本發(fā)明涉及寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位及制法和應(yīng)用，屬于植物提取物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

寬筋藤（Tinospora sinensis）防己科青牛膽屬植物中華青牛膽Merr.多以藤莖入藥。[參見：羅達(dá)尚. 中華藏本草（漢文） [M].民族出版社，1997.]，是藏醫(yī)傳統(tǒng)藥用植物，藏藥名“勒哲”。其主要生于海拔900米的山坡和林下。分布于我國西藏的墨脫、波密及廣東、海南、廣西和云南等地。[參見：國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草（藏藥卷） [M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002.12:286]。《晶珠本草》記載:勒哲味甘、苦、澀、辛，化味甘、酸、性潤(rùn)、涼、溫。治隆、赤巴合并癥、培根病、風(fēng)濕病、隆熱病。莖皮甘，肉苦，為治隆熱良藥。[參見：帝瑪爾·丹增彭措,毛繼祖譯.晶珠本草[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2012:329.]。

癌癥作為目前人類死亡的首要原因，對(duì)其治療仍局限于癌癥疾病的多樣性及反復(fù)性。然而，盡管不同的癌癥的致癌原因可能不盡相同，但其組織觀察均表現(xiàn)出相似的細(xì)胞周期紊亂以及迅速不可控制的細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。因此，對(duì)參與細(xì)胞周期調(diào)控的一些家族蛋白的研究在推動(dòng)癌癥治療中成為重要因素。組蛋白去乙?；福ê?jiǎn)稱HDAC酶）是一類蛋白酶，對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。一般情況下，組蛋白的乙?；欣贒NA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。在癌細(xì)胞中，HDAC的過度表達(dá)導(dǎo)致去乙?；饔玫脑鰪?qiáng)，通過恢復(fù)組蛋白正電荷，從而增加DNA與組蛋白之間的引力，使松弛的核小體變得十分緊密，不利于特定基因的表達(dá)，包括一些腫瘤抑制基因。組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACi）則可通過提高染色質(zhì)特定區(qū)域組蛋白乙?；?，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡及分化相關(guān)蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化，成為一類新的抗腫瘤藥物。HDACi不僅對(duì)多種血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤具有良好的治療作用，而且具有腫瘤細(xì)胞相對(duì)較高選擇性和低毒的優(yōu)點(diǎn)。申請(qǐng)人在研究中發(fā)現(xiàn)：目前抗腫瘤藥物的原料較少，特別是用于制備抑制HDAC1酶藥物的中藥原料較為匱乏?，F(xiàn)有技術(shù)中，寬筋藤含有生物堿類、多糖、黃酮化合物等多種化學(xué)成分，寬筋藤主要功效為舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)止痛之功。尚未見到關(guān)于寬筋藤抑制HDAC1酶的活性方面的研究和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位及制法和應(yīng)用，該寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位能有效抑制HDAC1酶的活性，用于制備抑制HDAC1酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位，其特征在于：選自寬筋藤石油醚部位、寬筋藤水相萃取部位中的一種，或者寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位、寬筋藤水相萃取部位中的兩種以上的按任意質(zhì)量比的混合物。

該寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：將寬筋藤粉碎，加入質(zhì)量百分濃度65%~95%乙醇溶液提取，將所得提取液濃縮、干燥，得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，分別揮去溶劑后得寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得寬筋藤水相萃取部位。

所述的提取為超聲波輔助回流提??；超聲波輔助回流提取的具體操作為：將粉碎后的寬筋藤加入質(zhì)量百分濃度65%~95%乙醇溶液超聲波提取0.5~3小時(shí)，過濾，濾渣回流提取1~3次，合并提取液，即得。

該寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位的應(yīng)用，其特征在于：在制備抑制HDAC1酶藥物方面的應(yīng)用。

所述制備抑制HDAC1酶藥物是通過寬筋藤石油醚部位、寬筋藤水相萃取部位中的一種，或者寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位、寬筋藤水相萃取部位中的兩種以上的按任意質(zhì)量比的混合物，與藥用輔料混合制成的口服制劑或注射制劑。

所述的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑。

所述的口服制劑為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑或溶液劑。

申請(qǐng)人對(duì)于本發(fā)明的說明如下：現(xiàn)有技術(shù)中，寬筋藤常規(guī)用途為治療感冒發(fā)熱和瘡瘍，未見其有抗腫瘤功效的相關(guān)報(bào)道。申請(qǐng)人通過大量研究發(fā)現(xiàn)：寬筋藤中的部分提取物還具有抗腫瘤的作用，但是其功效不明顯，不能確定其具體的有效部位。因此通過怎樣的溶劑、采用怎樣制備方法，才能獲得抑制HDAC1酶活性效果最好的有效部位，是必須要解決的問題。申請(qǐng)人通過研究發(fā)現(xiàn)：采用本發(fā)明制備方法，篩選出的寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位、寬筋藤水相萃取部位，均對(duì)于抑制HDAC1酶有較好的效果。

