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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明主要涉及有機(jī)合成和納米生物技術(shù)，更具體而言，涉及用于將生物活性分子傳遞到細(xì)胞內(nèi)以調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的官能化納米粒子以及與之相關(guān)的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞正常增殖、遷移和分化成各種細(xì)胞類型的能力對胚胎形成和成熟細(xì)胞，包括但不限于各種遺傳性或獲得性疾病中造血細(xì)胞和/或心血管系統(tǒng)細(xì)胞的功能是至關(guān)重要的。干細(xì)胞和/或進(jìn)一步分化的特化細(xì)胞類型的功能性能力在各種病理狀態(tài)下會發(fā)生變化，但是可通過胞內(nèi)引入生物活性成分而正?；?。例如，觀察到周期性中性粒細(xì)胞減少癥或嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥患者中有異常的細(xì)胞功能，例如骨髓干細(xì)胞/祖細(xì)胞的存活和/或分化為中性粒細(xì)胞的能力受損，此類患者可能患有嚴(yán)重的危及生命的感染，并可能發(fā)展成急性髓細(xì)胞性白血病或其他惡性腫瘤[Aprikyan等，Impaired survival of bone marrow hematopoietic progenitor cells in cyclic neutropenia(在周期性中性粒細(xì)胞減少癥中受損的骨髓造血祖細(xì)胞的存活)，Blood，97，147(2001)；GoranCarlsson等,Kostmann syndrome:severe congenital neutropenia associated with defective expression of Bcl-2,constitutive mitochondrial release of cytochrome C,and excessive apoptosis of myeloid progenitor cells(科斯特曼綜合征：與Bcl-2蛋白缺陷表達(dá)、細(xì)胞色素C的組成性線粒體釋放及骨髓祖細(xì)胞的過度凋亡相關(guān)聯(lián)的嚴(yán)重先天性中性粒細(xì)胞減少癥)，Blood，103，3355(2004)]。遺傳性或獲得性疾病，例如嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥或巴特綜合征是由各種基因突變引發(fā)的，并且因患者的血液和/或心肌細(xì)胞的制造和功能不足導(dǎo)致隨后的中性粒細(xì)胞減少癥、心肌梗塞和/或心力衰竭[Makaryan等,The cellular and molecular mechanisms for neutropenia in Barth syndrome(巴特綜合征中中性粒細(xì)胞減少癥的細(xì)胞和分子機(jī)制)，Eur J Haematol，88:195-209(2012)]。嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥的表型可由中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶基因、HAX1基因或Wiskott-Aldrich綜合征蛋白基因的不同取代、缺失、插入或截短突變引起[Dale等,Mutations in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia(先天性和周期性中性粒細(xì)胞減少癥中編碼中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的基因的突變)，Blood，96:2317-2322(2000)；Devriendt等,Constitutively activating mutation in WASP causes X-linked severe congenital neutropenia(WASP中的組成性激活突變導(dǎo)致X-連鎖的嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥)，Nat Genet.27:313-7(2001)；Klein等,HAXl deficiency causes autosomal recessive severe congenital neutropenia(Kostmann disease)(HAXl缺乏導(dǎo)致常染色體隱性遺傳的嚴(yán)重先天性中性粒細(xì)胞減少癥(科斯特曼病))，Nat Genet，39:86-92(2007)]。

其他遺傳性疾病，如巴特綜合征，是一種可能由線粒體TAZ基因的功能缺失突變所引發(fā)的多系統(tǒng)干細(xì)胞疾病，該類疾病與中性粒細(xì)胞減少癥(血中性粒細(xì)胞水平下降)相關(guān)聯(lián)，該類遺傳性疾病可能會導(dǎo)致復(fù)發(fā)性的嚴(yán)重的、有時甚至危及生命的致命性感染和/或可能會導(dǎo)致心力衰竭的心肌梗塞，該心力衰竭可通過心臟移植來解決。在大多數(shù)情況下，與發(fā)病機(jī)制和遺傳性或獲得性人類疾病的發(fā)展相關(guān)聯(lián)的該突變基因產(chǎn)物會影響不同的細(xì)胞內(nèi)事件(intracellular events)，這會導(dǎo)致異常的細(xì)胞功能和特定的疾病表型。

用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)治療這些患者會誘導(dǎo)位于細(xì)胞表面的G-CSF受體分子發(fā)生構(gòu)象變化，隨之引發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)事件，最終將中性粒細(xì)胞的生產(chǎn)恢復(fù)至接近正常水平，并提高患者的生活質(zhì)量[Welte和Dale， Pathophysiology and treatment of severe chronic neutropenia(嚴(yán)重的慢性中性粒細(xì)胞減少癥的病理生理學(xué)和治療)，Ann.Hematol.72,158(1996)]。然而，用G-CSF治療的患者可能進(jìn)化發(fā)展為白血病[Aprikyan等，Cellular and molecular abnormalities in severe congenital neutropenia predisposing to leukemia(嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥中的細(xì)胞和分子異常易誘發(fā)白血病)，Exp Hematol.31,372(2003)；Philip Rosenberg等,Neutrophil elastase mutations and risk of leukaemia in severe congenital neutropenia(嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥中中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶突變和白血病的風(fēng)險(xiǎn))，Br J Haematol.140,210(2008)；Peter Newburger等,Cyclic Neutropenia and Severe Congenital Neutropenia in Patients with a Shared ELANE Mutation and Paternal Haplotype:Evidence for Phenotype Determination by Modifying Genes(共有ELANE突變和父源單倍型患者的周期性中性粒細(xì)胞減少癥和嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥：通過修飾基因測定表型的證據(jù))，Pediatr.Blood Cancer,55,314(2010)]，這正是探索新的替代方法的原因。

