑通過選自瓊脂糖凝膠電泳、酶聯(lián)凝膠法、電化學(xué)發(fā)光技術(shù)、 原位雜交技術(shù)、熒光檢測法使CSTl和/或其剪切子及其捕獲引物或探針混合物可視。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括作為陽性參照品的胃癌細(xì)胞株、作為陰性參照品的正 常的胃細(xì)胞株、核酸提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、聚合酶鏈反應(yīng)試劑。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)該基因異常表達(dá)和胃腸癌具有密切的相關(guān)性，并根據(jù)該相關(guān)性提 供了基于特異性分子Marker的，用于診斷胃腸疾病、監(jiān)控胃腸疾病、監(jiān)控胃腸疾病治療效 果以及監(jiān)控和評價(jià)胃腸癌是否轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的測定法、試劑盒及其使用方法，從而為胃腸癌癥 提供有效的分子診斷標(biāo)記或評價(jià)胃腸癌癥是否轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記或判斷胃腸癌癥患者預(yù)后 的分子標(biāo)記，這些可以用于胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種CSTl基因的用途，用于制備胃腸癌癥診斷、 動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷的試劑或試劑盒。檢測方法包括檢測CSTl mRNA和/或CSTl剪切子過表達(dá)或檢測CSTl cDNA和/ 或CSTl剪切子CDNA過表達(dá)。優(yōu)選的，檢測方法包括使用至少一對能特異性結(jié)合CSTlmRNA和/或CSTl剪切子 的引物和/或一條至少與部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互補(bǔ)的寡聚核苷酸。優(yōu)選的，檢測方法包括使用至少一對能特異性結(jié)合CSTl cDNA和/或CSTl剪切子 cDNA的引物和/或一條至少與部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互補(bǔ)的寡聚核苷酸。優(yōu)選的，檢測方法包括基于核酸序列擴(kuò)增法(Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)的體外 RNA 擴(kuò)增技術(shù)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(Transcription-median amplification, TMA)、連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction, LCR)、適溫鏈置換 反應(yīng)(thermophilicstrand displacement amplification, tSDA)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction, PCR)、最佳的是實(shí)時(shí)定量 PCR(quantitative real-time PCR)。優(yōu)選的，實(shí)時(shí)定量PCR包括基于非特異性雙核苷酸染料如SYBR Green的實(shí)時(shí)PCR、 基于特殊熒光探針的實(shí)時(shí)PCR。優(yōu)選的，檢測方法進(jìn)一步包括使CSTl和/或其剪切子及其捕獲試劑混合物可視化 的反應(yīng)試劑。本發(fā)明提供了一種檢測受試者樣品胃腸功能的方法，該方法包括檢測所述樣品中 CSTl mRNA和/或CSTl剪切子的水平。優(yōu)選的，所述檢測進(jìn)一步包括診斷所述受試者的胃、腸疾病，監(jiān)控所述受試者的 胃、腸疾病，判斷所述受試者的胃、腸疾病的預(yù)后，監(jiān)控給予所述受試者的胃、腸疾病治療的 效果，分期所述受試者的癌癥。優(yōu)選的，所述受試者包括胃、腸不適就醫(yī)者，慢性胃炎、腸炎患者，有家族性胃、腸 道癌癥者，且所述的檢測進(jìn)一步包括對受試者進(jìn)行篩查以檢測胃、腸道癌癥。優(yōu)選的，所述 受試者為胃、腸道癌癥患者，且所述的檢測進(jìn)一步包括監(jiān)控所述受試者的胃、腸癌癥，判斷 所述受試者的預(yù)后，監(jiān)控給予所述受試者的治療效果。優(yōu)選的，所述檢測方法進(jìn)一步包括定量所述樣品中CSTl mRNA和/或CSTl剪切子 的水平。優(yōu)選的，檢測方法包括使用至少一對能特異性結(jié)合CSTlmRNA和/或CSTl剪切子 的引物和/或一條至少與部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互補(bǔ)的寡聚核苷酸。優(yōu)選的，檢測方法包括定量檢測CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA過表達(dá)的水平。優(yōu)選的，檢測方法包括使用至少一對能特異性結(jié)合CSTl cDNA和/或CSTl剪切子 cDNA的引物和/或一條至少與部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互補(bǔ)的寡聚核苷酸。所述方法中所述待測樣品包括手術(shù)組織、鏡檢組織、淋巴結(jié)組織、骨髓、血清樣 品、血漿樣品、尿樣、血樣、全血樣品、血液級分樣品。優(yōu)選的檢測方法，包括基于核酸序
5列擴(kuò)增法(Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)的體外RNA擴(kuò)增技術(shù)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo) W Γ ii (Transcription-median amplification, TMA) >Slljl Jx. IS (Ligase chain reaction, LCR)、適溫鏈置換反應(yīng)(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、最佳的是實(shí)時(shí)定量 PCR(quantitativereal-time PCR)。實(shí)時(shí)定量PCR，包括基于非特異性雙核苷酸染料如SYBR Green的實(shí)時(shí)PCR、基于特 殊熒光探針的實(shí)時(shí)PCR。也可以進(jìn)一步包括使CSTl和/或其剪切子及其捕獲試劑混合物可 視化的反應(yīng)試劑?！N用于胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷的試劑或材料，所述的試劑選自 下組CST1基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性引物；和/或CSTl基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性識別探針或表 面固定有所述探針的芯片。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是引物，所述的引物是針對CSTl外顯子的引物。更 優(yōu)選的優(yōu)選例中，所述的引物是針對CSTl基因第一個(gè)剪切子(SEQ ID No 43)的特異性引 物；或所述的引物是針對CSTl第二個(gè)剪切(SEQ ID No 44)子的特異性引物；或所述的引物 是針對 CSTl 基因的外顯子 1 (Exonl) (SEQ ID No 40)和外顯子 2(Exon2) (SEQ ID No 41) 的特異性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子1和外顯子2)；或所述的引物是針對CSTl基因的外 顯子I(Exonl)和外顯子3(Εχοη3) (SEQ ID No 42)的特異性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子 1和外顯子3)；或所述的引物是針對CSTl基因的外顯子2 (Εχοη2)和外顯子3(Εχοη3)的特 異性引物(即擴(kuò)增產(chǎn)物跨越外顯子2和外顯子3)。