本發(fā)明涉及藥物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種多肽-抗體免疫偶聯(lián)物及其制備方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是僅此于心腦血管疾病的人類第二大殺手，近年來，隨著治療性單克隆抗體臨床應(yīng)用的逐漸增加，抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)的抗腫瘤效果日益受到重視。抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用是指具有殺傷活性的細(xì)胞(如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等)通過其表面表達(dá)的Fc受體(FcR)識(shí)別包被于靶抗原(如細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞)上的Fc段，直接殺傷靶細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是介導(dǎo)ADCC特異性抗腫瘤最主要的效應(yīng)細(xì)胞，而吞噬細(xì)胞、T細(xì)胞及粒細(xì)胞對(duì)ADCC抗腫瘤效應(yīng)也有一定作用。ADCC被證明是單克隆抗體臨床治療腫瘤的重要機(jī)制和手段，在抗體介導(dǎo)的ADCC作用的發(fā)生過程中，抗體只能與靶細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，而NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞可殺傷任何已與抗體結(jié)合的靶細(xì)胞，故抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，NK細(xì)胞等對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用是非特異性的。但并非所有的腫瘤類型都有十分特異的抗體，ADCC作用的發(fā)生十分依賴于抗體的特異性和有效性，上述情況限制了這一療法在腫瘤治療中的應(yīng)用。

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞是一種快速增殖的細(xì)胞，在生長過程中需要大量氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，腫瘤部位間質(zhì)高壓和血管異常限制了氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的輸運(yùn)，無氧呼吸產(chǎn)生的乳酸在腫瘤部位堆積，導(dǎo)致腫瘤部位偏酸的性質(zhì)。

細(xì)胞穿膜肽(CPPs)又稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域或膜轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，是由30個(gè)氨基酸或更少的氨基酸組成的具有穿透細(xì)胞膜能力的多肽。自1988年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)穿膜肽Tat可以一種無毒且高效的方式穿入細(xì)胞后，穿膜肽就一直作為一種細(xì)胞內(nèi)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的工具。它可以通過化學(xué)結(jié)合或基因融合等方式攜帶蛋白質(zhì)、DNA、化學(xué)藥物、核苷酸、40nm磁珠和200nm脂質(zhì)體等各種生物大分子穿透細(xì)胞生物膜和血腦屏障并且沒有明顯的細(xì)胞毒性，也沒有細(xì)胞種類的限制，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域都有很大的研究價(jià)值。但是，由于CPPs的穿膜作用缺乏特異性，人們?cè)噲D尋找某些適宜的靶向策略即在CPPs到達(dá)腫瘤組織之前設(shè)法屏蔽其結(jié)構(gòu)域，當(dāng)CPPs到達(dá)腫瘤組織后完全去屏蔽,從而規(guī)避非特異性攝取，以提高CPPs在腫瘤治療方面的應(yīng)用，pH敏感型CPPs是其中的優(yōu)良代表。組氨酸的pKa≈6.5，含組氨酸的多肽在pH≤6.5時(shí)會(huì)發(fā)生質(zhì)子化而帶正電荷，而在pH 7.4時(shí)大部分不帶電荷。應(yīng)用這一原理構(gòu)建的pH敏感型CPPs可在微酸性環(huán)境中(腫瘤組織)發(fā)揮穿膜作用而對(duì)正常組織沒有影響。

本發(fā)明旨在構(gòu)建一種可廣泛應(yīng)用于各類實(shí)體瘤的抗體或抗體片段，該抗體或抗體片段既能靶向腫瘤組織，又能介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，殺傷腫瘤細(xì)胞，彌補(bǔ)引發(fā)ADCC的抗體受限制腫瘤細(xì)胞表面抗原變大的限制，擴(kuò)大其以ADCC為殺傷機(jī)制的免疫治療的使用范圍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤的可誘導(dǎo)ADCC的多肽-抗體免疫偶聯(lián)物及其制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的多肽-抗體免疫偶聯(lián)物，所述免疫偶聯(lián)物由多肽與抗體或抗體Fc段通過共價(jià)鍵連接而成，其中，所述多肽為pH敏感型穿膜肽(pHLIP)。