可以通過使用截然不同的官能化納米粒子胞內(nèi)傳遞不同的生物活性分子，從而能夠更有效地影響和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)事件。這些生物活性分子可以使細(xì)胞功能正?；蚋鶕?jù)需要消除不需要的細(xì)胞。然而，細(xì)胞膜作為有效屏障保護(hù)細(xì)胞內(nèi)事件的級聯(lián)反應(yīng)免受外源性刺激的影響。

因此，在本領(lǐng)域中需要新型的生物活性分子，其能夠穿透細(xì)胞膜并實(shí)現(xiàn)所關(guān)心的細(xì)胞內(nèi)事件。本發(fā)明滿足了這些需要，并提供了更多相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及將蛋白質(zhì)和/或肽連接于生物相容性納米粒子以調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的官能化方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及官能化生物相容性納米粒子本身。

在一個實(shí)施方案中，一種能夠穿透哺乳動物細(xì)胞膜并胞內(nèi)傳遞用于調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的多個生物活性分子的官能化生物相容性納米粒子，包括：中央納米粒子，尺寸范圍為5～50nm，且在其上具有聚合物涂層；共價(jià)連接于所述聚合物涂層的多個官能團(tuán)，其中所述多個生物活性分子連接于所述多個官能團(tuán)，并且其中所述多個生物活性分子至少包括肽和蛋白質(zhì)，并且其中所述肽能夠穿透哺乳動物細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞，并且其中所述蛋白質(zhì)能夠在細(xì)胞內(nèi)提供新功能。

中央納米粒子可包括鐵，并有磁性。本發(fā)明所述的肽可以連接于蛋白質(zhì)(相反側(cè)連接于納米粒子)。肽和蛋白質(zhì)可各自通過一個或多個插入連接子分子而連接于納米粒子。在一些實(shí)施方式中，肽可以包括5～9個堿性氨基酸，而在其他實(shí)施方式中，肽包括9個以上堿性氨基酸。該蛋白質(zhì)可以是選自由Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、cMyc和Klf4組成的組的轉(zhuǎn)錄因子。

另一方面，本發(fā)明涉及改變哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞功能的方法。該新方法包括將有效量的官能化生物相容性納米粒子給予細(xì)胞，并改變細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞功能。細(xì)胞功能的改變涉及細(xì)胞理化特性的改變、細(xì)胞增殖特性的改變、細(xì)胞存活能力的改變或細(xì)胞形態(tài)學(xué)表型特性的改變。細(xì)胞功能的變化涉及細(xì)胞制造新細(xì)胞類型的獲取能力，所述新細(xì)胞類型包括干細(xì)胞或更多特化細(xì)胞類型。

本發(fā)明的上述及其他方面通過參考下面的詳細(xì)描述和附圖將變得更為清楚。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，可在不脫離本發(fā)明主旨和保護(hù)范圍的前提下對本說明書中公開的實(shí)施方式進(jìn)行各種改變、變更和替換。最后，本說明書中引用的各種參考文獻(xiàn)都明確地通過引用并入本文。

附圖說明

圖1示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的基于肽和蛋白質(zhì)分子同時連接于納米粒子的納米粒子多步驟官能化方案。

圖2A示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的含胺基納米粒子與等摩爾比的長鏈LC1-SPDP和碘乙酸納米粒子的反應(yīng)。

圖2B示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，還原PDP的二硫鍵以提供自由SH基納米粒子。

圖2C示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的長鏈LC1-SMCC與蛋白質(zhì)納米粒子的賴氨酸基團(tuán)的反應(yīng)。

圖2D示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多功能納米粒子與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，該蛋白質(zhì)已經(jīng)與SMCC反應(yīng)并且包含末端反應(yīng)性馬來酰亞胺基納米粒子。

圖2E示出肽的氨基與LC2-SMCC的反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該反應(yīng)后隨之進(jìn)行與巰基乙醇的反應(yīng)，將末端馬來酰亞胺轉(zhuǎn)化為醇納米粒子。

圖2F示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的功能珠(和連接有蛋白質(zhì))與帶修飾的肽的在納米粒子上自由羧基端的反應(yīng)。

圖3A示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的含胺基的納米粒子與LC1-SPDP納米粒子的反應(yīng)。

圖3B示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，還原PDP的二硫鍵以提供自由SH基納米粒子。

圖3C示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的長鏈LC2-SMCC與蛋白質(zhì)納米粒子的賴氨酸基團(tuán)的反應(yīng)。

圖3D示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多功能納米粒子與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，該蛋白質(zhì)已經(jīng)與SMCC反應(yīng)并且包含了末端反應(yīng)性馬來酰亞胺基納米粒子。