優(yōu)選的引物是針對CSTl基因第一個(gè)剪切子的外顯子1的特異性引物。在另一優(yōu) 選例中，所述的特異性引物是具有SEQ ID No :1和SEQID No :2所示的序列的引物對以及 SEQ ID No 3 的探針。一種用于預(yù)示或檢測胃腸腫瘤的基因芯片，其特征在于所述基因芯片包括用于捕 獲對應(yīng)于SEQ ID No 39的CSTl基因或?qū)?yīng)于SEQ ID No :43的CSTl基因第一個(gè)剪切子的 引物或探針。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了檢測受試者樣品的方法，包括檢測樣品中CSTl 第一個(gè)剪切子mRNA的水平。根據(jù)本發(fā)明所述的第一個(gè)方面優(yōu)選實(shí)施方案中的特征，檢測包 括診斷受試者的胃腸疾病，監(jiān)控受試者的胃腸疾病，監(jiān)控受試者胃腸疾病治療效果，受試者 癌癥分期或樣品中CSTl第一個(gè)剪切子mRNA的水平。根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的特征，受試者為胃腸部不適就醫(yī)者，且檢測包括對受試者 進(jìn)行篩查以檢測胃腸癌癥。根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的特征，受試者為慢性胃炎、腸炎患者，且 檢測包括對受試者進(jìn)行篩查以檢測胃腸癌癥。根據(jù)本發(fā)明更進(jìn)一步的特征，受試者有家族 性胃腸癌癥，且檢測包括對受試者進(jìn)行篩查以檢測胃腸癌癥。根據(jù)如下所述的優(yōu)選方案，樣 品包括胃腸手術(shù)、胃腸鏡、淋巴結(jié)、骨髓、血清、血漿、血樣、尿樣。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案的特征， 血樣可包括全血樣品或血液級分樣品。本發(fā)明的另外方面提供了胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷的試劑盒，所述 的試劑盒中含有針對CSTl基因的至少一對引物和一條探針。根據(jù)如下所述的優(yōu)選方案， 試劑盒中的引物對為SEQ ID No 1和SEQ ID No :2，探針為SEQ ID No :3。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有胃癌細(xì)胞株和正常的胃細(xì)胞株分別作為陽性和陰性參照品，其中優(yōu)選方案為胃癌細(xì)胞株(NCI-N87)，人胃上皮細(xì)胞株(GES-I)； CSTl重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有腸癌細(xì)胞株和不表達(dá)CSTl的腸癌 細(xì)胞株分別作為陽性和陰性參照品，其中優(yōu)選方案為腸癌細(xì)胞株(SW480)，腸癌細(xì)胞株 (HCT116) ；CSTl重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有核酸提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、聚合酶鏈 反應(yīng)(PCR)試劑、描述胃癌診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷方法的說明書。根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選方案的更進(jìn)一步的特征，檢測試劑盒可用于實(shí)際場所，包 括但不限于醫(yī)院、診所以及私人住宅。根據(jù)本發(fā)明的另一面，提供用于根據(jù)受試者樣品評價(jià)受試者是否為胃腸癌癥，或 胃腸癌癥是否轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的測定法，包括針對CSTl基因的至少一對引物和一條探針，取自樣 品中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑，由此能評估是否為胃腸癌癥、治療效 果如何以及是否轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。優(yōu)選的檢測試劑盒由以下幾個(gè)部分組成CST1和/或其剪切子的捕獲物；一種使 CSTl和/或其剪切子及其捕獲試劑混合物可視化的方法；反應(yīng)試劑以及使用說明書。其中 所述CSTl和/或其剪切子的捕獲物包括至少一對能特異性結(jié)合CSTlmRNA和/或CSTl剪 切子的引物和/或一條至少與部分CSTlmRNA和/或CSTl剪切子互補(bǔ)的寡聚核苷酸。其中 所述CSTl和/或其剪切子的捕獲物也可以包括至少一對能特異性結(jié)合CSTl cDNA和/或 CSTl剪切子cDNA的引物和/或一條至少與部分CSTl cDNA和/或CSTl剪切子cDNA互補(bǔ) 的寡聚核苷酸。所述使CSTl和/或其剪切子及其捕獲試劑混合物可視化的方法，包括瓊 脂糖凝膠電泳、酶聯(lián)凝膠法(enzyme-linked gel assay, ELGA)、電化學(xué)發(fā)光技術(shù) (electroluminescence，ECL)、原位雜交技術(shù)(in situ hybridization，ISH)、熒光檢測法。 可以按照如下步驟進(jìn)行檢測從受試者處獲得樣品；檢測樣品中CSTlmRNA和/或其剪切子 水平；檢測結(jié)果與對照樣本中CSTl水平比較，從而判斷受試者胃腸狀況。所述的樣品包括 手術(shù)組織、鏡檢組織、淋巴結(jié)組織、骨髓、血清樣品、血漿樣品、尿樣、血樣、全血樣品、血液級 分樣品。對照樣品，包括正常人樣品、患者治療的不同階段的樣品。受試者胃腸狀況可以分 為正常、炎、癌，改善、未改善，治療措施有效、無效。本發(fā)明的檢測試劑盒可以用實(shí)際場所如醫(yī)院、診所、私人住宅。本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)水平的改變與胃腸 癌癥或胃腸癌癥組織轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。具體的，CSTl基因表達(dá)的上調(diào)與胃腸癌癥或胃腸癌癥 組織轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此可以通過檢測CSTl基因表達(dá)(特別是CSTl mRNA表達(dá))來診斷 胃腸癌癥或胃腸癌癥組織轉(zhuǎn)移。CSTl基因是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，其含有兩個(gè)個(gè)剪切子，三個(gè)外顯 子。本發(fā)明人通過對大量的胃癌、腸癌或胃癌、腸癌組織轉(zhuǎn)移患者的組織進(jìn)行研究，并與胃 炎、腸炎患者的組織或正常對照等進(jìn)行比較，從而有力的證實(shí)了 CSTl基因與胃癌、腸癌或 胃癌、腸癌組織轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。在本發(fā)明的實(shí)施例中，首先，本發(fā)明人比較了人體不同組織 中CSTl mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)除唾液腺外，人體正常組織中CSTl均低度表達(dá)，因此對于CSTl 用于病理?xiàng)l件下檢測極為有利。然后，本發(fā)明人比較已經(jīng)報(bào)道的CST1，2，4 ；CSTl ；CST2 ；CST4在胃癌、腸癌和對應(yīng)癌旁中的表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)CSTl在胃癌和癌旁以及腸癌和癌旁 中的表達(dá)量差異最大，其次是CST4，均優(yōu)于報(bào)道的CST1，2，4。