本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種抑制前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)表達(dá)的方法，可通過使用露那辛(lunasin)抑制機(jī)體前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9的產(chǎn)生，降低前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9的血清水平。可進(jìn)一步將露那辛作為前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9抑制劑用于制備治療前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9介導(dǎo)的相關(guān)疾病的藥物。

背景技術(shù)：

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)(proprotein convertase subtilisin/kexin 9,PCSK9)是一種由692個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，屬前蛋白轉(zhuǎn)化酶(proprotein convertases,PCs)家族中的第九個(gè)成員，是一種分泌型絲氨酸蛋白酶，主要在肝臟和腸道等組織中表達(dá)，然后分泌到血液中(J Biol Chem.2004；279(47):48865-48875；Trends Biochem Sci.2007；32(2):71-77)。PCSK9進(jìn)入血液循環(huán)后可與肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDL-R)的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，引導(dǎo)其進(jìn)入肝細(xì)胞到達(dá)溶酶體，使LDL-R在溶酶體中降解，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞表面LDL-R減少，進(jìn)而降低肝臟結(jié)合和清除LDL-C的能力，最終導(dǎo)致血液中LDL-C水平升高(Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105(35):13045-13050)。因此，可通過抑制PCSK9治療高膽固醇血癥(Annu Rev Pharmacol Toxicol.2014；54:273-293)。此外，最新研究顯示，PCSK9升高與肥胖及2型糖尿病(Pediatr Diabetes.2017.PMID:28093849,DOI:10.1111/pedi.12490；Diabetes Metab Res Rev.2016；32(2):193-199.)密切相關(guān)，也與腎病綜合癥及蛋白尿等慢性腎病(Int Urol Nephrol.2017.PMID:28084558，DOI:10.1007/s11255-017-1505-2)密切相關(guān)，因此，通過抑制PCSK9可以成為預(yù)防和治療這些與其相關(guān)的疾病的重要手段。

目前已有多種PCSK9抑制劑處于研發(fā)階段或已獲批上市成為治療高膽固醇血癥的藥物，其中主要包括：1、抗PCSK9抗體抑制劑，如美國Amgen公司的Evolocumab(AMG145)及Regeneron/Sanofi公司的Alirocumab(REGN727/SAR236553)已在美國和歐洲獲批上市(J Clin Pharmacol.2017；57(1):7-32)；2、小干擾RNA(SiRNA)抑制劑，如Alnylam公司的ALN-PCS可抑制PCSK9的轉(zhuǎn)錄，目前已進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)(Pharmacol Ther.2016；164:183-194)；3、小分子化合物，如小檗堿可以抑制PCSK9的轉(zhuǎn)錄和翻譯(J Biol Chem.2015；290(7):4047-4058；Atherosclerosis.2008；201(2):266-273)。

露那辛(lunasin)是一種最初從大豆中分離得到的活性肽，由43個(gè)氨基酸殘基組成，其序列為:SKWQHQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD(SEQ ID NO:1)，分子量為5KDa(J Biol Chem.1987；262(22):10502-10505)。已有研究表明，多肽露那辛具有抗腫瘤活性，在體外可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖(Oncotarget.2015；6(7):4649-4662)，抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲(Oncol Rep.2016；36(1):253-262)，在體內(nèi)可抑制小鼠皮膚癌和乳腺癌的發(fā)生(J Food Sci.2010；75(9):H311-316)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抑制PCSK9的方法，具體說是通過用多肽露那辛(lunasin)抑制肝細(xì)胞組織中前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)表達(dá)的方法。PCSK9是一種分泌型絲氨酸蛋白酶，主要在肝臟、小腸等組織中表達(dá)后分泌到血液中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PCSK9與高膽固醇血癥、肥胖、2型糖尿病、腎病綜合癥及蛋白尿等慢性腎病密切相關(guān)，本發(fā)明提供了一種采用多肽露那辛有效抑制PCSK9生成的方法，可應(yīng)用于制備上述與PCSK9相關(guān)的疾病的制劑或藥物。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

一種抑制前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9表達(dá)的方法，使用露那辛抑制機(jī)體前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9的產(chǎn)生，降低前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9的血清水平，所述露那辛的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