對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，結(jié)合附圖參考以下詳細(xì)描述時，本發(fā)明的上述和其它方案將變得更加清楚。

具體實(shí)施方式

為了胞內(nèi)傳遞生物活性分子，本發(fā)明的發(fā)明人提出了一種基于帶有共價(jià)連接的生物活性分子的細(xì)胞膜穿透性納米粒子的通用手段。為此，本發(fā)明人在此提出一種新官能化方法，其確保了蛋白質(zhì)和肽對納米粒子的共價(jià)連接。本發(fā)明的經(jīng)修飾了的細(xì)胞透過性納米粒子為胞內(nèi)傳遞用于調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和/或細(xì)胞功能正?；纳锘钚苑肿犹峁┝送ㄓ脵C(jī)制。

細(xì)胞正常增殖、遷移和分化成各種細(xì)胞類型的能力對胚胎發(fā)育和成熟細(xì)胞，包括但不限于各種遺傳性或獲得性疾病中造血細(xì)胞和心血管系統(tǒng)的干細(xì)胞/祖細(xì)胞和進(jìn)一步分化的細(xì)胞的功能是至關(guān)重要的。干細(xì)胞和/或進(jìn)一步分化的特化細(xì)胞類型的這種功能性能力在細(xì)胞內(nèi)事件中的異常改變所導(dǎo)致的各種病理狀態(tài)下會發(fā)生改變，但可通過胞內(nèi)引入生物活性成分而正常化。例如，在患有嚴(yán)重的危及生命的感染并可能發(fā)展成白血病的周期性中性粒細(xì)胞減少癥或嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥患者中觀察到人骨髓祖細(xì)胞的存活和/或分化為中性粒細(xì)胞的能力受損，其可通過中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的細(xì)胞膜穿透性小分子抑制劑而正?；?，它干擾異常的細(xì)胞內(nèi)事件并明顯地恢復(fù)正常表型。然而，這種小分子對導(dǎo)致疾病的目標(biāo)突變產(chǎn)物基本無效，這正是需要用于胞內(nèi)傳遞能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的生物活性分子的可替代性的有效的細(xì)胞膜穿透手段的原因。

本說明書中公開的方法利用生物相容性納米粒子，包括例如類似于前文在科學(xué)文獻(xiàn)中描述的超順磁性氧化鐵粒子。這種類型的納米粒子在臨床環(huán)境中可被用于骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾臟和肝臟的磁共振成像[參見例如Shen等，Monocrystalline iron oxide nanocompounds(MION)(單晶氧化鐵納米復(fù)合物(MION))；physicochemical properties.Magn.Reson.Med.,29,599(1993)；Harisinghani等，MR lymphangiography using ultrasmallsuperparamagnetic iron oxide in patients with primary abdominal and pelvic malignancies(對原發(fā)性腹腔和盆腔惡性腫瘤患者利用超小超順磁氧化鐵的MR淋巴管造影)，Am.J.Roentgenol.172,1347(1999)]。這些磁性氧化鐵納米粒子包含5nm左右的涂覆有交聯(lián)葡聚糖的核，并具有大約45nm的總粒子尺寸。重要的是，已經(jīng)證明這些包含交聯(lián)的細(xì)胞膜可透過性Tat-衍生肽的納米粒子，以每個細(xì)胞高達(dá)30pg的超順磁氧化鐵納米粒子的量，有效地內(nèi)在化到造血細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞中[Lewin等，Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells(Tat肽衍生磁性納米粒子實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)祖細(xì)胞的跟蹤和恢復(fù))，Nat.Biotechnol.18,410(2000)]。此外，納米粒子的插入不影響骨髓衍生CD34⁺原始祖細(xì)胞的增殖和分化特性或細(xì)胞存活能力[MaiteLewin等，Nat.Biotechnol.18,410(2000)]。這些納米粒子可用于在體內(nèi)跟蹤標(biāo)記細(xì)胞。

標(biāo)記細(xì)胞保持其分化能力，還可以使用磁共振成像在組織樣品中被檢測到。本發(fā)明人在此提出基于新納米粒子的手段，其被功能化以攜帶肽和蛋白質(zhì)，所述肽和蛋白質(zhì)可以作為優(yōu)良的載體胞內(nèi)傳遞生物活性分子用于目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)事件的細(xì)胞重編程解決方案并且調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和特性。

納米粒子-肽/蛋白質(zhì)耦合物的概述：

納米粒子基于鐵或帶有生物相容性涂層(例如葡聚糖多糖)的其它材料，其具有連接有不同長度的連接子的X/Y官能團(tuán)，反過來通過它們的X/Y官能團(tuán)共價(jià)連接于蛋白質(zhì)和/或肽(或其它小分子)。

可用于交聯(lián)的官能團(tuán)包括：

-NH₂(例如，賴氨酸，α-NH₂)；

-SH，

-COOH，

-NH-C(NH)(NH₂)，

碳水化合物，

-羥基(OH)，

-通過連接子上的疊氮基的光化學(xué)反應(yīng)連接。

交聯(lián)試劑包括：

SMCC[4-(N-馬來酰亞胺基-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯]也可以是磺基-SMCC，該磺基琥珀酰亞胺基衍生物用于交聯(lián)氨基和巰基。