然后，本發(fā)明人分別比較了 胃癌與癌旁手術(shù)組織中CSTl兩種剪切方式(splicel、splice2)表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)第一種剪 切方式(splicel) (SEQ ID No 43)在癌與癌旁組織中的表達(dá)差異程度優(yōu)于第二中剪切方 式(spliCe2) (SEQ ID No 44)；接著，本發(fā)明人分別比較了胃癌與癌旁手術(shù)組織、胃癌與炎 /正常人胃鏡組織、胃癌轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)與陰性淋巴結(jié)、胃癌與炎/正常人血漿cell-free RNA CSTl第一個(gè)剪切子mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)胃癌中CSTl第一個(gè)剪切子mRNA的表達(dá)中位 數(shù)比癌旁組織高57. 5倍，胃鏡樣本高24倍，轉(zhuǎn)移樣本高11. 469倍，血漿Cell-freeRNA高 37. 18倍。本發(fā)明人還分別比較了腸癌與癌旁手術(shù)組織、腸癌與炎/正常人腸鏡組織、腸癌 轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)與陰性淋巴結(jié)、腸癌與炎/正常人血漿cell-free RNA CSTl第一個(gè)剪切子 mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)腸癌中CSTl第一個(gè)剪切子mRNA的表達(dá)中位數(shù)比癌旁組織高48. 95倍， 腸鏡樣本高約23倍，轉(zhuǎn)移樣本高11. 469倍，血漿Cell-free RNA高約20倍。因此，以CSTl 第一個(gè)剪切子作為診斷的標(biāo)志物，靈敏度高(可高于95% )且特異性良好(可達(dá)100% )。因此，基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可利用CSTl基因(1)進(jìn)行胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移 的鑒別診斷、和/或易感性分析；(2)評估相關(guān)人群的胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移治療藥物、藥物 療效、預(yù)后，以及選擇合適的治療方法；(3)早期評估相關(guān)人群胃癌或胃癌組織轉(zhuǎn)移患病風(fēng) 險(xiǎn)，早期檢測早期預(yù)防；(4)進(jìn)行腸癌或腸癌組織轉(zhuǎn)移的鑒別診斷、和/或易感性分析；(5) 評估相關(guān)人群的腸癌或腸癌組織轉(zhuǎn)移治療藥物、藥物療效、預(yù)后，以及選擇合適的治療方 法；(6)早期評估相關(guān)人群腸癌或腸癌組織轉(zhuǎn)移患病風(fēng)險(xiǎn)，早期檢測早期預(yù)防。本發(fā)明還提供了用于檢測胃腸癌癥或胃腸癌癥組織轉(zhuǎn)移的試劑。所述試劑可以 是CST1基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性(與人類其它基因沒有序列重復(fù)或互補(bǔ))引物；或CSTl基 因或轉(zhuǎn)錄本的特異性(不識別人類其它基因)探針；或表面固定有所述探針的芯片。作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述的試劑是引物和探針，所述的引物是針對CSTl基因 外顯子的引物和探針，更佳的是針對CSTl第一個(gè)剪切子外顯子一的引物和探針；或針對 CSTl第一個(gè)剪切子外顯子二、三的引物和探針。作為本發(fā)明的更優(yōu)選的方式，所述的引物和探針是針對CSTl第一個(gè)剪切子外顯 子一的引物和探針，該引物和探針能僅識別CSTl第一個(gè)剪切子，與CSTl第二個(gè)剪切子及人 類其它基因均不會互補(bǔ)結(jié)合。所述的特異性引物是具有SEQ ID No :1和SEQ ID No:2，探 針為SEQ ID No:3。所述的引物和探針特異性好，擴(kuò)增效果良好。本發(fā)明還提供一種檢測胃腸癌癥或胃腸癌癥組織轉(zhuǎn)移的試劑盒，所述的試劑盒比 已有的胃腸癌癥檢測試劑盒具有更好的特異性和選擇性。所述的試劑盒中含有用于檢測 胃腸癌癥或胃腸癌癥組織轉(zhuǎn)移的試劑。所述的試劑可以是CST1基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性引 物；或CSTl基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性探針；或同時(shí)包括引物和探針。通常，所述的試劑存在于 適當(dāng)?shù)娜萜髦?。可使用稀釋劑如去離子水將每種所述的引物和探針調(diào)整到至少一種需要量 的濃度，分裝于容器中。為了便于進(jìn)行分析和比對，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還含有胃腸 癌細(xì)胞株和不表達(dá)CSTl的細(xì)胞株分別作為陽性和陰性參照品和制備標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的標(biāo)準(zhǔn)
P
ΡΠ O此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取核酸的試劑，用于PCR的試劑，用于染色
8或顯色的試劑等。例如，這些試劑包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還可包括描述胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)檢測以及預(yù)后判斷的說 明書和/或芯片圖像分析軟件等。本發(fā)明所述的試劑盒可包含適于實(shí)用(如針對不同的檢測方法)的多種不同試 劑，并不限于目前所列舉的試劑，只要是基于CSTl基因或轉(zhuǎn)錄本的檢測來進(jìn)行胃腸癌癥診 斷、動(dòng)態(tài)檢測以及預(yù)后判斷的產(chǎn)品均包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述的試劑也可以是CSTl基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性識別探針或表面固定有所述的 芯片。探針或芯片的制備方法是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，制備方法例如可參照王申五主編的 《基因診斷技術(shù)_非放射性操作手冊》；J. L. erisi，V. R. iyer，P. 0. BROWN. Exploring the metabolicand genetic control of gene expression on a genomic scale. Science, 1997 ；278 :680。所述的針對CSTl基因或轉(zhuǎn)錄本的特異性識別探針，包括但不限于TaqMan水解探 針、MGB探針、雜交探針、分子信標(biāo)等。檢測受試者組織樣品中CSTl基因或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)的方法優(yōu)選的是Real-time PCR方法。本發(fā)明優(yōu)選方案是Real-time PCR方法檢測診斷受試者的胃腸疾病，監(jiān)控受試者 的胃腸疾病，監(jiān)控受試者胃腸疾病治療效果，受試者癌癥分期或樣品中CSTlmRNA水平。本發(fā)明試劑盒所針對的受試者可以為胃腸不適就醫(yī)者，且檢測包括對受試者進(jìn)行 篩查以檢測胃腸癌癥。本發(fā)明試劑盒所針對的受試者可以為慢性胃炎、腸炎患者，且檢測包括對受試者 進(jìn)行篩查以檢測胃腸癌癥。本發(fā)明試劑盒所針對的受試者可以為有家族性胃腸癌癥者，且檢測包括對受試者 進(jìn)行篩查以檢測胃腸癌癥。