制備方法中，加入質(zhì)量百分濃度65%~95%乙醇溶液提取可以為浸提、回流提取或所述的超聲波輔助回流提取。優(yōu)選采用超聲波輔助回流提取，該方法具有較高的收率和提取效率。具體操作為：超聲波提取后，過濾獲得超聲波提取液和濾渣，向?yàn)V渣中加質(zhì)量百分比濃度65%~95%乙醇水溶液回流提取，合并超聲波提取液和回流提取液。進(jìn)一步的說明，回流提取的具體操作為：向回流加熱裝置中直接加入粉碎后的藥材或加入超聲波提取后的濾渣，加入乙醇水溶液，加熱提取，放冷過濾得一次提取液和濾渣；再向?yàn)V渣中加入乙醇水溶液，加熱、進(jìn)行第二次回流提取，放冷過濾得二次提取液和濾渣（以上為回流提取2次）；合并多次提取液，即得回流提取液。優(yōu)選的，每次回流提取0.5~2小時(shí)；每次回流提取時(shí)所加乙醇溶液沒過藥材表面1cm~2cm?；亓魈崛〉臏囟葹橐掖蓟亓魈崛〉某Ｒ?guī)溫度，需高于乙醇的沸點(diǎn)，優(yōu)選為80℃~100℃。用于粉碎的寬筋藤為寬筋藤全草或?qū)捊钐偬偾o部分，浸膏為粗提取物，采用不同的溶劑萃取浸膏分散液，指的是依次將石油醚加入浸膏分散液萃取分離獲得石油醚萃取液、將乙酸乙酯加入浸膏分散液萃取分離獲得乙酸乙酯萃取液、將正丁醇加入浸膏分散液萃取分離獲得正丁醇萃取液；取寬筋藤石油醚萃取液、寬筋藤乙酸乙酯萃取液和寬筋藤正丁醇萃取液分別揮發(fā)去除溶劑后，得寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位和寬筋藤正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液（溶劑為水），揮發(fā)去除溶劑即得寬筋藤水相萃取部位。水相萃取部位也可以稱作水相萃取物，水相萃取部位易溶于水；而相對(duì)的，石油醚、乙酸乙酯和正丁醇為有機(jī)相，石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)應(yīng)易溶于石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。其中，寬筋藤乙酸乙酯部位含有游離黃酮、黃酮苷類化合物；寬筋藤正丁醇部位含有黃酮苷和酚類化合物；寬筋藤水相萃取部位含有多糖和有機(jī)酸類化合物。揮去溶劑即揮發(fā)去除溶劑。揮去溶劑可以采用常壓加熱使溶劑（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）揮發(fā)。優(yōu)選的，揮去溶劑采用減壓濃縮，該方法效率高，并且能避免熱敏性成分因高溫喪失藥性。

優(yōu)選的劑型為口服制劑或注射制劑?？诜苿┖妥⑸渲苿樽罴呀o藥途徑，此處所述口服制劑為經(jīng)腸胃道給藥制劑，優(yōu)選的，口服制劑為緩釋、控釋型口服制劑。也可以為非腸胃給藥的其他，如呼吸道給藥制劑（噴霧劑、氣霧劑、粉霧劑）；皮膚給藥制劑（外用溶液劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑、貼劑）；膜給藥制劑（滴眼劑、滴鼻劑、眼用軟膏、含漱劑、舌下片劑）；腔道給藥制劑（栓劑）。注射制劑可以為常規(guī)注射制劑。根據(jù)藥物傳遞系統(tǒng)進(jìn)行分類，優(yōu)選的，本發(fā)明的注射制劑為脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑或微球注射劑；其他的，本發(fā)明的注射制劑還可以為微囊注射劑、聚合物膠束注射劑、微乳或亞微乳注射劑、亞微粒注射劑或凝膠注射劑，以上藥物傳遞系統(tǒng)的注射劑能延長(zhǎng)藥物載體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間、延長(zhǎng)載藥微粒在吸收部位的停留時(shí)間、控制藥物在釋放初期的突釋效應(yīng)。藥用輔料包括藥物載體，以及溶劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、助懸劑、澄清劑、反絮凝劑、矯味劑、著色劑、防腐劑、化學(xué)滅菌劑、吸附劑、助濾劑、抗氧劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、抗粘著劑、緩釋劑、控釋劑、包衣材料、成膜材料、膠囊材料中的一種或多種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位及制法和應(yīng)用所具有的有益效果是：

