相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2015年8月6日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/201,910的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用被明確并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于治療傳染病的方法，所述方法包括向需要其的患者施用包含血漿來(lái)源IgM的組合物。本發(fā)明還涉及一種用于中和在活躍的微生物感染期間分泌的細(xì)胞毒性外毒素的方法，所述方法包括向需要其的患者施用包含血漿來(lái)源IgM的組合物。

發(fā)明背景

微生物物種可變得對(duì)被感染的患者高度有害，如果個(gè)體不能清除感染，或者如果患者對(duì)治療不響應(yīng)的話。感染還可變成膿毒性的，從被感染的器官擴(kuò)散進(jìn)血流中。對(duì)于患者，這些膿毒性感染具有不良預(yù)后(poor outcome)，通常導(dǎo)致器官衰竭及死亡。

問(wèn)題是，大部分的抗生素靶向活的微生物自身以治療感染。IgM已被表征為防止由微生物內(nèi)毒素的全身性效應(yīng)造成的細(xì)菌性感染的毒性膿毒性方面。這些內(nèi)毒素是細(xì)胞壁(特別是革蘭氏陰性菌中的)的組分。這些治療方法無(wú)一靶向或已顯示出靶向微生物外毒素、超抗原或分泌性酶。

盡管血漿來(lái)源IgM可結(jié)合并防止內(nèi)毒素介導(dǎo)的對(duì)患者的毒性被良好地表征，但這并未解決從微生物主動(dòng)分泌的其他蛋白及毒素。內(nèi)毒素的毒性效應(yīng)通常是對(duì)由抗生素或患者的免疫系統(tǒng)引起的細(xì)菌死亡或溶菌的響應(yīng)。這些效應(yīng)與在微生物感染期間觀察到的由微生物主動(dòng)分泌的蛋白，諸如外毒素引起的毒性事件是不同的。對(duì)防止、抑制或減少除了內(nèi)毒素之外的從微生物分泌的蛋白和毒素的毒性效應(yīng)的組合物及方法仍存在需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明基于治療劑量的血漿來(lái)源IgM中和在活躍的微生物感染期間分泌的微生物蛋白，諸如分泌的細(xì)胞毒性外毒素的有害影響的出乎意料的中和效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明利用了血漿來(lái)源IgM對(duì)微生物蛋白的特異性。如以上解釋的，IgM結(jié)合為糖蛋白的微生物內(nèi)毒素并且該結(jié)合利用IgM對(duì)糖蛋白和碳水化合物的普遍結(jié)合是被熟知的。

在現(xiàn)有技術(shù)中，已描述了若干種單克隆抗體，但這些單克隆抗體僅單獨(dú)地針對(duì)單一抗原性靶。另一方面，天然的血漿來(lái)源IgM包含過(guò)多的能夠同時(shí)靶向許多不同的抗原的潛在抗原結(jié)合位點(diǎn)并因此不依賴于單一治療模式。

此外，本發(fā)明利用來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)血液分級(jí)過(guò)程，例如Grifols’Gamunex分級(jí)過(guò)程的廢物流的IgM來(lái)源。

因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療傳染病的方法，所述方法包括向需要其的患者施用包含血漿來(lái)源IgM的組合物。換言之，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了一種用于治療受試者中的傳染病的方法，所述方法包括向所述受試者施用組合物，所述組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來(lái)源IgM和任選地以藥物載體形式的一種或更多種賦形劑，其中所述組合物以有效中和所述患者中的微生物蛋白產(chǎn)物的量施用。

在第二方面，本發(fā)明涉及一種用于中和在活躍的微生物感染期間分泌的細(xì)胞毒性外毒素的方法，所述方法包括向需要其的患者施用包含血漿來(lái)源IgM的組合物。換言之，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了一種用于中和受試者中的微生物蛋白產(chǎn)物的方法，所述方法包括向所述受試者施用組合物，所述組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來(lái)源IgM及任選地以藥物載體形式的一種或更多種賦形劑，其中所述組合物以有效中和所述微生物蛋白產(chǎn)物的量施用。

所述細(xì)胞毒性外毒素可由若干種微生物分泌，諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、黃曲霉(Aspergillus flavus)及其組合。

優(yōu)選地，包含血漿來(lái)源IgM的組合物從標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)過(guò)程的廢物流獲得。血漿來(lái)源IgM具有至少70％(w/v)、更優(yōu)選地至少90％(w/v)且最優(yōu)選地至少95％(w/v)的純度。