一種檢測方法是獲得組織樣品，從所述組織樣品分離RNA ；使用CSTl特異性引物 和探針從RNA樣品中擴(kuò)增cDNA拷貝，量化擴(kuò)增的cDNA拷貝，使用量化的擴(kuò)增cDNA拷貝來 評估胃腸疾病進(jìn)展或治療效果。檢測CSTl mRNA表達(dá)的方法還有很多種，，包括但不限于基于核酸序列擴(kuò)增法 ((Nucleic Acid based Amplificatin,NASBA)的體外 RNA擴(kuò)增技術(shù)。當(dāng)然，RNA體外擴(kuò)增技 術(shù)不限于NASBA，其它已知的RNA擴(kuò)增方法和即刻的方法和試劑盒也是可用的。非限制性的 例子有多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過Beacon方法用 熒光探針在均勻相中被檢測，或產(chǎn)物可通過熒光或測熱法(fluorescent orcalorimetric method)在固相中被檢測。根據(jù)當(dāng)前發(fā)明檢測和/或定量靶基因RNA，多種熒光、側(cè)熱或酶 法可以被應(yīng)用。最佳的是，基于特殊熒光探針的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，其中熒光探針可以是標(biāo)記 了熒光的特異互補(bǔ)于CSTl的序列，也可以是非特異性的雙核苷酸染料，包括但不限于SYBR Green, Eve Green，LC Green 等。組織樣品的獲得是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選可選擇非侵入性或具有最低程度侵入 性的方法獲得。所述的組織樣品可以是(但不限于)外周血、血清、血漿、唾液、胃液、腸道 分泌物、骨髓、淋巴結(jié)、腹腔清洗液、尿樣等。根據(jù)本發(fā)明所述的檢測試劑盒可用于實(shí)際場所，包括但不限于醫(yī)院診所以及私人住宅。此外，還可應(yīng)用多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將待測樣品的數(shù)據(jù)與對照數(shù)據(jù)比較，有利于作出 關(guān)于胃腸癌癥診斷、進(jìn)展或治療效果的判斷。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)CSTl基因與胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷具有密切 相關(guān)性，并且證實(shí)CSTl第一個(gè)剪切子在胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷方面更具有 優(yōu)越性，驗(yàn)證的樣本量多，結(jié)果準(zhǔn)確。該相關(guān)性的提出為胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后 判斷提供了新的途徑。2、開發(fā)了適合于胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷的試劑或試劑盒，檢測靈 敏度良好。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為CSTl與Pmdl8_T重組質(zhì)粒圖譜；圖2為CSTl在人體正常組織中的表達(dá)情況(芯片)，所述組織包括扁桃體、垂體 后葉、甲狀腺、唾液腺、骨骼肌、骨髓、除去紅細(xì)胞和血小板的外周血、肺、胃、肝臟、心臟、腎、 腎上腺、腸、結(jié)腸、胰臟脾臟、膀胱、前列腺、卵巢、子宮、胎盤、睪丸以及腸癌細(xì)胞株SW480， Caco2，LOVO, HCT16，胃癌細(xì)胞株NCI-N87，人胃上皮細(xì)胞株GES-1 ；圖3為染料法實(shí)時(shí)定量PCR給出的CSTl，2，4 ;CST1 ；CST2 ;CST4在20對胃癌和癌 旁組織中的表達(dá)量差異；圖4a為染料法實(shí)時(shí)定量PCR給出的20對胃癌、癌旁組織中ACTB CP值；圖4b為染料法實(shí)時(shí)定量PCR反映的是CSTl第一種剪切方式(splicel)、第二種剪 切方式(splice2)在20對胃癌、癌旁組織中癌旁的CP值與對應(yīng)癌組織的CP之差的中位數(shù) 比較；圖5為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個(gè)剪切子在100例胃癌和
癌旁組織中的表達(dá)量分布；圖6為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個(gè)剪切子在36例胃癌以及 29例胃炎胃鏡表中的表達(dá)量分布；圖7為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個(gè)剪切子在20枚胃癌病理 陽性淋巴結(jié)，15枚病理陰性淋巴結(jié)中表達(dá)量分布；圖8為通過Real-time PCR絕對定量法檢測外周血游離胃癌細(xì)胞的準(zhǔn)確度與細(xì)胞 學(xué)檢測的對比；圖9為通過Real-time PCR絕對定量法檢測胃癌骨髓轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確度與細(xì)胞學(xué)檢測 的對比；圖IOa為通過Real-time PCR絕對定量法，胃癌病人(50例)血漿Cell-free RNA 中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(30例)/正常人(30例)的差異；圖IOb為通過Real-time PCR絕對定量法獲得的ROC曲線，區(qū)分胃癌/炎/正常 的敏感性和特異性；圖11為通過連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction, LCR)方法，胃癌病人(50 例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(30例)/正常人(30例)的差異；
圖 12 為通過適溫鏈置換反應(yīng)(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)方法，胃癌病人(50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子 量與炎(30例)/正常人(30例)的差異；圖 13 為通過核酸序列擴(kuò)增法(Nucleic Acid based Amplif icatin，NASBA)，20 例 胃癌，10例胃炎，10例正常人尿樣中CSTl第一個(gè)剪切子量的表達(dá)差異。圖 14 為通過轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(Transcription-mediated amplification, TMA), 檢測50例胃癌(ρ Μ分期，Ι+ΙΙ 30例，III+IV50例)不同分期CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量
的差異。圖15為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個(gè)剪切子在100例腸癌和