所述露那辛氨基酸C末端可以是非酰胺化或酰胺化的。

所述露那辛可通過基因工程方法、化合合成方法或者從天然植物材料中提取的方法制備得到。

上述方法，可將露那辛與其它前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9抑制劑聯(lián)合使用，所述前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9抑制劑包括PCSK9單克隆抗體、PCSK9小干擾RNA、PCSK9基因沉默寡核苷酸、小檗堿及其衍生物、姜黃素、海藻寡糖中的一種或幾種。

本發(fā)明還公開了一種露那辛的新用途，其特征在于露那辛作為前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9抑制劑用于制備治療前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9介導(dǎo)的相關(guān)疾病的藥物，包括高膽固醇血癥、肥胖、糖尿病(2型糖尿病)、腎病(腎病綜合癥及蛋白尿等慢性腎病)。

上述用途，可將露那辛可制備成藥學(xué)上接受的任何一種制劑，優(yōu)選片劑、膠囊、滴劑、粉針劑或水針劑。

上述藥物包括作為活性成分的露那辛及可藥用載體。較佳的，本發(fā)明的藥物有0.1-99.9％重量百分比的作為活性成分的露那辛。

“可藥用載體”包括但不限于：離子交換材料、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物傳遞系統(tǒng)(SEDDS)如d-維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯、吐溫或其他類似聚合介質(zhì)等藥物制劑用的表面活性劑、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸部分甘油酯混合、水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、硅酸鎂等。聚乙烯吡咯酮、纖維素物質(zhì)、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、乙烯-聚氧乙烯-嵌段聚合物和羊毛脂、環(huán)糊精如α-、β-、γ-環(huán)糊精或其經(jīng)化學(xué)修飾的衍生物如2-和3-羥丙基-β-環(huán)糊精等羥烷基環(huán)糊精或其他可溶性衍生物等均可用于促進(jìn)露那辛的藥物傳遞。

其他可藥用輔料如填充劑(如無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒和葡萄糖)、粘合劑(如微晶纖維素)、崩解劑(如交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素和交聯(lián)PVP)、潤滑劑(如硬脂酸鎂)、吸收促進(jìn)劑、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤濕劑、溶劑、增溶劑和著色劑等也可加入本發(fā)明的藥物中。

上述藥物的治療有效量為0.001-100mg/kg/d之間，可用于相關(guān)疾病的單一用藥或聯(lián)合用藥治療，為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的范圍。

附圖說明

圖1：lunasin呈劑量及時(shí)間依賴性抑制HepG2細(xì)胞中PCSK9的mRNA表達(dá)水平。圖1-1：不同濃度lunasin對PCSK9mRNA表達(dá)的影響；圖1-2：lunasin不同作用時(shí)間對PCSK9mRNA表達(dá)的影響。^*，^**，^***及^****表示與正常組比較P<0.05，P<0.01，P<0.001及P<0.0001(n＝3,means±SEM)。

圖2：lunasin呈劑量及時(shí)間依賴性抑制HepG2細(xì)胞PCSK9蛋白的表達(dá)。圖2-1：不同濃度lunasin對HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9蛋白表達(dá)的影響；圖2-2：不同濃度lunasin對HepG2細(xì)胞分泌PCSK9蛋白的影響；圖2-3：lunasin不同作用時(shí)間對HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9蛋白表達(dá)的影響。^*及^**表示與正常組比較P<0.05及P<0.01(n＝3,means±SEM)。

圖3：Western blot檢測PCSK9蛋白在ApoE^-/-小鼠肝臟內(nèi)的表達(dá)。^####表示與正常對照組比較，P<0.0001；^***表示與模型組比較，P<0.001(n＝8,means±SEM)。

圖4：免疫熒光檢測lunasin對ApoE^-/-小鼠肝臟分泌PCSK9蛋白的影響。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實(shí)施例限制。

本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，該實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。

下述實(shí)例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明：

實(shí)施例1 lunasin有效抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因的表達(dá)