所述多肽的序列如下：Ac-ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT，其中，Ac為乙?；?/p>

本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物是由pH敏感型穿膜肽與抗體Fc段或抗體通過琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-1羥酸酯共價(jià)鍵連接而成，即所述pH敏感型穿膜肽N端半胱氨酸殘基上的巰基與抗體Fc段賴氨酸殘基上的ε-氨基通過琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-1羥酸酯共價(jià)交聯(lián)而成。

本發(fā)明所述抗體或抗體Fc段為可誘導(dǎo)ADCC的抗體或抗體片段，包括人CD20抗體(例如，利妥昔單抗)，小鼠IgG 2a或IgG 2b的Fc片段等。

本發(fā)明的多肽-抗體免疫偶聯(lián)物中，每個(gè)抗體或抗體Fc段連接1-2條pH敏感型穿膜肽。

本發(fā)明的多肽-抗體Fc段免疫偶聯(lián)物，可按照如下方法制備得到，包括步驟：

S1、抗體Fc段與交聯(lián)劑琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-1羥酸酯在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)約0.5-1.5h(優(yōu)選1h)，形成馬來酰亞胺修飾的Fc蛋白，即Fc-SMCC；

S2、將步驟S1所得產(chǎn)物與pH敏感型穿膜肽在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中室溫?cái)嚢杓s2-4h(優(yōu)選4h)，即得所述多肽-抗體Fc段免疫偶聯(lián)物。

其中，抗體Fc段和交聯(lián)劑的摩爾比為0.025-0.5:1，pH敏感型穿膜肽與Fc-SMCC的摩爾比為0.1-1:10。

前述的方法，步驟S1還包括將生成的Fc-SMCC通過Sephadex G25除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，并通過截留分子量3KDa的Amicon ultra超濾管對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行濃縮的步驟。

前述的方法，步驟S2還包括將生成的多肽-抗體Fc段免疫偶聯(lián)物用截留分子量10KDa的Amicon ultra超濾管除去未反應(yīng)的pH敏感型穿膜肽的步驟。所得反應(yīng)產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)進(jìn)行分子量測定。

本發(fā)明多肽-抗體Fc段免疫偶聯(lián)物的制備方法中，反應(yīng)所使用的緩沖液均通氮?dú)獬浞峙懦鯕?，所有反?yīng)均在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。

本發(fā)明多肽-抗體免疫偶聯(lián)物的合成過程及作用機(jī)理見圖1。

本發(fā)明的穿膜肽-抗體Fc段免疫偶聯(lián)物(pHLIP-Fc)既保留了穿膜肽pH響應(yīng)穿膜的特點(diǎn)，又保留了抗體Fc段引起抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)的功能。體外實(shí)驗(yàn)證明，pHLIP-Fc可實(shí)現(xiàn)酸響應(yīng)型穿膜并將Fc段蛋白錨定在細(xì)胞膜上誘發(fā)ADCC。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pHLIP-Fc明顯抑制小鼠黑色素瘤和乳腺癌的生長。因此，pHLIP-Fc偶聯(lián)物可用于臨床實(shí)體瘤的免疫治療。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(一)本發(fā)明成功解決了以ADCC免疫療法依賴腫瘤表面抗原的問題，該方法將抗體Fc段直接錨定在腫瘤細(xì)胞表面進(jìn)步一引發(fā)ADCC。

(二)本發(fā)明多肽-抗體免疫偶聯(lián)物的合成方法簡單，快速，無需構(gòu)建融合蛋白。

(三)該合成方法保留了多肽和抗體各自的生物學(xué)活性，即抗體Fc段上游離氨基與多肽NH3端半胱氨酸巰基偶聯(lián)，不影響免疫細(xì)胞對(duì)Fc段識(shí)別與穿膜肽COOH端的穿膜行為。