LC-SMCC(長鏈SMCC)。也可以是磺基-LC-SMCC。

SPDP[N-琥珀酰亞胺基-3-(吡啶基二硫代)-丙酸酯]也可以是磺基-SPDP。與胺反應(yīng)提供巰基。

LC-SPDP(長鏈SPDP)。也可以是磺基-LC-SPDP。

EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽]用于將-COOH基團(tuán)與-NH₂基團(tuán)連接的試劑。

SM(PEG)n，其中n＝1,2,3,4……24乙二醇單位。也可以是磺基-SM(PEG)n衍生物。

SPDP(PEG)n，其中n＝1,2,3,4……12乙二醇單位。也可以是磺基-SPDP(PEG)n衍生物。

同時含有羧基和胺基的PEG分子。

含有羧基和巰基的PEG分子。

封端劑和阻斷劑包括：

檸康酸酐-對NH特異性

乙基馬來酰亞胺-對SH特異性

巰基乙醇-對馬來酰亞胺特異性

鑒于上述情況，本發(fā)明人處理了生物相容性納米粒子以在表面上產(chǎn)生功能性胺，其反過來被用于化學(xué)鍵合蛋白質(zhì)和短肽。

在將蛋白質(zhì)，例如綠色熒光蛋白或轉(zhuǎn)錄因子，連接于超順磁性納米粒子或可替代的納米粒子的情況下，可采用以下方法：外部包含氨基官能團(tuán)的超順磁珠可以通過商業(yè)渠道從不同的制造商處購得。它們的尺寸范圍可以是20-50nm，每毫升具有10¹⁵-10²⁰個納米粒子，每個納米粒子具有10個以上胺基團(tuán)。將納米粒子通過使用截留分子量為10,000道爾頓分子的Amicon離心過濾單元(微柱)放置到適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)緩沖液(0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.2)中。通常要求清洗大約四次以確保適合的緩沖系統(tǒng)。按照制造商所推薦的那樣，將納米粒子從過濾器單元中移出(通過低速旋轉(zhuǎn)翻轉(zhuǎn)柱/過濾裝置)。

將SMCC(來自Thermo Fisher)以1mg/ml的濃度溶解于由ACROS(密封小瓶且無水)得到的二甲基甲酰胺(DMF)。樣品密封且?guī)缀趿⒓词褂谩?/p>

將10μl溶液加入到納米粒子中至體積為200μl。這提供了相對于存在的可用胺基團(tuán)遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的SMCC，使反應(yīng)進(jìn)行1小時?？梢杂媒亓舴肿恿繛?000道爾頓分子的Amicon離心過濾柱移除過量的SM和DMF。通常要求5次體積更換以確保適當(dāng)?shù)木彌_交換。重要的是過量的SMCC在這個階段被除去。

將任何肽基分子，例如市售可得的綠色熒光蛋白(GFP)或純化的重組綠色熒光蛋白或其它蛋白質(zhì)加入到含有一定量的乙二醇的溶液中，在-30℃冷凍。邊劇烈攪拌邊加入在14μl、10μl新鮮制備的DTT(二硫蘇糖醇，克萊蘭氏試劑)中含3μg蛋白質(zhì)的PBS溶液。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通常含有一個以上的半胱氨酸，傾向于交聯(lián)不同的GFP分子。因此，過量的DTT還原二硫鍵并釋放綠色熒光蛋白。使反應(yīng)在4℃進(jìn)行2小時，然后通過截留分子量為3000的分子的Amicon離心過濾單元除去過量的試劑。

將活化的納米粒子和蛋白質(zhì)溶液混合，并使其反應(yīng)2小時，之后將未反應(yīng)的蛋白質(zhì)通過具有適當(dāng)?shù)慕亓舴肿恿?在使用GFP的本例中截留分子量為50,000道爾頓)的Amicon離心過濾裝置除去。樣品儲存于-80℃。也可以代替使用Amicon旋轉(zhuǎn)過濾柱，使用含有固定尺寸過濾組件的小旋轉(zhuǎn)柱、例如Bio Rad P柱。它們都是尺寸排阻柱。還應(yīng)當(dāng)指出的是SMCC也可以作為磺基衍生物(磺基-SMCC)購得，使其更溶于水。也可以用DMSO代替DMF作為標(biāo)記試劑的溶劑載體，另外它應(yīng)該是無水的。

所有的其他交聯(lián)試劑都可以以類似的方式被使用。SPDP也是以與SMCC相同的方式被施用于蛋白質(zhì)/適當(dāng)?shù)碾摹Ｋ兹苡贒MF。二硫鍵通過與DTT反應(yīng)1小時或1小時以上而被切斷。除去副產(chǎn)物和未反應(yīng)的材料后，通過使用截留分子量為3,000的Amicon離心過濾柱將其純化。

其他更直接可控的用肽和蛋白質(zhì)標(biāo)記納米粒子的手段是使用兩種不同的雙官能耦合劑。反應(yīng)順序有些類似于圖1。碘乙酸用于將選定數(shù)量的“羧基”基團(tuán)引入到納米粒子表面。