癌旁組織中的表達(dá)量分布。圖16為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個(gè)剪切子在36例腸癌以 及29例腸炎腸鏡組織表中的表達(dá)量分布。圖17為Real-time PCR絕對定量法給出的CSTl的第一個(gè)剪切子在20枚腸癌病 理陽性淋巴結(jié)，15枚病理陰性淋巴結(jié)中表達(dá)量分布。圖18a為通過Real-time PCR絕對定量法，腸癌病人(50例)血漿Cell-free RNA 中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(30例)/正常人(30例)的差異。圖18b顯示了通過Real-time PCR絕對定量法得到的ROC曲線，區(qū)分胃癌/炎/ 正常的敏感性和特異性。圖 19 為通過核酸序列擴(kuò)增法(Nucleic Acid based Amplif icatin，NASBA)，30 例 腸癌，20例腸炎，20例正常人尿樣中CSTl第一個(gè)剪切子量的表達(dá)差異。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中為注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份 數(shù)按重量計(jì)算。材料和方法實(shí)施例中所用標(biāo)本均與病人簽署知情同意書后按醫(yī)院規(guī)定途徑獲取。內(nèi)鏡下獲取的病理部位標(biāo)本和非病理部位樣本作為對比，也可是非鏡檢方式如手 術(shù)或胃腸壁擦拭法獲取的細(xì)胞、手術(shù)中獲取的淋巴結(jié)等樣本應(yīng)立即提取RNA或置于液氮或 RNAlater (Ambion公司產(chǎn)品)中保存。外周血、骨髓或尿液樣本首先通過離心機(jī)4000rpm，4°C，離心20分鐘，取上清， 13000rpm，4°C，離心10分鐘，分離上清和沉淀，立即提取RNA或置于_20°C至_80°C保存。TaqMan水解探針的Real-time PCR法上述樣本用商業(yè)化的核酸抽提方法進(jìn)行， 一個(gè)常用的非限制性例子是酚/氯仿抽提方法，如用Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol方 法抽提總RNA，并進(jìn)行RNA質(zhì)量鑒定，相關(guān)方法可參照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》等參考書描述。 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄過程采用商業(yè)化逆轉(zhuǎn)錄試劑盒并按操作說明書進(jìn)行，所得cDNA按比例稀釋 成需要的工作濃度。所用特異性引物經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)，CSTl的第一個(gè)剪切子的上下游引物設(shè)計(jì)
11在外顯子1上。制備包含CSTl第一個(gè)剪切子擴(kuò)增子的重組質(zhì)粒，所需的質(zhì)粒為商業(yè)化的 Pegm-T (promega)(圖1)，上下游引物設(shè)計(jì)在外顯子1，2上。采用基于TaqMan水解探針的 Real-time PCR法進(jìn)行CSTl第一個(gè)剪切子擴(kuò)增。針對CSTl第一個(gè)剪切子的引物和探針，最優(yōu)的如下上游引物TCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQID No 1)下游引物TTATCCTATCCTCCTCCTTGG(SEQID No 2)探針5'-FAM-CTCCAGCTTTGTGCTCTGCCTCT-TAMRA-3' (SEQ ID No :3)擴(kuò)增長度 為 141bp。針對制備包含CSTl第一個(gè)剪切子擴(kuò)增子的重組質(zhì)粒的引物，最優(yōu)的如下上游引物GGGCTCCCTGCCTCGGGCTCTCAC(SEQID No 22)下游引物ACGGTCTGTTGCCTGGCTCTTAGT(SEQID No 23)實(shí)驗(yàn)組，陽性對照組，陰性對照組與重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品一起擴(kuò)增。依據(jù)重組質(zhì)粒濃度 梯度和擴(kuò)增后對應(yīng)的CP (cross point)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線給出實(shí)驗(yàn)組、陽性對 照組和陰性對照組的拷貝數(shù)。染料法實(shí)時(shí)定量PCR 樣本處理同TaqMan水解探針的Real-time PCR法，CST1，2，4 引物，上游AGTCCCAGCCCAACTTGGA(SEQ ID No 24)下游GGGAACTTCGTAGATCTGGAAAGA (SEQ ID No 25) ；CSTl的第一種剪切子的上下游引物同TaqMan水解探針的Real-time PCR法；CSTl的第二種剪切子的上下游引物，上游GCACTGGGGAAGAGAGGCAT(SEQ ID No 26)下游AGGAGCAGCAGGGTACTCAGATA(SEQ ID No :27)CST2 弓丨物，上游 CAGAAGAAACAGTTGTGCTC (SEQ ID No :28)下游GGAGTAGGAGGTGGTCAG(SEQ ID No :29)CST4 引物，上游GCTCTCACCCTCCTCTCCTG(SEQ ID No 30)下游TATCCTATTCTCCTCCTTGG (SEQ ID No 31)內(nèi)參基因 β-actin，上游引物AAGATCATTGCTCCTCCTG(SEQ ID No:32)，下游引物: CGTCATACTCCTGCTTGC(SEQ ID No :33)。癌和癌旁組織目的基因和內(nèi)參基因一起擴(kuò)增，通過 2"(-Δ ACT)公式計(jì)算目的基因在癌和癌旁組織中的相對表達(dá)量。熒光染料如SYBR Green, Eve Green, LC Green 等。核酸序列擴(kuò)增法(NucleicAcid based Amplif icatin, NASBA)的體外 RNA 擴(kuò)增 技術(shù)T7RNA聚合酶，RNase H，禽骨髓白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶，核糖核苷酸(NTP)，脫氧 核糖核苷酸(dNTP)，CSTl的第一個(gè)剪切子的上下游引物同TaqMan水解探針的Real-time PCR法，RNA熒光染料(Ribo-Green fluorescent dye)。42度，2小時(shí)，可將RNA模板擴(kuò)增 2" (9-12)，反應(yīng)產(chǎn)物放入熒光檢測儀內(nèi)檢測熒光強(qiáng)度(U)，從而反應(yīng)初始模板量。實(shí)施例1.人體不同組織中CSTl的表達(dá)差異所用人體組織標(biāo)本除正常胃黏膜，結(jié)腸黏膜組織為發(fā)明人從合作醫(yī)院收集外，其 它各組織均從商業(yè)化機(jī)構(gòu)購買。采用Affymetrix的核苷酸芯片HG_U95Av進(jìn)行各正常組織 CSTl mRNA表達(dá)比較，操作過程參照產(chǎn)品說明書。本實(shí)驗(yàn)的相對表達(dá)量的值是通過管家基因 β -actin熒光值進(jìn)行歸一化處理后的標(biāo)準(zhǔn)化信號值。結(jié)果如圖2所示，除唾液腺中CSTl表達(dá)量較高外，其它組織中CSTl不表達(dá)，說明 CSTlmRNA表達(dá)在正常組織中的背景值很低，這對CSTl用于病理?xiàng)l件下檢測極為有利。在胃 癌細(xì)胞株NCI-N87，結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，Caco2中過表達(dá)，在人胃上皮細(xì)胞GES-I，大腸癌細(xì) 胞株L0V0，HCTl 16中不表達(dá)，說明CSTl極有可能可作為胃癌，腸癌分子診斷的Marker。