多肽露那辛(lunasin)藥物采用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)室建立的基因工程方法(Setrerrahmane,S.Appl Biochem Biotechnol 174(2014),612-622)制備得到。人肝癌細(xì)胞株HepG2(購自中科院上海細(xì)胞庫)用含10％FBS(Cat:10099141,Gibco)MEM培養(yǎng)基(41500034,Gibco)重懸后，以5×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，置于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)匯合至80％時(shí)，棄原培養(yǎng)基，PBS洗一次，每孔加入1ml Opti-MEM培養(yǎng)基(Cat:51985042,Gibco)平衡1h后加藥處理。量效實(shí)驗(yàn)給藥方法：lunasin給藥濃度為0、0.2、1及5μM，給藥時(shí)間為24h；時(shí)效性實(shí)驗(yàn)給藥方法：lunasin給藥濃度為5μM，給藥時(shí)間為1、2、4、8、16及24h。藥物處理結(jié)束后，采用Quantitative Real Time-PCR(qRT-PCR)檢測lunasin對HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因表達(dá)水平的影響。

1.總RNA提取

細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，6孔板每孔加入1ml RNAiso Plus(Takara,9108Q)，反復(fù)吹打至無明顯沉淀。于室溫靜置5min，加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，待溶液充分乳化，室溫靜置5min后，12000rpm，4℃離心15min。小心吸取400μl上清液，注意不要觸碰到蛋白帶和EP管管壁。于上清中加入異丙醇(等體積)，上下顛倒混勻，室溫靜置10min后，4℃，12000rpm，離心10min，獲得RNA沉淀。緩慢加入75％的乙醇，輕輕上下顛倒清洗5-6次，7500rpm，4℃離心5min后，盡除乙醇。室溫干燥沉淀約10min，至無液體殘余，加入適量RNase-free水溶解后-80℃保存?zhèn)溆?。用NanoDrop 2000/2000c分光光度計(jì)測定各樣品的RNA濃度和純度。RNA盡量于當(dāng)天逆轉(zhuǎn)錄成cDNA-20℃儲存。

2.cDNA合成

按表1依次加入各試劑以去除RNA中的基因組DNA。然后按表2建立逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，每20μl反應(yīng)體系中加入1μg RNA。相關(guān)試劑購自大連寶生物Takara公司。

表1 去除基因組DNA反應(yīng)體系

混勻后，瞬時(shí)離心，42℃2min(或者室溫5min)，4℃hold。

表2 cDNA合成反應(yīng)體系

混勻后，瞬時(shí)離心，進(jìn)行cDNA的合成。逆轉(zhuǎn)錄條件如下：37℃15min，85℃5s,4℃保存。

3.qRT-PCR檢測

qRT-PCR引物序列見表3，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。按表4建立反應(yīng)體系，試劑由大連寶生物Takara公司提供(Cat#RR820A)，混勻后，瞬時(shí)離心，并按表5所示程序進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。根據(jù)以下公式繪制各基因PCR擴(kuò)增效率曲線：E(％)＝(10^-/slope-1)×100。取樣品100ng cDNA如上進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)置NTC組(the no-temple control)，用ΔΔCt法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其公式為：2^-ΔΔCT＝2^{-[(CT gene of interest-CT internal control)sampleA-(CT gene of interest–CT internal control)sample B]}

表3 qRT-PCR引物表

表4 20μl PCR反應(yīng)體系

表5 PCR反應(yīng)程序

qRT-PCR法檢測lunasin對HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果見圖1。量效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：0.2、1、5μΜlunasin作用于HepG2細(xì)胞24h后，與正常組比較，lunasin呈劑量依賴性抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因的表達(dá)，其中，5μΜlunasin作用最顯著(P<0.0001)(圖1-1)。時(shí)效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：5μΜlunasin處理HepG2細(xì)胞1、2、4、8、16、24h后，lunasin呈劑量依賴性抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9基因的表達(dá)，其中，5μΜlunasin作用24h抑制作用最顯著(P<0.0001)(圖1-2)。

由此證明，lunasin在轉(zhuǎn)錄水平呈劑量和時(shí)間依賴性抑制HepG2細(xì)胞PCSK9基因的表達(dá)，5μΜlunasin作用于HepG2細(xì)胞24h，抑制效應(yīng)最為顯著。

實(shí)施例2 lunasin有效抑制HepG2細(xì)胞PCSK9蛋白表達(dá)