用氨基巰基乙醇處理含LC-SMCC的肽。這能夠通過巰基成鍵，并提供自由氨基。然后通過使用EDC將此氨基與納米粒子上的羧基耦合。已知EDC為1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽。該耦合步驟在反應(yīng)方案的最后執(zhí)行。

圖1示出磁性納米粒子-蛋白質(zhì)/肽加成物的一般性描述。磁性納米粒子涂覆有多糖，然后被官能化。其表面可以被胺取代。也可以改變/變形成任何其他的功能形式。擴(kuò)展子/連接子將兩個單元物理性連接在一起。

各種各樣的官能團(tuán)可被用于通過交聯(lián)反應(yīng)將納米粒子化學(xué)連接于蛋白質(zhì)?？捎玫墓倌軋F(tuán)的變化允許每次一個步驟地將大量的蛋白質(zhì)/肽連接于納米粒子。

類似地，各種交聯(lián)試劑或反應(yīng)催化劑可被用于通過異型雙官能試劑將納米粒子與蛋白質(zhì)/肽交聯(lián)。還應(yīng)當(dāng)指出的是這些交聯(lián)試劑有不同的長度。例如許多包含代表擴(kuò)展子或“長鏈”的LC符號。聚乙二醇化的化合物也可為不同的長度。這樣不同長度的連接子可以被加入到該納米粒子中，并對較大的分子(例如蛋白質(zhì))和小分子(例如肽)提供不同的連接長度。

通常，不同蛋白質(zhì)可能會含有相同的官能團(tuán)，因此很難用各種蛋白質(zhì)來標(biāo)記納米粒子。因?yàn)橛惺构倌軋F(tuán)發(fā)生變化的試劑，所以，能夠改變蛋白質(zhì)的官能團(tuán)，從而階段性地獲得選擇性而不會受到其他蛋白質(zhì)的干擾。這需要改變蛋白質(zhì)上的官能團(tuán)。

各種試劑可以用于改變蛋白質(zhì)，以便不同的化學(xué)作用可以用于由所希望的官能團(tuán)連接蛋白質(zhì)。例如，化合物(如SPDP)可以用于將胺轉(zhuǎn)換為巰基，然后其將與馬來酰亞胺部分反應(yīng)。

在逐步地將蛋白質(zhì)連接于珠(納米粒子)時，先前連接的蛋白質(zhì)的殘基和活性基團(tuán)可能干擾耦合化學(xué)作用。因而可使用永久性或可逆的封端劑阻斷這些活性部分以免受將要用于連接第二個或第三個蛋白質(zhì)到納米粒子上的試劑的干擾。

可使用大量不同的封端化合物阻斷未反應(yīng)部分。因?yàn)榉舛嘶衔镆部赡軙蓴_蛋白質(zhì)活性，所以需要謹(jǐn)慎使用。通常在第二個化學(xué)連接步驟是必需的，并且該官能團(tuán)可能會干擾時使用。

為了表明蛋白質(zhì)可以使用上面提到的化學(xué)作用連接于珠(納米粒子)，給出了磁性納米粒子的合成，其包含源自水母的綠色熒光蛋白質(zhì)。LCC-SMCC被用于該合成方案。

N-羥基琥珀酰亞胺與納米粒子上的自由胺基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)以形成化學(xué)鍵。提供能與GFP反應(yīng)的馬來酰亞胺端基。已知GFP具有兩個半胱氨酸，并且來自不同的GFP分子的半胱氨酸會反應(yīng)形成二硫鍵。為了消除這種干擾，首先用克萊蘭氏試劑(Cleland’s reagent)還原該分子。

將該蛋白質(zhì)純化，然后使其與含有LC-馬來酰亞胺基團(tuán)的珠反應(yīng)。使反應(yīng)進(jìn)行1小時，用Amicon旋轉(zhuǎn)過濾器(截留分子量50K)純化反應(yīng)。用熒光電子顯微鏡拍攝照片。

可以在納米粒子上設(shè)置多種類型的官能團(tuán)。使其能夠連接三個以上不同的蛋白質(zhì)。

首先是與表面上的胺。

特勞特試劑(Traut’s reagent)可用于將這些胺中的一部分轉(zhuǎn)化為巰基。除此之外，碘乙酸可以用于將部分胺轉(zhuǎn)化為羧酸。

對于蛋白質(zhì)和肽，胺都被轉(zhuǎn)化為如下詳細(xì)描述的具有不同連接子長度的官能團(tuán)。其將作為通用基團(tuán)來連接蛋白質(zhì)和肽。

圖1示出納米粒子官能化、肽類和蛋白質(zhì)與納米粒子的連接的示意性代表例。

如下所述地進(jìn)行合成和涂覆：通過Thermo Fisher在市售可得的NHS-LC-SPDP是長鏈擴(kuò)展子，兩端帶有對胺特異性的雙官能耦合劑，并且具有可被轉(zhuǎn)化為硫化物的二硫鍵。