1、該寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位能有效抑制HDAC1酶的活性，用于制備抑制HDAC1酶藥物，具有較好的抗腫瘤作用。本領(lǐng)域中，寬筋藤具有舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)止痛之功。申請(qǐng)人在研究中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物存在原料匱乏的問題，并通過研究發(fā)現(xiàn)寬筋藤還具有抗腫瘤的功效，通過設(shè)計(jì)制備方法、進(jìn)行藥效篩選，通過研究確定寬筋藤所抑制的酶的種類和最佳有效部位，申請(qǐng)人在以上發(fā)現(xiàn)問題解決問題的過程中，付出了大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)。申請(qǐng)人首次在HDAC1酶上進(jìn)行藥效篩選，通過大量研究確定寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位、寬筋藤水相萃取部位中的一種或兩種以上的任意質(zhì)量比的混合物均具有較好的抑制HDAC1酶的效果，HDAC1酶存活率10.76~31.19 %，能夠用于開發(fā)成抗腫瘤藏藥新藥。由于不同溶劑萃取獲得的各有效部位對(duì)HDAC1酶活性抑制能力不同，申請(qǐng)人通過進(jìn)一步的研究確定：寬筋藤水相萃取部位的抑制HDAC1酶效果最優(yōu)，HDAC1酶存活率為10.76 %。綜上所述，申請(qǐng)人經(jīng)研究首次發(fā)現(xiàn)寬筋藤的新功效，并通過研究確定其所抑制的酶的種類，設(shè)計(jì)制備方法并最終獲得對(duì)HDAC1酶均具有較好抑制效果的有效部位，以上過程是付出了大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)的。

2、該寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位的制備方法提取方便，提取效率高。制備方法中，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)加入質(zhì)量百分濃度65%~95%乙醇溶液進(jìn)行超聲波輔助回流提取，提高了提取效率；萃取中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，采用以上溶劑萃取順序所得的寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位、寬筋藤水相萃取部位具有較好的抑制HDAC1酶的效果。

3、本發(fā)明拓展了抑制HDAC1酶藥物的原料渠道，擴(kuò)大了寬筋藤的用途，使寬筋藤發(fā)展成為抑制HDAC1酶藥物的新原料，可顯著提高寬筋藤的附加值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1~3是本發(fā)明的寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位及制法和應(yīng)用的具體實(shí)施方式，其中實(shí)施例1為最佳實(shí)施例。

實(shí)施例1

制備方法，包括下述步驟：將寬筋藤粉碎，采用質(zhì)量百分濃度75%~85%乙醇溶液超聲波提取1小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質(zhì)量百分濃度75%~85%乙醇溶液回流提取3次，每次0.5小時(shí)，合并超聲波提取液和回流提取提取液，濃縮、干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得寬筋藤水相萃取部位。

實(shí)施例2

制備方法，包括下述步驟：將寬筋藤粉碎，采用質(zhì)量百分濃度85%~95%乙醇溶液超聲波提取3小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質(zhì)量百分濃度85%~95%乙醇溶液回流提取3次，每次1小時(shí)，合并超聲波提取液和回流提取提取液，濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得寬筋藤水相萃取部位。

實(shí)施例3

制備方法，包括下述步驟：將寬筋藤粉碎，采用質(zhì)量百分濃度65%~75%乙醇溶液超聲波提取0.5小時(shí)，然后過濾得超聲波提取液和濾渣，濾渣加質(zhì)量百分濃度65%~75%乙醇溶液回流提取2次，每次2小時(shí)，合并超聲波提取液和回流提取提取液，濃縮干燥得浸膏；將浸膏加蒸餾水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為溶劑萃取浸膏分散液，揮去溶劑后得到寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位；將萃取后剩余的浸膏分散液濃縮、干燥，得寬筋藤水相萃取部位。

性能測(cè)試

分別各取0.4mg干燥后的寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位、寬筋藤水相萃取部位，各自溶解于100μL的二甲基亞砜（DMSO）中形成DMSO溶液，超聲5分鐘。再分別取1μL溶解樣品的DMSO溶液，分別加入緩沖液99μL，分別得到用于檢測(cè)寬筋藤抑制HDAC1酶的寬筋藤石油醚部位的緩沖溶液、寬筋藤乙酸乙酯部位的緩沖溶液、寬筋藤正丁醇部位的緩沖溶液和寬筋藤水相萃取部位的緩沖溶液。緩沖液的配方為：50mM/L的Tris-HCl、0.137 mM/L的NaCl、2.7mM/L的KCl、1mM/L的 MgCl₂、0.01%吐溫20，緩沖液pH 8.4。