還優(yōu)選地，待被施用的血漿來(lái)源IgM的劑量的范圍為每千克患者從75mg至1g、優(yōu)選地從75mg/kg至600mg/kg、更優(yōu)選地從75mg/kg至300mg/kg。該劑量可以以每日、每隔一日、3x/周或每周一次的方案施用。

任選地，血漿來(lái)源IgM的組合物還包含選自小分子抗生素、天然或合成的肽抗微生物劑或具有抗微生物特性的蛋白或者其組合的其他分子。

小分子抗生素的實(shí)例是萬(wàn)古霉素和美洛培南。具有抗微生物特性的蛋白的實(shí)例是乳鐵蛋白。

在本發(fā)明的方法中，血漿來(lái)源IgM的組合物可單獨(dú)地或與選自由包括抗炎劑的治療性分子和免疫調(diào)節(jié)劑組成的組的其他治療性分子組合使用。

附圖簡(jiǎn)述

下文將參考以下附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1示出了IgM對(duì)銅綠假單胞菌外毒素A的免疫反應(yīng)性。示出了代表性ELISA在450nm處的吸光度OD讀數(shù)。靶抗原銅綠假單胞菌外毒素A(P.A.ExA)被包被在ELISA板上。從Gammunex方法純化的匯集的血漿或IgM被用作IgM的來(lái)源。如指示的，該樣品在PBS中的多種稀釋物被測(cè)試。對(duì)照是尚未用抗原包被的孔(未包被的)。對(duì)于每個(gè)柱示出了標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖2A和2B示出了對(duì)艱難梭菌毒素B細(xì)胞毒性的中和。在推薦的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞(從ATCC獲得)。將細(xì)胞以每孔8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。在初始鋪板后24小時(shí)，細(xì)胞用如圖例中描述的多種IgM制品和/或艱難梭菌毒素B來(lái)處理。如通過(guò)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)測(cè)定測(cè)量的，細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目的數(shù)據(jù)被示為RLU。圖2A表明了兩個(gè)不同批次的IgG和IgM的混合物(對(duì)于實(shí)心黑色柱和陰影柱，級(jí)分濃度分別為45％和70％-80％IgM)對(duì)艱難梭菌毒素B(Tox B)的中和特異性，但對(duì)于非特異性對(duì)照人血清白蛋白(空心柱)并不是這樣；圖2B還單獨(dú)表明了增加的濃度的幾乎純的IgM(以微摩爾/L或μL計(jì)；實(shí)心黑色柱)對(duì)艱難梭菌毒素B(ToxB)的中和及對(duì)細(xì)胞生活力的救護(hù)。

圖3示出了艱難梭菌毒素誘導(dǎo)的Caco-2通透性的中和。使Caco-2細(xì)胞在Transwell多孔板插入裝置中通過(guò)通常方法分化。在分化21天之后，在處理開(kāi)始之前即刻測(cè)量跨上皮電阻(TEER)。僅具有高于200的TEER測(cè)量值的那些孔被包括在該實(shí)驗(yàn)中。在16小時(shí)處理之后，測(cè)量TEER以確定處理對(duì)TEER的效應(yīng)。將對(duì)照(未處理的細(xì)胞)設(shè)置成100％作為比較物。處理組被顯示為與對(duì)照組TEER相比的相對(duì)百分比。對(duì)于螢光黃通透性實(shí)驗(yàn)，將具有高于200的TEER并按圖中描述的處理的細(xì)胞與螢光黃(Life Technologies,Grand Island,NY USA)溶液一起在37℃孵育1小時(shí)。對(duì)Transwell插入裝置的頂端隔室和基部隔室取樣并評(píng)價(jià)螢光黃的存在。穿過(guò)Caco-2單層的螢光黃的百分比通過(guò)樣品的熒光測(cè)量值來(lái)確定。穿過(guò)Caco-2單層的螢光黃的百分比數(shù)據(jù)被表示為通透性相對(duì)于被設(shè)置為1的值的對(duì)照的倍數(shù)增加。闡明了對(duì)于艱難梭菌毒素B(Tox B)介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)染料螢光黃的通透性(A)或?qū)τ谏掀拥碾娮?TEER，參見(jiàn)同上)(B)的劑量響應(yīng)；在兩種情況中均包括非毒素B對(duì)照(圖的左側(cè))。在螢光黃通透性研究中，闡明了共施用IgM與毒素B(Tox B)的陽(yáng)性中和效應(yīng)。對(duì)于(C)中的代表性通透性，對(duì)照樣品(無(wú)蛋白，最左邊的柱)示出了單獨(dú)的螢光黃的通透性，而除了在IgM(級(jí)分C)的存在下對(duì)毒素B(Tox B)的中和效應(yīng)(從右邊數(shù)第二個(gè)柱)之外，其余的柱，在添加或不添加人血清白蛋白(HSA)的情況下均顯示出艱難梭菌毒素B(Tox B)引起的增加的通透性。對(duì)于(D)中的代表性跨上皮電阻測(cè)量值(TEER)，不含蛋白的對(duì)照樣品(實(shí)心柱，最左邊)表現(xiàn)出細(xì)胞層的正常電阻，所述正常電阻在沒(méi)有(實(shí)心柱，從左邊數(shù)第二個(gè))和伴有(HSA；實(shí)心柱，最右邊)人血清白蛋白的艱難梭菌毒素B(Tox B)的存在下均顯著降低。在毒素B(ToxB)的存在下，TEER被IgM(級(jí)分C)的恢復(fù)被示于該圖中(Tox B+級(jí)分C；從右邊數(shù)第二個(gè))。