擴(kuò)展子的一端有N-羥基琥珀酰亞胺酯，而另一端具有吡啶基二硫代基團(tuán)。這個二硫代基團(tuán)可以被還原而生成巰基。使NHS-LC-SPDP與納米粒子反應(yīng)，反應(yīng)可以從未被摻入的NHS-LC-SPD中清除。然后如圖1所示將耦合納米粒子還原。

制造耦合蛋白質(zhì)：用親和層析柱純化的生物活性蛋白質(zhì)含有來自羧基末端賴氨酸殘基的自由ε-胺基團(tuán)，羧基末端賴氨酸殘基是為了促進(jìn)與納米粒子連接而加入的。NHS-LC-SMCC用作雙官能耦合劑。該分子具有LC1鏈擴(kuò)展子。一端具有胺特異性的N-羥基琥珀酰亞胺試劑。另一端包含馬來酰亞胺基團(tuán)，具體為巰基。一旦材料與蛋白質(zhì)連接，就從反應(yīng)混合物中分離出來，馬來酰亞胺耦合蛋白質(zhì)將被添加到該含巰基的納米粒子中。所得材料通過凝膠過濾而分離。

肽耦合到納米粒子：在這種情況下，肽還包含羧基末端賴氨酸，其作為NHS酯-LC-馬來酰亞胺耦合的基體發(fā)揮作用。該分子具有LC2鏈擴(kuò)展子。所有流程都類似于上述對蛋白質(zhì)的描述。

在最佳實(shí)施方式中，膜透過性肽和蛋白質(zhì)將被以不同的比例混合，以實(shí)現(xiàn)最大數(shù)目的分子連接于納米粒子。根據(jù)之前公布的研究，每個納米粒子具有3～4個分子的表面結(jié)合細(xì)胞透過性肽就足以進(jìn)行有效的超順磁性納米粒子的胞內(nèi)傳遞。

利用LC2-擴(kuò)展臂提供了增加肽基分子鍵合量的重要手段。使用不同濃度的NHS-LC-SPDP使錨定在納米粒子表面的肽和蛋白質(zhì)分子的數(shù)量增加，因此，能夠?qū)崿F(xiàn)更有效的滲透以及更可靠的細(xì)胞重編程活性。

肽和蛋白質(zhì)連接于納米粒子：可以使用圖1所示的流程來實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，將SMCC標(biāo)記的蛋白質(zhì)和肽按比例加入到珠中并使其反應(yīng)。

用肽和蛋白質(zhì)標(biāo)記納米粒子的另一種更直接可控的手段是使用兩種不同的雙官能耦合試劑(圖2A-F)。反應(yīng)順序有些類似于圖1，一些改進(jìn)之處在下文中描述。

碘乙酸用于將選定數(shù)量的“羧基”基團(tuán)引入到納米粒子表面。這是在步驟I中進(jìn)行的(參見圖2A-F，步驟(I-VII))。

用氨基乙醇處理含有NH-LC-SMCC的肽。這能夠通過巰基成鍵，并提供自由氨基基團(tuán)。然后使用EDAC(EDC)將此氨基耦合于納米粒子上的羧基。已知EDAC為1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽。該耦合步驟在反應(yīng)方案的最后執(zhí)行。

另一方面，本發(fā)明還涉及用于調(diào)節(jié)胞內(nèi)活性的連接于官能化納米粒子的生物活性分子的傳遞方法。例如，首先將人體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或者市售可得的或使用標(biāo)準(zhǔn)或改良實(shí)驗(yàn)步驟可獲得的其它類型的細(xì)胞在無菌條件下平鋪(plate)到具有或不具有細(xì)胞粘附底物(飼養(yǎng)細(xì)胞，明膠、基質(zhì)膠、纖連蛋白等)的固體表面。將平鋪細(xì)胞(plated cell)與特定因子組合培養(yǎng)一段時間，使細(xì)胞分裂/增殖或維持可接受的細(xì)胞生存能力。實(shí)例是血清和/或各種生長因子，它可以在之后被除去或更新，而繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。在官能化生物相容性細(xì)胞透過性納米粒子的存在下培養(yǎng)平鋪細(xì)胞，該官能化生物相容性細(xì)胞透過性納米粒子在存在或不存在磁場的條件下使用此處描述的各種方法連接有生物活性分子。在超順磁性納米粒子的情況下使用磁鐵使得細(xì)胞和納米粒子之間的接觸表面積呈現(xiàn)重要的增長，從而進(jìn)一步增強(qiáng)官能化納米粒子對細(xì)胞膜的穿透。根據(jù)需要，用官能化納米粒子反復(fù)處理細(xì)胞群，以胞內(nèi)傳遞生物活性分子。

將細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，通過離心或細(xì)胞分離除去未摻入納米粒子，留下作為集群存在的細(xì)胞。然后，將集群細(xì)胞再懸浮，并在新鮮的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)一段適宜的時間?？梢酝ㄟ^分離、再懸浮和再培養(yǎng)的多次循環(huán)，直至觀察到胞內(nèi)傳遞的特定生物活性分子引起隨之發(fā)生的生物效應(yīng)后收集細(xì)胞。