實(shí)施例2.胃癌及癌旁手術(shù)組織樣本CSTl與CST1，2，4，CST2 mRNA表達(dá)量比較通過比較20對(G1-G20)胃癌及癌旁組織中CST1, CST1，2，4，CST2 mRNA表達(dá)量， 發(fā)現(xiàn)CSTl mRNA在胃癌和癌旁組織中表達(dá)量差異最大，結(jié)果見圖3。上述標(biāo)本均通過病理證 明，采用染料法實(shí)時(shí)定量PCR。實(shí)施例3.胃癌、癌旁組織樣本中CSTl第一種剪切方式(splicel)，第二種剪切方 式(spliCe2)表達(dá)量差異通過手術(shù)取樣的樣本均經(jīng)病理驗(yàn)證后才進(jìn)行RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄cDNA，采用染料 法實(shí)時(shí)定量PCR，首先檢測樣本中管家基因ACTB表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)樣本ACTB中CP值基本一 致，如圖4a，也就是說樣本中總的cDNA量基本一致，然后比較了 CSTl第一種剪切方式 (splicel)，第二種剪切方式(spliCe2)在20對胃癌、癌旁組織中的癌旁的CP值與癌之差 的中位數(shù)，見圖4b，發(fā)現(xiàn)CSTl第一種剪切方式(splicel)在癌與癌旁中的表達(dá)量差異明顯 優(yōu)于splice2，也就是說CSTl第一種剪切方式(splicel)在判別是否為癌時(shí)，更具有優(yōu)越 性。實(shí)施例4.胃癌、癌旁及正常手術(shù)組織樣本CSTl的第一個(gè)剪切子(splicel)的表 達(dá)差異通過手術(shù)取樣的樣本均經(jīng)病理驗(yàn)證后才進(jìn)行RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄cDNA， Real-timePCR絕對定量法鑒定CSTl第一個(gè)剪切子在胃癌、癌旁以及正常組織中的表達(dá)差 異，測試樣本數(shù)為100例。圖5的結(jié)果表明，胃惡性病理?xiàng)l件下特異性高表達(dá)CSTl的第一個(gè)剪切子mRNA，而 癌旁及正常組織低表達(dá)。癌拷貝的中位數(shù)是癌旁/正常拷貝中位數(shù)的57. 5倍，提示CSTl 的第一個(gè)剪切子mRNA可作為良好的胃癌分子標(biāo)志物。在100. 68拷貝處劃線，可將癌與正 常區(qū)分開來，因此100. 68拷貝可作為胃癌臨床診斷的一個(gè)參考值。實(shí)施例5.胃鏡下取樣的胃癌、胃炎中CSTl的第一個(gè)剪切子的表達(dá)差異胃鏡下取樣與手術(shù)取樣的樣本具有較大差別，主要表現(xiàn)在取樣組織中胃癌細(xì)胞的 比例變動(dòng)很大，有時(shí)可能僅占到整塊組織的很小一部分，有的甚至沒有。因此本發(fā)明人統(tǒng)計(jì) 比較了 36例胃癌以及36例胃炎病人胃鏡取樣標(biāo)本中CSTl的第一個(gè)剪切子的表達(dá)差異，癌 標(biāo)本拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎標(biāo)本拷貝數(shù)中位數(shù)的24倍，如果在98. 89拷貝處劃線，可以將癌 和炎區(qū)分開來，可為胃鏡下取樣胃癌診斷提供一參考值。結(jié)果見圖6，方法同樣采用Real-time PCR絕對定量的方法。實(shí)施例6. CSTl的第一個(gè)剪切子在胃癌轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)中的表達(dá)差
已 升手術(shù)中獲得的經(jīng)病理證明為胃癌轉(zhuǎn)移陽性的淋巴結(jié)20枚，且轉(zhuǎn)移灶大小不等。病 理陰性淋巴結(jié)15枚主要取自早期胃癌病人，原因是盡可能減少病理診斷陰性但實(shí)際有微 轉(zhuǎn)移存在的淋巴結(jié)，以避免實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)采用Real-time PCR檢測方法，具體材料和過程 同實(shí)施例2。圖7的結(jié)果表明，CSTl的第一個(gè)剪切子在轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)中高表達(dá)，而在陰性淋 巴結(jié)中只有較低表達(dá)。轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)CSTl的第一個(gè)剪切子mRNA表達(dá)量是陰性淋巴結(jié)中 的11. 469倍。如果從98. 5拷貝處劃線，基本可區(qū)分胃癌轉(zhuǎn)移陽性和陰性淋巴結(jié)。病理陰 性淋巴結(jié)中有兩例檢出CSTl的第一個(gè)剪切子弱陽性的淋巴結(jié)，經(jīng)病理醫(yī)師連續(xù)切片細(xì)致觀察，鑒定有微轉(zhuǎn)移的存在。因此，從CSTl的第一個(gè)剪切子mRNA表達(dá)程度劃分不僅100% 區(qū)分了細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果，而且能檢測細(xì)胞血不能檢出的有微轉(zhuǎn)移存在的淋巴結(jié)，相比細(xì)胞 學(xué)檢測該檢測方法具有更高的靈敏度。實(shí)施例7.定量PCR檢測外周血中游離胃癌細(xì)胞的準(zhǔn)確度與細(xì)胞學(xué)檢測對比除去紅細(xì)胞和血小板的外周血有核細(xì)胞提取RNA，經(jīng)Real-time PCR方法定量檢 測CSTl的第一個(gè)剪切子mRNA表達(dá)水平，通過和胃炎病人和正常人表達(dá)量的對比，判斷胃癌 患者的外周血中是否有游離胃癌細(xì)胞的存在，并和細(xì)胞學(xué)檢測比對。圖8的結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測方法100%確認(rèn)細(xì)胞學(xué)鑒定的陽性結(jié)果，同時(shí)可檢 測出細(xì)胞學(xué)鑒定胃陰性的病例中有部分轉(zhuǎn)移病例，說明該方法比細(xì)胞學(xué)檢測具有更高的靈 敏度，能檢測到細(xì)胞學(xué)無法檢測的微轉(zhuǎn)移的存在。實(shí)施例8.定量PCR方法檢測胃癌骨髓轉(zhuǎn)移與細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果對比穿刺等方法獲得的胃癌患者骨髓經(jīng)Real-time PCR方法定量檢測CSTl的第一個(gè) 剪切子mRNA表達(dá)水平，通過和正常骨髓的比較判斷CSTl的第一個(gè)剪切子mRNA是否高表 達(dá)，確認(rèn)骨髓是否存在轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移，并與細(xì)胞學(xué)結(jié)果進(jìn)行了比較。圖9的結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測方法可95%確認(rèn)細(xì)胞學(xué)陽性結(jié)果，同時(shí)陽性率高 于細(xì)胞學(xué)結(jié)果，表明敏感性比細(xì)胞學(xué)檢測方法要高。實(shí)施例9.胃癌病人血漿Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎/正常人的
差異應(yīng)用商品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA, Real-time PCR檢測胃癌病人 (50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(30例)，正常人(30例)的差
已 升。結(jié)果如圖10所示，圖IOa顯示CSTl第一個(gè)剪切子在癌中拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎/正 常的約20倍，在拷貝數(shù)13. 972處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來。圖IOb的ROC曲線顯 示基于CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量診斷胃癌的方法具有較高的靈敏度和特異性，因此CSTl 可作為非侵入性的血漿樣本胃癌診斷的特異性Marker。實(shí)施例10.連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reation, LCR)方法檢測胃癌病人血樣 Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎/正常人的差異應(yīng)用商品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA, Real-time PCR檢測胃癌病人 (50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(30例)，正常人(30例)的差