一、抗HDAC1酶實(shí)驗(yàn)。

以實(shí)施例1得到的寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位為受試藥物。其代表實(shí)驗(yàn)為寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤乙酸乙酯部位和寬筋藤水相萃取部位抑制HDAC1酶的活性。其方法是，分別另取4μL的寬筋藤乙酸乙酯部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)F）、寬筋藤乙酸乙酯部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)G）、寬筋藤正丁醇部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)H）和寬筋藤水相萃取部位的緩沖溶液（標(biāo)號(hào)I），分別進(jìn)行如下操作：將所取的4μL緩沖溶液（F、G、H、I）置于96孔板中，再分別加入2μL HDAC1酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μL H3（1-21）K9底物，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。加入5μL SA-XL665 和5μL H3K9me0 抗體，665nm測(cè)值，得實(shí)驗(yàn)組吸光度。

將4μL的緩沖溶液置于96孔板中，再分別加入2μL HDAC1酶，室溫條件下反應(yīng)5min，加入4μL H3（1-21）K9底物，37℃，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60分鐘。加入5μL SA-XL665和5μL H3K9me0 抗體，665nm測(cè)值，得對(duì)照組吸光度。計(jì)算HDAC1酶存活率：存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

表1 寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位抑制HDAC1酶的活性測(cè)試結(jié)果

。

表1中* P＜0.01，通過表1可以看出：寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位和寬筋藤水相萃取部位對(duì)于HDAC1酶均有較好的抑制效果。

二、抗腫瘤活性測(cè)試。

利用MTT法測(cè)定寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位對(duì)人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。取實(shí)施例1所得寬筋藤各部位適量，DMSO溶解后，利用MTT法分別測(cè)定對(duì)人結(jié)腸癌HCT-8、人肝癌Bel-7402細(xì)胞、人胃癌BGC803細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞和人卵巢癌A2780細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。

實(shí)驗(yàn)方法：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶-EDTA消化后，配制成一定濃度的單細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度的差異，按800~2000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100μL。24h后，加入含不同濃度化合物及相應(yīng)溶劑對(duì)照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加100μL（DMSO終濃度<0.1%），每種受試化合物設(shè)5~7個(gè)劑量組，每組至少設(shè)3個(gè)平行孔，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72h后，棄上清液，每孔加入100μL新鮮配制的含0.5mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液后，每孔加入200μL DMSO溶解MTT甲簪沉淀，微型振蕩器振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在參考波長(zhǎng)450nm，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm條件下測(cè)定光密度值（OD），以溶劑對(duì)照處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組，用以下公式計(jì)算化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計(jì)算IC₅₀：抑制率=（對(duì)照組平均OD值－給藥組平均OD值）÷對(duì)照組平均OD值×100%。將制備方法中的浸膏、以及所得的寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位、寬筋藤水相萃取部位進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選，結(jié)果見表2。

表2 體外腫瘤細(xì)胞毒活性篩選結(jié)果

。

注：1）、HCT-8為人結(jié)腸癌細(xì)胞，Bel-7402為人肝癌細(xì)胞，BGC823為人胃癌細(xì)胞，A549為人肺癌細(xì)胞，A2780為人卵巢癌細(xì)胞。2）、>50表明不具有抗細(xì)胞毒活性。通過表2可看出：寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位、寬筋藤水相萃取部位確實(shí)有較好的抗腫瘤的效果。

三、體外S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。

1、實(shí)施例1各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法如下：

a）4~5周齡昆明小鼠，隨機(jī)選鼠分組，每組10只，每組雌雄各半；分組名稱為：空白對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組和給藥組；給藥組包括：寬筋藤石油醚部位低、中、高劑量組，寬筋藤乙酸乙酯部位低、中、高劑量組，寬筋藤正丁醇部位低、中、高劑量組，寬筋藤水相萃取部位低、中、高劑量組；對(duì)每只小鼠進(jìn)行皮膚消毒；

b）于右前肢皮下接種S₁₈₀瘤液0.2ml（S₁₈₀瘤細(xì)胞數(shù)在2.0×10⁶~2.2×10⁶范圍內(nèi)）；

c）接種24小時(shí)后給藥；空白對(duì)照組灌胃給藥10mL/kg注射用生理鹽水；環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg；給藥組采用灌胃給藥實(shí)施例1制得的寬筋藤石油醚部位、寬筋藤乙酸乙酯部位、寬筋藤正丁醇部位和寬筋藤水相萃取部位；首次給藥后，隔日稱小鼠首次體重每組每天給藥1次，每次給藥劑量詳見表3，連續(xù)給藥14天；

d）末次給藥1小時(shí)后，處死小鼠，稱小鼠末次體重，剝瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（空白對(duì)照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）÷空白對(duì)照組平均瘤重×100%，將抑瘤率計(jì)算結(jié)果錄入表3。