圖4A和4B示出了對(duì)銅綠假單胞菌外毒素A細(xì)胞毒性的中和。在推薦的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞(從ATCC獲得)。將細(xì)胞以每孔4000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。在初始鋪板后24小時(shí)，將細(xì)胞用如圖例中描述的多種IgM制品和/或銅綠假單胞菌外毒素A來(lái)處理。如根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)通過(guò)Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)測(cè)定測(cè)量的細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目的數(shù)據(jù)被示為RLU。圖4A闡明了兩個(gè)不同批次的IgG和IgM的混合物(對(duì)于實(shí)心黑色柱和陰影柱，級(jí)分濃度分別為45％和70％-80％IgM)對(duì)假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素A(ExA)的中和的特異性，但對(duì)于非特異性對(duì)照人血清白蛋白(空心柱)并不是這樣；圖4B還單獨(dú)地闡明了增加的濃度的幾乎純的IgM(以微摩爾/L或μM計(jì)；實(shí)心黑色柱)對(duì)假單胞菌屬外毒素A(P.A.ExA)的中和及對(duì)細(xì)胞生活力的救護(hù)。

圖5示出了對(duì)破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)類毒素效應(yīng)的中和。將人外周血單核細(xì)胞在具有10％熱滅活的人血清的RPMI中培養(yǎng)。對(duì)于增殖測(cè)定，使用培養(yǎng)基將3x10⁵個(gè)細(xì)胞接種在96孔板的每個(gè)孔中。如圖例中描述的處理細(xì)胞。相對(duì)細(xì)胞增殖通過(guò)Cell Titer Glow(Promega Corp.Madison,WI,USA)來(lái)確定并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將細(xì)胞增殖相對(duì)于值為1的實(shí)驗(yàn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化。

圖6示出了IgM對(duì)細(xì)菌銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯桿菌的免疫反應(yīng)性。示出了代表性全細(xì)胞(whole cell)ELISA在450nm處的吸光度OD讀數(shù)。靶抗原是經(jīng)甲醛處理的銅綠假單胞菌(白色柱)、肺炎鏈球菌(斜紋柱)及肺炎克雷伯桿菌(黑色柱)，完整的細(xì)菌細(xì)胞被包被在ELISA板上。對(duì)照：僅用第二抗體孵育的細(xì)菌包被的孔或未用抗原包被的孔。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的實(shí)施方案提供了用于治療受試者中的傳染病的方法，所述方法包括向所述受試者施用組合物，所述組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來(lái)源IgM及任選地以藥物載體形式的一種或更多種賦形劑，其中組合物以有效中和所述患者中的微生物蛋白產(chǎn)物的量施用。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于中和受試者中的微生物蛋白產(chǎn)物的方法，所述方法包括向所述受試者施用組合物，所述組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來(lái)源IgM及任選地以藥物載體形式的一種或更多種賦形劑，其中所述組合物以有效中和所述微生物蛋白產(chǎn)物的量施用。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了組合物，所述組合物包含以下、主要由以下組成或由以下組成：血漿來(lái)源IgM及任選地以藥物載體形式的一種或更多種賦形劑。根據(jù)特定的實(shí)施方案，一種或更多種賦形劑和/或藥物載體是合成的，即，非天然存在的。