已結(jié)果如圖11所示，CSTl第一個(gè)剪切子在癌中相對熒光強(qiáng)度(relative light units, RLU)的中位數(shù)是炎/正常的約19倍，在相對熒光強(qiáng)度13. 66RLU處劃線，可將癌和 炎/正常區(qū)分開來。實(shí)施例11 適溫鏈置換擴(kuò)增(thermophilic strand displacement amplification, tSDA)方法胃癌病人血樣Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎/正 常人的差異應(yīng)用商品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA, Real-time PCR檢測胃癌病人 (50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(30例)，正常人(30例)的差
巳 ^to
14
結(jié)果見圖12，CSTl第一個(gè)剪切子在癌中相對熒光強(qiáng)度(relative light units, RLU)的中位數(shù)是炎/正常的約19倍，在相對熒光強(qiáng)度12. 44RLU處劃線，可將癌和炎/正常 區(qū)分開來。實(shí)施例12.胃癌病人尿樣Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎/正常人 的差異應(yīng)用商品化的試劑盒，抽提尿液中Cell-free RNA，熒光檢測的核酸序列擴(kuò)增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)檢測胃癌病人(20 例)尿樣 Cell-free RNA 中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(10例)，正常人(10例)的差異。結(jié)果如圖13所示，CSTl第一個(gè)剪切子在癌中熒光強(qiáng)度的中位數(shù)是炎/正常的約7 倍，在14. 329U處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來，即可作為非侵入性的尿液樣本胃癌診 斷的一個(gè)參考值。實(shí)施例13. CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量與胃癌pTW分期的關(guān)系應(yīng)用商 品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA,應(yīng)用Gen-probe轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增 (Transcription-Mediated amplification, TMA)方法，檢測 50例胃癌(pTNM分期，I+II 30 例，III+IV50例)不同分期CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量的差異。結(jié)果見圖14，CSTl第一個(gè)剪切子在胃癌I+II中相對熒光強(qiáng)度(relative light units, RLU)的中位數(shù)是III+IV的2. 1倍，在相對熒光強(qiáng)度(relative light units, RLU) 12. 44RLU處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來。實(shí)施例14.大腸癌及癌旁手術(shù)組織樣本CSTl的第一個(gè)剪切子的表達(dá)差異通過手術(shù)取樣的樣本均經(jīng)病理驗(yàn)證后才進(jìn)行RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄cDNA， Real-timePCR絕對定量法鑒定CSTl第一個(gè)剪切子在大腸癌和癌旁組織中的表達(dá)差異，測 試樣本數(shù)為100對。圖15的結(jié)果表明，結(jié)腸惡性病理?xiàng)l件下特異性高表達(dá)CSTl的第一個(gè)剪切子mRNA， 而癌旁的正常組織低表達(dá)。癌拷貝的中位數(shù)是癌旁拷貝中位數(shù)的48. 95倍，提示CSTl的第 一個(gè)剪切子mRNA可作為良好的腸癌分子標(biāo)志物。在77. 7拷貝處劃線，可將癌與正常區(qū)分 開來，因此77. 7拷貝可作為大腸癌臨床診斷的一個(gè)參考值。實(shí)施例15.腸鏡下取樣的腸癌、腸炎中CSTl的第一個(gè)剪切子的表達(dá)差異。腸鏡下取樣與手術(shù)取樣的樣本具有較大差別，主要表現(xiàn)在取樣組織中腸癌細(xì)胞的 比例變動(dòng)很大，有時(shí)可能僅占到整塊組織的很小一部分，有的甚至沒有。因此本發(fā)明人統(tǒng)計(jì) 比較了 36例腸癌以及36例腸炎病人腸鏡取樣標(biāo)本中CSTl的第一個(gè)剪切子的表達(dá)差異，癌 標(biāo)本拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎標(biāo)本拷貝數(shù)中位數(shù)約23. 1倍，如果在87. 5拷貝處劃線，可以將癌 和炎區(qū)分開來，可為腸鏡下取樣胃癌診斷提供一參考值。結(jié)果見圖16，方法同樣采用Real-time PCR絕對定量的方法。實(shí)施例16. CSTl的第一個(gè)剪切子在腸癌轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)和陰性淋巴結(jié)中的表達(dá) 差異手術(shù)中獲得的經(jīng)病理證明為腸癌轉(zhuǎn)移陽性的淋巴結(jié)20枚，且轉(zhuǎn)移灶大小不等。病 理陰性淋巴結(jié)15枚主要取自早期腸癌病人，原因是盡可能減少病理診斷陰性但實(shí)際有微 轉(zhuǎn)移存在的淋巴結(jié)，以避免實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)采用Real-time PCR檢測方法，具體材料和過程 同實(shí)施例2。
圖17的結(jié)果表明，CSTl的第一個(gè)剪切子在轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)中高表達(dá)，而在陰性淋 巴結(jié)中只有較低表達(dá)。轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)CSTl的第一個(gè)剪切子mRNA表達(dá)量是陰性淋巴結(jié)中 的11. 469倍。如果從100拷貝處劃線，基本可區(qū)分腸癌轉(zhuǎn)移陽性和陰性淋巴結(jié)。病理陰性 淋巴結(jié)中有兩例檢出CSTl的第一個(gè)剪切子弱陽性的淋巴結(jié)，經(jīng)病理醫(yī)師連續(xù)切片細(xì)致觀 察，鑒定有微轉(zhuǎn)移的存在。因此，從CSTl的第一個(gè)剪切子mRNA表達(dá)程度劃分不僅100%區(qū) 分了細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果，而且能檢測細(xì)胞血不能檢出的有微轉(zhuǎn)移存在的淋巴結(jié)，相比細(xì)胞學(xué) 檢測該檢測方法具有更高的靈敏度。實(shí)施例17.腸癌病人血漿Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎/正常人 的差異應(yīng)用商品化的試劑盒，抽提血漿中Cell-free RNA, Real-time PCR檢測腸癌病人 (50例)血漿Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(30例)，正常人(30例)的差