表3 實(shí)施例1各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

2、實(shí)施例2各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠方法同實(shí)施例1，數(shù)據(jù)錄入表4。

表4 實(shí)施例2各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

3、實(shí)施例3各部位的S₁₈₀荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的方法同實(shí)施例1，數(shù)據(jù)錄入表5。

表5實(shí)施例3各部位對(duì)小鼠S₁₈₀實(shí)體瘤的影響

。

經(jīng)申請(qǐng)人統(tǒng)計(jì)：給藥組與空白對(duì)照組相比，小鼠體重變化無顯著性差異（P>0.05）。表3~5中：S₁₈₀是指小鼠腹水瘤細(xì)胞，表3中抑瘤率數(shù)值越大表示抗腫瘤效果越好。由表3~5可以看出：首先，實(shí)施例1~3均有較好的抗腫瘤效果，實(shí)施例1~3各部位的抗腫瘤效果無明顯差別。其次，與空白對(duì)照組相比，寬筋藤乙酸乙酯部位中、高劑量組，寬筋藤正丁醇中、高劑量組，寬筋藤水相萃取部位中、高劑量組，環(huán)磷酰胺化療組，均可顯著抑制S₁₈₀腫瘤的生長(zhǎng)。

實(shí)施例4

將寬筋藤抑制HDAC1酶有效部位制備為片劑，采用如下步驟：將寬筋藤乙酸乙酯部位300mg和淀粉100mg混勻，加質(zhì)量百分比濃度10%的淀粉糊40mg制成軟材，過篩得濕顆粒，干燥得干顆粒，整粒，加硬脂酸鎂4 mg混勻、壓片，即得。

實(shí)施例5

沖劑的制備方法：按重量份配比將寬筋藤水相萃取部位5份、蔗糖1份、糊精3份混勻，加入適量質(zhì)量百分比95%乙醇溶液2~5份，邊加邊攪拌，制得軟材，將軟材干燥、過16目篩，分裝即得。

實(shí)施例6

微丸膠囊由以下重量份原料組成：寬筋藤正丁醇部位30份、卵磷脂5份、牛黃膽酸鈉5份、微晶纖維素30份；

微丸膠囊的制備方法：按配比將寬筋藤正丁醇部位、卵磷脂、牛黃膽酸鈉和微晶纖維素混均，倒入乙醇水溶液攪勻獲得軟材，將軟材倒入擠出機(jī)中擠出，經(jīng)滾圓獲得顆粒，擠出轉(zhuǎn)速250r/min，滾圓轉(zhuǎn)速800r/min，滾圓時(shí)間20min，干燥、過24~30目篩獲得微丸，將微丸灌裝入膠囊殼內(nèi)，即得。

實(shí)施例7

脂質(zhì)體注射劑的制備方法：1）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將50g膽固醇琥珀酸酯、250g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、40g大豆卵磷脂、50g泊洛沙姆-188、和10g寬筋藤正丁醇部位溶解于1500ml體積比為1:1的乙醇和正丁醇的有機(jī)溶劑中，攪拌使其溶解獲得混懸液；將混懸液通過減壓濃縮揮去有機(jī)溶劑，獲得磷脂膜；

2）在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向磷脂膜中加入8000ml pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌，使磷脂膜洗脫并充分溶脹水合，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，得寬筋藤正丁醇部位的脂質(zhì)體；

3）在無菌條件下，向?qū)捊钐僬〈疾课坏闹|(zhì)體中，加入100g海藻糖，攪拌均勻，超聲波處理0.5~1小時(shí)，加注射用水定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，灌裝，即得寬筋藤正丁醇部位的脂質(zhì)體注射劑。

實(shí)施例8

納米粒注射劑的制備方法：取25g寬筋藤乙酸乙酯部位和100g泊洛沙姆407用3000ml 無水乙醇溶解，加入30ml 1mol/L氯化鋅的乙醇溶液，攪拌混合，超聲波處理0.5~1小時(shí)使其溶解，獲得混合液；將混合液減壓濃縮揮去溶劑，放入-20℃冰箱冷凍2小時(shí)；取出加注射用水定容，超聲波處理0.5~1小時(shí)，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，灌裝，即得寬筋藤乙酸乙酯部位的納米粒注射劑。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。