本發(fā)明的一個用途是篩選對細(xì)胞重編程有效的一個化合物(或多個化合物)。該化合物使用本說明書中公開的一個或多個方法以所希望的細(xì)胞群連接于納米粒子，培養(yǎng)適當(dāng)時間，然后測定由化合物產(chǎn)生的任何調(diào)節(jié)作用?？梢园ǎ杭?xì)胞重編程的開始和多功能干細(xì)胞的產(chǎn)生，細(xì)胞分化或轉(zhuǎn)分化成進(jìn)一步特化的或不同特化的細(xì)胞類型，檢查細(xì)胞毒性，代謝變化或?qū)κ湛s活動的效果等功能。

本發(fā)明的另一種用途是生成作為藥物的特化細(xì)胞或在傳遞裝置中用以治療人體或動物體。這使得臨床醫(yī)生能夠?qū)⒓?xì)胞施用到受損組織(不論是心臟、肌肉、肝臟等)中或周圍，該施用是經(jīng)脈管系統(tǒng)施用或直接施用到肌肉或器官壁內(nèi)，從而植入特化細(xì)胞，控制損傷，并參與組織的肌肉組織再生和特化功能恢復(fù)。

本發(fā)明的一種用途涉及用其他蛋白質(zhì)(如Oct4和Sox2轉(zhuǎn)錄因子)官能化的納米粒子，從而確保具有保存完好的基因組的干細(xì)胞或進(jìn)一步分化的細(xì)胞類型的細(xì)胞重編程或產(chǎn)生。

本發(fā)明的另一種用途是篩選對細(xì)胞重編程有效的一個化合物(或多個化合物)。該化合物使用本說明書中公開的多個方法以所希望的細(xì)胞群連接于納米粒子，培養(yǎng)適當(dāng)時間，然后測定由化合物產(chǎn)生的任何調(diào)節(jié)作用?？梢园ǎ杭?xì)胞重編程的開始和多功能干細(xì)胞的產(chǎn)生，細(xì)胞分化或轉(zhuǎn)分化成進(jìn)一步特化的或不同特化的細(xì)胞類型，檢查細(xì)胞毒性，代謝變化或?qū)κ湛s活動的效果等功能。

本發(fā)明還有一種用途，就是生成作為藥物的特化細(xì)胞或在傳遞裝置中用以治療人體或動物體。這使得臨床醫(yī)生能夠?qū)⒓?xì)胞施用到受損組織(不論是心臟、肌肉、肝臟等)中或周圍，該施用經(jīng)脈管系統(tǒng)施用或直接施用到肌肉或器官壁內(nèi)，從而植入特化細(xì)胞，控制損傷，并參與組織的肌肉組織再生和特化功能恢復(fù)。

作為進(jìn)一步的說明(但并非是限制)，下面的實(shí)施例公開了本發(fā)明的其它方面。

實(shí)施例

實(shí)施例1

使用LC-SMM作為交聯(lián)劑將GFP連接到超順磁性粒子(連接于珠的胺基團(tuán))，然后將其直接耦合于GFP上的巰基。將LC-SMCC(來自Thermo Fisher)以1mg/μl的濃度溶解在由ACROS(密封小瓶且無水)得到的二甲基甲酰胺(DMF)。樣品密封且?guī)缀趿⒓词褂谩?/p>

將10μl溶液加入到納米粒子中至體積為200μl。這樣提供了相對于存在的可用的胺基團(tuán)遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的SMCC，使反應(yīng)進(jìn)行1小時?？梢杂媒亓舴肿恿繛?000道爾頓的分子的Amicon旋轉(zhuǎn)過濾器移除過量的SMCC和DMF。通常要求5次體積更換以確保適當(dāng)?shù)木彌_交換。重要的是過量的SMCC在這個階段被除去。

將任何肽基分子、例如市售可得的綠色熒光蛋白(GFP)或純化的重組綠色熒光蛋白或其它蛋白質(zhì)加入到含有一定量的乙二醇的溶液中，在-30℃冷凍。邊劇烈攪拌邊加入在14μl、10μl新鮮制備的DTT(二硫蘇糖醇，克萊蘭氏試劑(Cleland’s reagent))中含3μg蛋白質(zhì)的PBS溶液。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)通常含有一個以上的半胱氨酸，傾向于交聯(lián)不同的GFP分子。因此，過量的DTT還原二硫鍵并釋放綠色熒光蛋白。使反應(yīng)在4℃進(jìn)行2小時，然后通過截留分子量為3,000的Amicon離心過濾單元除去過量的試劑。

將活化的納米粒子和蛋白質(zhì)溶液混合，并使其反應(yīng)2小時，之后將未反應(yīng)的蛋白質(zhì)通過具有適當(dāng)?shù)慕亓舴肿恿?在使用GFP的本例中截留分子量為50,000道爾頓)的Amicon離心過濾單元除去。樣品儲存于-80℃。還應(yīng)當(dāng)指出的是也可以使用SMCC的磺基衍生物(磺基-SMCC)，其更溶于水。也可以用DMSO代替DMF作為標(biāo)記試劑的溶劑載體，另外它應(yīng)該是無水的。