如本文使用的，“中和”微生物蛋白產(chǎn)物指減少、防止或消除微生物蛋白產(chǎn)物對(duì)受試者的毒性效應(yīng)，例如，減少、防止或消除外毒素介導(dǎo)的對(duì)患者的毒性。

根據(jù)特定的實(shí)施方案，微生物蛋白產(chǎn)物選自由外毒素、超抗原和分泌性酶組成的組。優(yōu)選地，微生物蛋白產(chǎn)物不包括微生物內(nèi)毒素。

根據(jù)特定的實(shí)施方案，受試者在施用組合物之前已被診斷為患有細(xì)菌性感染。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指與本發(fā)明的血漿來(lái)源IgM一起被施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類載體可以是無(wú)菌液體，諸如水和油，所述油包括石油、動(dòng)物、植物和合成來(lái)源的那些油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成的溶劑。鹽水溶液以及水性右旋糖(dextrose)和丙三醇溶液也可被用作液體載體，尤其是用于可注射溶液的液體載體。根據(jù)特定的實(shí)施方案，藥學(xué)上可接受的載體是合成的(即，載體不是天然存在的)。

適合的賦形劑的非限制性實(shí)例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、二氧化硅凝膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、丙三醇、丙二醇、水、乙醇等。賦形劑還可包括：潤(rùn)濕劑或乳化劑；或pH緩沖劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；抗細(xì)菌劑，諸如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；以及用于調(diào)節(jié)張力(tonicity)的試劑，諸如氯化鈉或葡萄糖。根據(jù)特定的實(shí)施方案，一種或更多種賦形劑是合成的(即，賦形劑不是天然存在的)。

細(xì)胞毒性外毒素可由若干種微生物分泌，諸如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、艱難梭菌、肉毒梭菌、黃曲霉及其組合。

優(yōu)選地，包含血漿來(lái)源IgM的組合物從標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)過(guò)程的廢物流獲得。血漿來(lái)源IgM具有至少70％(w/v)、更優(yōu)選地至少90％(w/v)且最優(yōu)選地至少95％(w/v)的純度。

還優(yōu)選地，待被施用的血漿來(lái)源IgM的劑量的范圍為每千克患者從75mg至1g、優(yōu)選地從75mg/kg至600mg/kg、更優(yōu)選地從75mg/kg至300mg/kg。該劑量可以以每日、每隔一日、3x/周或每周一次的方案施用。

任選地，血漿來(lái)源IgM的組合物還包含其他分子，諸如小分子抗生素、天然或合成的肽抗微生物劑或具有抗微生物特性的蛋白或者其組合。

小分子抗生素的實(shí)例是萬(wàn)古霉素和美洛培南。具有抗微生物特性的蛋白的實(shí)例是乳鐵蛋白。

在本發(fā)明的方法中，血漿來(lái)源IgM的組合物可單獨(dú)地或與選自由包括抗炎劑的治療性分子和免疫調(diào)節(jié)劑組成的組的其他治療性分子組合使用。

本文描述的實(shí)施方案被意圖是對(duì)本發(fā)明的示例，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到可對(duì)本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案和實(shí)例做出修改而不偏離本公開(kāi)內(nèi)容的范圍。

以上使用術(shù)語(yǔ)“包含(comprising)”及其變化形式描述了本發(fā)明的實(shí)施方案。但是，發(fā)明人的意圖是，在本文描述的任何實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“包含”可被“由......組成(consisting of)”及“主要由......組成(consisting essentially of)”代替，而不偏離本發(fā)明的范圍。除非另外指明，否則本文提供的所有值包括多達(dá)給定的起始點(diǎn)和結(jié)束點(diǎn)并且包括給定的起始點(diǎn)和結(jié)束點(diǎn)。

以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的實(shí)施方案，并且將被理解為是說(shuō)明性的且不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1.IgM與外毒素、分泌性細(xì)菌酶和超抗原的免疫反應(yīng)性.