1.細(xì)胞總蛋白提取

培養(yǎng)于6孔板內(nèi)的HepG2細(xì)胞經(jīng)藥物分組處理后，收集1ml細(xì)胞培養(yǎng)液上清以10kd超濾管濃縮并定容至100μl。同時(shí)HepG2細(xì)胞以4℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，每1×10⁶個(gè)細(xì)胞中，加入100μl RIPA細(xì)胞裂解液(PMSF:RIPA＝1:100)，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞輕輕刮下，冰上裂解30min后，冰浴條件下超聲處理(超聲模式為超聲1s，間歇2s，總時(shí)長1min)，4℃，12000rpm離心10min，收集細(xì)胞裂解液上清，并用BCA法測定各組蛋白含量。根據(jù)各組蛋白含量，稀釋各樣品至同一濃度，以確保蛋白上樣量一致，加入5×Loading Buffer，混勻后煮沸5min，使蛋白變性，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.SDS-PAGE電泳

按表6制備12％SDS-PAGE膠，每孔上樣量為20～30μg蛋白，對照孔上5μl預(yù)染Marker,對樣品進(jìn)行電泳分離，電泳條件為：80V電泳約30min，120V繼續(xù)電泳至溴酚蘭到紅線以下。

表6 SDS-PAGE膠配制表

3.轉(zhuǎn)膜

電泳結(jié)束后，依據(jù)分離膠的大小，剪取0.22μm PVDF膜1張和濾紙6張。PVDF膜先用甲醇浸泡5min，雙蒸水中漂洗2min，再將PVDF膜和濾紙均于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10min后，直接在裝置的負(fù)極板上制作“三明治”，從負(fù)至正依次為：多孔性墊片-3層濾紙-膠-PVDF膜-3層濾紙-多孔性墊片。注意四邊對齊并小心趕出氣泡，冰水浴根據(jù)目的蛋白分子量60V-100V恒壓轉(zhuǎn)膜100min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜標(biāo)記正反面后，TBST清洗5min，加入麗春紅染色3-5min至出現(xiàn)清晰條帶，拍照記錄。

4.封閉

TBST漂洗2-3次，每次5min，去除麗春紅后，于10ml封閉液(含5％脫脂奶粉的TBST)中室溫封閉1h。TBST洗3次，5min/次。

5.抗體孵育

根據(jù)目的蛋白分子量，將膜剪成相應(yīng)大小，并剪去左上角作標(biāo)記。用含5％脫脂奶粉的TBST以1：1000稀釋抗PCSK9抗體(Cat:ab125251,abcam)，加至相應(yīng)的PVDF膜上，4℃孵育過夜。TBST洗3次，5min/次。用二抗稀釋液以1:5000稀釋二抗，加至PVDF膜上，室溫于水平搖床孵育2h。

6.顯色鑒定

TBST清洗PVDF膜3次，5min/次。加ECL顯色液于PVDF膜上，天能Tanon凝膠成像儀成像，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Western blot法檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)和分泌至細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的PCSK9蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(圖2)顯示，0.2、1、5μM lunasin作用于細(xì)胞24h后，Western blot法檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)(圖2-1)及分泌至細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的PCSK9蛋白(圖2-2)。由此說明，與正常組相比，lunasin均呈劑量依賴性抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)及分泌至細(xì)胞培養(yǎng)液中的PCSK9蛋白水平，且5μM lunasin抑制作用最顯著(P<0.01)。進(jìn)一步檢測lunasin不同作用時(shí)間對HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9蛋白表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖2-3所示，5μM lunasin作用于細(xì)胞1、2、4、8、16、24h后，lunasin呈時(shí)間依賴性抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)PCSK9蛋白表達(dá)，且24h抑制效應(yīng)最顯著(P<0.01)。由此證明，lunasin呈劑量和時(shí)間依賴性抑制HepG2細(xì)胞表達(dá)PCSK9蛋白。

因此，實(shí)例1和2實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，lunasin可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著抑制HepG2細(xì)胞中PCSK9基因的表達(dá)。

實(shí)施例3 Lunasin腹腔給藥可以有效抑制ApoE^-/-小鼠肝臟組織PCSK9的表達(dá)