實(shí)施例2

在該方法中，使用賴氨酸的氨基對珠上的巰基進(jìn)行耦合反應(yīng)。在這些研究中使用剛剛以pH 7.2的0.1M磷酸緩沖液平衡過的珠。新鮮配制1mg/ml(DMF中)的LC-SPDP。在劇烈攪拌下將10μl的SPDP溶液加入到珠懸浮液中，并使其反應(yīng)1小時。接著，將未反應(yīng)的材料通過離心去除，并使用截留分子量為10K的Amicon旋轉(zhuǎn)過濾器以磷酸鹽緩沖液清洗納米粒子。使用克萊蘭氏試劑切斷SPDP的二硫鍵，將1mg加入到溶液中，并使其反應(yīng)1小時。將副產(chǎn)物和未反應(yīng)的克萊蘭氏試劑通過截留分子量為10K的Amicon旋轉(zhuǎn)過濾器除去。

在上述反應(yīng)的進(jìn)行中，使用N-乙基馬來酰亞胺阻斷GFP。將過量的乙基馬來酰亞胺加入到GFP溶液中。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1小時，用截留分子量為3K的Amicon旋轉(zhuǎn)過濾器除去不需要的材料。然后，使GFP與過量的SMCC反應(yīng)1小時。隨后，將GFP用旋轉(zhuǎn)柱純化，然后與PDP-納米粒子反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)行1小時，并用截留分子量為50K的Amicon旋轉(zhuǎn)過濾器純化終產(chǎn)物。

實(shí)施例3

將從商業(yè)渠道獲得或使用所描述的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法[Moretti等，Mouse and human induced pluripotent stem cells as a source for multipotent Isll cardiovascular progenitors(小鼠和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞作為多能Isll心血管祖細(xì)胞的來源)。FASEB J.24:700(2010)]獲得的人體成纖維細(xì)胞在無菌條件下以150,000個細(xì)胞的密度平鋪在6孔板中的固體表面，該固體表面有或沒有以150,000-200,000的密度預(yù)先平鋪的飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞可通過商業(yè)渠道或用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室方法獲得。將平鋪細(xì)胞與特定因子組合培養(yǎng)一段時間，使細(xì)胞分裂/增殖或維持在含血清培養(yǎng)基中可接受的細(xì)胞存活能力，從而可以在之后除去或再生，并在濕潤的培養(yǎng)箱(5％CO₂和環(huán)境O₂)中在無菌條件下持續(xù)培養(yǎng)。

用50μl含有官能化生物相容性細(xì)胞透過性納米粒子的懸浮液處理在錐形管底部收集到的細(xì)胞或平鋪細(xì)胞，該官能化生物相容性細(xì)胞透過性納米粒子在存在或不存在磁場的情況下使用本說明書中公開的各種方法連接有生物活性分子。

在超順磁性納米粒子的情況下使用磁場使得細(xì)胞和納米粒子之間的接觸表面積呈現(xiàn)重要的增長，從而確保官能化納米粒子對細(xì)胞膜的穿透進(jìn)一步增強(qiáng)。重要的是，類似于連接有PEG的聚(乙二醇)PEG-介導(dǎo)保護(hù)的幾種以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的藥物(PEG-GCSF，Amgen，CA；PEG-干擾素，Schering-Plough/Merck，NJ)，用于與耦合肽連接的納米粒子增加了多肽的尺寸并遮住蛋白質(zhì)的表面，從而減少蛋白質(zhì)被蛋白水解酶降解，從而獲得所使用的蛋白質(zhì)分子更長期的穩(wěn)定性。根據(jù)需要，用官能化納米粒子反復(fù)處理細(xì)胞群，以胞內(nèi)傳遞生物活性分子

將細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，通過以約1200×g離心10分鐘除去未摻入的納米粒子，留下作為集群存在的細(xì)胞。然后，將集群細(xì)胞再懸浮，再使用類似的流程清洗，并在新鮮的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間?？梢酝ㄟ^分離、再懸浮和在培養(yǎng)基中再培養(yǎng)的多次循環(huán)直至觀察到胞內(nèi)傳遞的特定生物活性分子引起隨之發(fā)生的生物效應(yīng)，收集細(xì)胞。

在使用綠色熒光蛋白的特定例中，細(xì)胞透過性納米粒子將蛋白質(zhì)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，通過靶細(xì)胞獲得新的綠色熒光。該新獲得的能力允許后續(xù)的分選，以及將帶有胞內(nèi)傳遞的蛋白質(zhì)的細(xì)胞以高度均質(zhì)化進(jìn)行分離，其可進(jìn)一步用于各種應(yīng)用。重要的是，連接有蛋白質(zhì)的細(xì)胞透過性官能化納米粒子不會以任何形式整合到細(xì)胞基因組中，從而確保每個具有新(在這種情況下為熒光)特性的細(xì)胞保持完整的基因組，并保留細(xì)胞DNA的完整性。

在不脫離其主旨或本質(zhì)特征的情況下，本發(fā)明可以以其他具體形式實(shí)施。因此，上述實(shí)施方式應(yīng)被認(rèn)為是說明性的，而不是限制本說明書中描述的發(fā)明。因此，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書而不是由前面的說明書來表示，并且在與權(quán)利要求等同的含義和范圍內(nèi)的所有改變都涵蓋于此。