已 升。結(jié)果如圖18所示，圖18a顯示CSTl第一個(gè)剪切子在癌中拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎/正 常的約20倍，在拷貝數(shù)13. 89處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來。圖18b的ROC曲線顯 示基于CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量診斷腸癌的方法具有較高的靈敏度和特異性，因此CSTl 可作為非侵入性的血漿樣本腸癌診斷的特異性Marker。實(shí)施例18.腸癌病人尿樣Cell-free RNA中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎/正常人 的差異應(yīng)用商品化的試劑盒，抽提尿液中Cell-free RNA，熒光檢測的核酸序列擴(kuò)增法 (Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA)檢測腸癌病人 C30 例)尿樣 Cell-free RNA 中CSTl第一個(gè)剪切子量與炎(20例)，正常人(20例)的差異。結(jié)果如圖19所示，CSTl第一個(gè)剪切子在癌中拷貝數(shù)的中位數(shù)是炎/正常的約7 倍，在拷貝數(shù)16. 96U處劃線，可將癌和炎/正常區(qū)分開來，即可作為非侵入性的尿液樣本腸 癌診斷的一個(gè)參考值。實(shí)施例19. CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量用于胃癌、腸癌治療過程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法，通過檢測病人血液中CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量，實(shí)時(shí)監(jiān) 測胃癌化療病人3人，放療病人2人，腸癌化療病人3人，放療2人，治療效果。結(jié)果見表1，治療有效的病人CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量隨著療程的增加逐漸降 低，影像學(xué)結(jié)果也顯示，腫塊逐漸減?。欢委煙o效的病人CSTl第一個(gè)剪切子表達(dá)量隨著 療程的增加逐漸增加，影像學(xué)結(jié)果顯示，腫塊有變大的趨勢。因此，CSTl第一個(gè)剪切子可作 為胃癌、腸癌患者治療過程中一個(gè)動(dòng)態(tài)監(jiān)測的指標(biāo)。表1為通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測放化療過程中胃腸腫瘤患者血液中CSTl第一個(gè)剪
切子的量
1權(quán)利要求
一種用于預(yù)示和診斷胃腸腫瘤的檢測方法，其特征在于所述方法包括(1)獲得待測樣品；(2)檢測選自下列的編碼mRNA的基因在待測樣品中是否過表達(dá)；所述基因選自i)對應(yīng)于SEQ ID No39的CST1基因；或ii)特異性識別選自CST1基因的mRNA、CST1剪切子、CST1基因或CST1基因剪切子的cDNA的其中一種的引物或探針?biāo)R別的基因；或iii)通過至少一種CST1引物對應(yīng)的擴(kuò)增子所鑒定的基因；當(dāng)基因表達(dá)水平超過預(yù)定閾值時(shí)則預(yù)示胃腸腫瘤容易產(chǎn)生或已經(jīng)形成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)中引物選自對應(yīng)于SEQ ID No :1 2或SEQ ID No :4 21中至少之一的引物；所述探針為對應(yīng)于SEQ ID No:3序 列的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述引物為對應(yīng)于SEQIDNo :1和SEQ ID No 2的引物對，所述探針為對應(yīng)于SEQ ID No 3的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述CSTl基因或剪切子的引物對應(yīng)的擴(kuò) 增子的擴(kuò)增方法選自聚合酶鏈反應(yīng)法、實(shí)時(shí)定量PCR法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增法、連接酶鏈反應(yīng) 法、適溫鏈置換擴(kuò)增法、基于核酸序列的擴(kuò)增方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述獲得對應(yīng)于SEQID No:43的CSTl 基因第一個(gè)剪切子的引物相對應(yīng)的擴(kuò)增子為CSTl基因第一個(gè)剪切子的引物通過實(shí)時(shí)定量 PCR法進(jìn)行擴(kuò)增而得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述CSTl第一個(gè)剪切子的擴(kuò)增子為對應(yīng)于 SEQ ID No 45的擴(kuò)增子。
7.一種用于預(yù)示或檢測胃腸腫瘤的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括用于捕獲對應(yīng) 于SEQ ID No 39的CSTl基因或?qū)?yīng)于SEQ ID No :43的CSTl基因第一個(gè)剪切子的引物或 探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括使對應(yīng)于SEQID No 39的CSTl基因或?qū)?yīng)于SEQ ID No 43的CSTl基因第一個(gè)剪切子的引物相對應(yīng)的擴(kuò)增子 可視化的反應(yīng)試劑；所述反應(yīng)試劑包括通過選自瓊脂糖凝膠電泳、酶聯(lián)凝膠法、電化學(xué)發(fā)光 技術(shù)、原位雜交技術(shù)、熒光檢測法使CSTl基因或CSTl基因第一個(gè)剪切子的引物對應(yīng)的擴(kuò)增 子可視化的試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括陽性參照品的胃癌細(xì)胞 株、作為陰性參照品的正常的胃細(xì)胞株、標(biāo)準(zhǔn)品、核酸提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、聚合酶鏈反應(yīng) 試劑、對應(yīng)于SEQ ID No :1 2的引物對和對應(yīng)于SEQ ID No 3的探針。
10.一種用于預(yù)示或檢測胃腸腫瘤的基因芯片，其特征在于所述基因芯片包括用于捕 獲對應(yīng)于SEQ ID No :39的CSTl基因或?qū)?yīng)于SEQ ID No :43的CSTl基因第一個(gè)剪切子的 引物或探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于預(yù)示和診斷胃腸腫瘤的檢測方法及其試劑盒和基因芯片，該方法包括以下步驟(1)獲取待測樣品；(2)檢測選自下列編碼mRNA基因在樣品中是否過表達(dá)，所述基因?yàn)榫哂蠸EQ ID No39的CST1基因；或特異性識別CST1基因的mRNA、CST1剪切子(SEQ ID No43，SEQ ID No44)、CST1基因的cDNA、CST1剪切子的cDNA的其中一種的引物或/和探針?biāo)R別的基因；或通過至少一種CST1引物對應(yīng)的擴(kuò)增子所鑒定的基因。該方法可應(yīng)用于胃腸癌癥診斷、動(dòng)態(tài)監(jiān)測以及預(yù)后判斷方面，該方法具有驗(yàn)證的樣本量多，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK101985651SQ20101016068
公開日2011年3月16日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者渠香云, 王弢, 陳菲 申請人:蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司