1.動(dòng)物分組及藥物處理

6周齡ApoE^-/-小鼠及C57BL/6小鼠各16只均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2012-0001。動(dòng)物喂養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房，維持室溫25℃，濕度40％-70％，明暗各12h，小鼠自由進(jìn)食飲水。小鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，ApoE^-/-小鼠給予高脂飼料(Research Diets,D12108C)，C57BL/6小鼠給予基礎(chǔ)飼料，喂養(yǎng)6周后，ApoE^-/-小鼠隨機(jī)分為模型組(生理鹽水)、給藥組(0.5μmol/kg lunasin)，C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對照組(生理鹽水)和陰性藥物組(0.5μmol/kg lunasin),每組各8只動(dòng)物。采用腹腔注射方式給藥，給藥劑量為0.5μmol/kg，1次/天，連續(xù)給藥4周后，小鼠麻醉后處死，分離肝臟，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.Western blot檢測lunasin對ApoE^-/-小鼠肝臟PCSK9蛋白表達(dá)的影響

分離小鼠肝組織后，眼科剪剪碎，4℃預(yù)冷的生理鹽水洗滌3次，以除去殘血，加蛋白裂解液(鉑優(yōu)生物公司產(chǎn)品)(每100mg肝臟加入600μl裂解液)勻漿后，冰上裂解30min(隔10min渦旋振蕩1次)，12000r 4℃離心15min，取上清至離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?。BCA法測蛋白濃度后采用Western blot方法檢測小鼠肝臟PCSK9蛋白表達(dá)水平，具體方法同實(shí)施例2。

結(jié)果如圖3所示，C57BL/6小鼠腹腔注射0.5μmol/kg lunasin 4周后，其肝組織內(nèi)PCSK9蛋白水平與正常對照組相比無顯著差異，說明lunasin不影響正常C57BL/6小鼠肝組織表達(dá)PCSK9蛋白。另外，與正常對照組比較，ApoE^-/-模型組小鼠肝組織PCSK9蛋白水平顯著升高，差異顯著(P<0.0001)，然而ApoE^-/-小鼠腹腔注射0.5μmol/kg lunasin 4周，則可顯著抑制其肝組織內(nèi)PCSK9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.001)。由此可見，lunasin不影響正常小鼠肝組織分泌PCSK9蛋白，然而可以顯著抑制ApoE^-/-小鼠PCSK9蛋白水平升高。

3.免疫熒光檢測lunasin對ApoE^-/-小鼠肝臟分泌PCSK9蛋白水平的影響

小鼠肝組織分離后，立即放入4％多聚甲醛中固定48h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度4μm。切片常規(guī)脫蠟復(fù)水后，進(jìn)行免疫熒光學(xué)檢測。

(1)組織切片后，60℃烤1h；

(2)依次脫蠟：二甲苯Ⅰ15min,二甲苯Ⅱ15min，無水乙醇5min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，PBS 5min；

(3)脫蠟后的切片置于檸檬酸緩沖液中，加熱煮沸20min，自然冷卻后，PBS洗3次，5min/次；

(4)3％H₂O₂室溫10min，PBS洗3次，5min/次；

(5)10％山羊血清封閉，室溫30min；

(6)棄封閉液，滴加PCSK9一抗(1：200)，4℃孵育過夜；

(7)37℃復(fù)溫45min，PBS洗3次，5min/次；

(8)滴加Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔二抗(1：500)，37℃避光孵育60min；

(9)PBS洗3次，5min/次；

(10)滴加DAPI,染色10min，晾干，加甘油封片。倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

結(jié)果(圖4)顯示：正常對照組C57BL/6小鼠和陰性藥物組C57BL/6小鼠肝組織間隙可見少量綠色熒光，表示該小鼠肝組織內(nèi)有少量PCSK9蛋白分泌；模型組ApoE^-/-小鼠肝組織間隙有大量明亮的綠色熒光，表示其肝組織分泌PCSK9蛋白明顯增多；給予lunasin腹腔注射4周后，ApoE^-/-小鼠肝組織間隙綠色熒光顯著減少，說明lunasin腹腔給藥治療4周后可顯著抑制ApoE^-/-小鼠肝組織分泌PCSK9蛋白。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，多肽lunasin腹腔給藥后可顯著抑制ApoE^-/-小鼠肝臟組織表達(dá)和分泌PCSK9蛋白。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國藥科大學(xué)

<120> 一種抑制前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9表達(dá)的方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> Soybean seeds

<400> 1

Ser Lys Trp Gln His Gln Gln Asp Ser Cys Arg Lys Gln Leu Gln Gly Val Asn Leu Thr Pro Cys Glu Lys His Ile Met Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

AGGGGAGGACATCATTGGTG

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CAGGTTGGGGGTCAGTACC

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CAGGGCAGTGATCTCCTTCT