附圖說明

圖1為本發(fā)明多肽-抗體免疫偶聯(lián)物的合成過程及作用機(jī)理。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中pHLIP-Fc偶聯(lián)物的SDS-PAGE分析結(jié)果(考馬斯亮藍(lán)染色)。其中，M為蛋白Marker，泳道1為Fc蛋白，泳道2為馬來酰亞胺修飾的Fc蛋白，泳道3為pHLIP-Fc免疫偶聯(lián)物。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中pHLIP-Fc偶聯(lián)物的MALDI-TOF分析結(jié)果。其中，小鼠IgG2a Fc蛋白二聚體的分子量為58kDa，pHLIP分子量為4kDa，二者偶聯(lián)產(chǎn)物根據(jù)pHLIP在Fc蛋白上的偶聯(lián)數(shù)目不同可見分子量為62kDa，66kDa，70kDa，74kDa產(chǎn)物。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中激光共聚焦顯微鏡觀察pHLIP-Fc免疫偶聯(lián)物在酸性pH和生理pH條件下的細(xì)胞膜錨定作用。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中pHLIP-Fc偶聯(lián)物對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞(A)和乳腺癌4T1(B)細(xì)胞的殺傷作用評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中pHLIP-Fc偶聯(lián)物對(duì)小鼠黑色素瘤B16(A)和乳腺癌4T1(B)的免疫治療效果。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例5中pHLIP-利妥昔單抗偶聯(lián)物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231殺傷作用評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖4-圖6中，pHLIP-Fc/a代表小鼠IgG 2a Fc蛋白與穿膜肽pHLIP構(gòu)建的免疫偶聯(lián)物。pHLIP-Fc/b代表小鼠IgG 2b Fc蛋白與穿膜肽pHLIP構(gòu)建的免疫偶聯(lián)物。pHLIP-Fc/G3代表小鼠IgG3Fc蛋白與穿膜肽pHLIP構(gòu)建的免疫偶聯(lián)物。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

以下實(shí)施例中多肽pHLIP的序列如下：Ac-ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT。

實(shí)施例1穿膜肽-抗體Fc段偶聯(lián)物(pHLIP-Fc)的制備

1、小鼠IgG2a Fc蛋白與sulfo-SMCC的共價(jià)交聯(lián)

取200μg小鼠IgG2a Fc蛋白與55.2μg sulfo-SMCC溶解在0.5mLpH＝7.4的10mM磷酸鹽緩沖溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h。用10mL10mM磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)平衡NAP-5Sephadex G25柱，將0.5mL反應(yīng)產(chǎn)物加入柱中，除去未反應(yīng)的SMCC，并通過截留分子量3KDa的Amicon ultra超濾管對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行濃縮離心至200μL，得到馬來酰亞胺修飾的Fc蛋白。

2、將步驟1所得產(chǎn)物與0.2mg pHLIP溶解在pH＝7.4的0.3mL 10mM磷酸鹽緩沖溶液中室溫?cái)嚢?h，生成pHLIP-Fc。并用截留分子量10KDa的Amicon ultra超濾管離心除去未反應(yīng)的pHLIP，得到pHLIP-Fc/2a。所得產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(圖2)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(圖3)進(jìn)行分子量測定。pHLIP-Fc/b和pHLIP-Fc/G3的偶聯(lián)物制備同pHLIP-Fc/a。

實(shí)施例2pHLIP-Fc免疫偶聯(lián)物在酸性pH和生理pH條件下的細(xì)胞膜錨定作用

將B16細(xì)胞接種在共聚焦皿中，37℃5％CO₂培養(yǎng)一段時(shí)間。用pH計(jì)對(duì)DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)進(jìn)行調(diào)整，得到pH6.8和pH7.4的完全培養(yǎng)基。用pH計(jì)對(duì)磷酸鹽緩沖液pH進(jìn)行調(diào)整，得到pH6.8和pH7.4的磷酸鹽緩沖液。

(1)pHLIP-Fc在微酸條件下(pH＝6.8)的細(xì)胞膜錨定作用觀察。細(xì)胞融合到60％時(shí)，用pH＝6.8磷酸鹽緩沖液洗三遍，將pHLIP-Fc/a和pHLIP-Fc/b稀釋在pH＝6.8的完全培養(yǎng)基中，加入共聚焦皿。37℃ 5％CO₂培養(yǎng)細(xì)胞2h后，棄去培養(yǎng)基，pH＝6.8磷酸鹽緩沖液洗三遍，4％多聚甲醛固定15min。封閉液室溫封閉60min后，加入封閉液稀釋的異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗小鼠熒光二抗，37度孵育30min，磷酸鹽緩沖液洗3次。Hoechst染核10min,磷酸鹽緩沖液洗3次，在激光顯微鏡下進(jìn)行觀察，Hoechst的激發(fā)波長為405，F(xiàn)ITC激發(fā)波長為488。

(2)pHLIP-Fc在生理?xiàng)l件下(pH＝7.4)的細(xì)胞膜錨定作用觀察。操作步驟同pHLIP-Fc在微酸條件下(pH＝6.8)的細(xì)胞膜錨定作用觀察，pHLIP-Fc處理階段的完全培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液pH為7.4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。圖4顯示pHLIP-Fc/a偶聯(lián)物和pHLIP-Fc/b偶聯(lián)物在微酸條件下(pH值6.8)的細(xì)胞處理組可見FITC熒光信號(hào)，該信號(hào)均勻分布于B16細(xì)胞表面，證明pHLIP通過穿膜行為將偶聯(lián)物固定在細(xì)胞表面。而在生理?xiàng)l件下(pH值7.4)，處理組基本無FITC信號(hào)。

實(shí)施例3pHLIP-Fc偶聯(lián)物引起抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用ADCC能力鑒定

提取C57/BL-6小鼠全脾細(xì)胞為ADCC效應(yīng)細(xì)胞，并對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。靶細(xì)胞選擇小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞和乳腺癌4T1細(xì)胞。

(1)在微酸條件下(pH值6.8)的ADCC能力鑒定

對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行不同藥物組處理，每種藥物均在pH6.8的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞1h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中所用緩沖液pH值均調(diào)整為6.8。胰蛋白酶消化靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按25:1比例混合接入96孔板，靶細(xì)胞為20000個(gè)/孔，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞在pH6.8的培養(yǎng)基中相互作用4h。

(2)在生理?xiàng)l件下(pH值7.4)的ADCC能力鑒定

對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行不同藥物組處理，每種藥物均在pH7.4的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞1h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中所用緩沖液pH值均調(diào)整為7.4。胰蛋白酶消化靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按25:1比例混合接入96孔板，靶細(xì)胞為20000個(gè)/孔，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞在pH7.4的培養(yǎng)基中相互作用4h。

利用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效率。設(shè)置如下對(duì)照組并測定各對(duì)照組乳酸脫氫酶含量。

①效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放乳酸脫氫酶(LDH_{效應(yīng)細(xì)胞})。

②靶細(xì)胞自發(fā)釋放乳酸脫氫酶(LDH_{靶細(xì)胞})。

③靶細(xì)胞最大釋放乳酸脫氫酶(LDH_{靶細(xì)胞裂解})。

④實(shí)驗(yàn)組(LDH_{實(shí)驗(yàn)})。

細(xì)胞殺傷率(％)＝(LDH_{實(shí)驗(yàn)}-LDH_{效應(yīng)細(xì)胞}-LDH_{靶細(xì)胞})/LDH_{靶細(xì)胞裂解}×100％

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，與其他對(duì)照組相比，pHLIP-Fc偶聯(lián)物，包括pHLIP-Fc/a和pHLIP-Fc/b處理后的腫瘤細(xì)胞在微酸性條件下可引起明顯的ADCC作用，細(xì)胞殺傷率達(dá)70％～80％。

實(shí)施例4pHLIP-Fc偶聯(lián)物體內(nèi)抗腫瘤能力檢測

1、pHLIP-Fc偶聯(lián)物靜脈注射對(duì)小鼠黑色素瘤B16/F10的療效

實(shí)驗(yàn)用體重為18-22g的C57/BL-6雌性小鼠，隨機(jī)分5組，每組8只。背部皮下接種5×10⁶個(gè)B16-F10腫瘤細(xì)胞構(gòu)建小鼠黑色素瘤模型。當(dāng)腫瘤長到4–5mm時(shí)，尾靜脈注射藥物(0.1mg/kg Fc蛋白)，隔天給藥。每天用游標(biāo)卡尺記錄小鼠腫瘤的大小。腫瘤體積用以下公式計(jì)算：V＝L×W²/2，其中L代表腫瘤的長度，W代表腫瘤的寬度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6A。

2、pHLIP-Fc偶聯(lián)物靜脈注射對(duì)小鼠乳腺癌4T1的療效

實(shí)驗(yàn)用體重為18-22g的BALB/C雌性小鼠，隨機(jī)分5組，每組8只。小鼠右側(cè)胸壁乳墊下接種5×10⁶個(gè)4T1腫瘤細(xì)胞構(gòu)建小鼠原位乳腺癌模型。當(dāng)腫瘤長到4–5mm時(shí)，尾靜脈注射藥物(0.1mg/kg Fc蛋白)，隔天給藥。每天用游標(biāo)卡尺記錄小鼠腫瘤的大小。腫瘤體積用以下公式計(jì)算：V＝L×W²/2，其中L代表腫瘤的長度，W代表腫瘤的寬度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6B。

圖6A和B結(jié)果表明，與其他對(duì)照組相比，pHLIP-Fc偶聯(lián)物，包括pHLIP-Fc/a和pHLIP-Fc/b抑瘤效果顯著。

實(shí)施例5pHLIP-CD20抗體偶聯(lián)物引起抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用ADCC能力鑒定

利妥昔單抗購自美國艾博抗公司。pHLIP-CD20抗體偶聯(lián)物的制備方法同實(shí)施例1中穿膜肽-抗體Fc段偶聯(lián)物(pHLIP-Fc)的制備。人全血樣本來自血庫志愿者。通過密度梯度離心法收集人外周血單核細(xì)胞PBMC，PBMC中的自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)為ADCC效應(yīng)細(xì)胞。對(duì)全部PBMC進(jìn)行計(jì)數(shù)，一般情況下，NK細(xì)胞在PBMC中的含量為1～2％。靶細(xì)胞選擇人乳腺癌細(xì)胞系MBA-MD-231細(xì)胞。

(1)在微酸條件下(pH值6.5)藥物引起ADCC能力鑒定

對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行處理藥物處理，分為pHLIP-利妥昔單抗組和利妥昔單抗組，每種藥物均在pH6.5的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞1h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中所用緩沖液pH值均調(diào)整為6.5。胰蛋白酶消化靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按等比例混合接入96孔板，靶細(xì)胞為20000個(gè)/孔，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞在pH6.5的培養(yǎng)基中相互作用4h。

(2)在生理?xiàng)l件pH下(pH值7.4)藥物引起ADCC能力鑒定

對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行處理藥物處理，分為pHLIP-利妥昔單抗組和利妥昔單抗組，每種藥物均在pH7.4的培養(yǎng)基中孵育細(xì)胞1h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中所用緩沖液pH值均調(diào)整為7.4。胰蛋白酶消化靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按等比例混合接入96孔板，靶細(xì)胞為20000個(gè)/孔，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞在pH＝6.5的培養(yǎng)基中相互作用4h。

利用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效率。具體操作過程同實(shí)施例3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，與利妥昔單抗相比，pHLIP-利妥昔單抗偶聯(lián)物處理后的腫瘤細(xì)胞在微酸性條件下引起可引起明顯的ADCC作用，細(xì)胞殺傷率達(dá)65％左右。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 國家納米科學(xué)中心

<120> 多肽-抗體免疫偶聯(lián)物及其制備方法

<130> KHP161118723.3

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu

1 5 10 15

Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala

20 25 30

Asp Glu Gly Thr

35