本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了若干種ELISA以評(píng)價(jià)對(duì)由細(xì)菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)及艱難梭菌(C.difficile)產(chǎn)生的多種靶抗原的免疫反應(yīng)性(參見(jiàn)表1)。出乎意料地，所有蛋白性外毒素和酶被血漿來(lái)源IgM識(shí)別。觀察到被評(píng)價(jià)的來(lái)自這些病原體的所有基于蛋白的抗原的陽(yáng)性反應(yīng)性。顯示純化的制品和血漿中的IgM的反應(yīng)性的示例性ELISA示于圖1中。

表1.通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)的抗原性靶的歸納。符號(hào)“+”指示陽(yáng)性反應(yīng)性。由于IgM對(duì)革蘭氏陰性內(nèi)毒素具有反應(yīng)性被良好地表征，大腸桿菌LPS被用作陽(yáng)性對(duì)照。

實(shí)施例2.艱難梭菌毒素B的細(xì)胞毒性效應(yīng)的中和

本發(fā)明的初步目的是提供對(duì)IgM中和外毒素的概念性驗(yàn)證(proof-of-concept)。由于艱難梭菌是腸道感染，選擇利用生理上相關(guān)的細(xì)胞系用于研究。Caco-2細(xì)胞是常規(guī)用于腸道通透性研究的上皮結(jié)腸直腸細(xì)胞系。培養(yǎng)待在細(xì)胞毒性測(cè)定中使用的Caco-2。優(yōu)化孵育時(shí)間和艱難梭菌毒素B的濃度(數(shù)據(jù)未示出)。孵育毒素B24小時(shí)未顯示出任何毒性，并且隨著孵育時(shí)間增加，細(xì)胞毒性也增加。另外，我們確定了25ng/mL在48小時(shí)給出最高的毒性測(cè)定窗，并且在該點(diǎn)顯示出平穩(wěn)期。將最后的測(cè)定條件設(shè)置在15ng/mL毒素B，與正在增殖的細(xì)胞一起孵育48小時(shí)。使用這些條件，評(píng)價(jià)并比較毒素與對(duì)IgM富集的純化級(jí)分以及純化的IgM的中和(圖2)。級(jí)分A包含40％-50％的IgM，且級(jí)分B包含70％-80％的IgM。HSA對(duì)毒素B毒性沒(méi)有影響，而包含IgM的2種不同的級(jí)分中和該毒素(圖2A)。還顯示出純化的IgM(≥95％IgM)在中和艱難梭菌毒素B中是有效的(圖2B)。在級(jí)分A、級(jí)分B和純化的IgM中明顯存在針對(duì)艱難梭菌的中和抗體。

實(shí)施例3.艱難梭菌毒素B誘導(dǎo)的通透性的中和.

如在前面的實(shí)施例中提及的，Caco-2細(xì)胞是被良好表征的腸道上皮運(yùn)輸和通透性的模型。艱難梭菌毒素的已知后果之一是腸道通透性。為了測(cè)試包含IgM的純化級(jí)分是否能夠中和該毒素效應(yīng)，培養(yǎng)Caco-2用作腸道通透性模型。在該模型中，使Caco-2細(xì)胞在具有可滲透膜的孔插入裝置上以單層分化21天。在分化后，可通過(guò)測(cè)量熒光小分子(在該情況中螢光黃)穿過(guò)細(xì)胞單層的能力以及通過(guò)使用TEER法(跨上皮電阻)測(cè)量由單層給予的電阻來(lái)監(jiān)測(cè)通透性。當(dāng)細(xì)胞具有增加的通透性時(shí)，在膜的基底外側(cè)上發(fā)現(xiàn)螢光黃的量也增加。在電阻方面，具有較高通透性的細(xì)胞具有較低的電阻。為了顯示這些差異可被測(cè)量，進(jìn)行艱難梭菌毒素B的劑量響應(yīng)(圖3A和3B)。螢光黃橫跨單層的能力以及單層的電阻兩者響應(yīng)于增加的劑量的毒素B均具有適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)變化。測(cè)試了級(jí)分C(富集至90％-95％IgM)中和毒素B介導(dǎo)的通透性的能力。將級(jí)分C和毒素B預(yù)孵育1小時(shí)以允許IgM與毒素結(jié)合。在預(yù)孵育后，將細(xì)胞用級(jí)分C和毒素B的混合物處理16小時(shí)。在該16小時(shí)的時(shí)間段之后，對(duì)細(xì)胞被螢光黃擴(kuò)散通過(guò)單層的通透性(圖3C)以及單層TEER(圖3D)進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于兩種測(cè)定方法，級(jí)分C提供針對(duì)毒素B的保護(hù)，而HSA對(duì)毒素B不具有效應(yīng)。螢光黃具有完全的逆轉(zhuǎn)，而電阻僅顯示出部分救護(hù)。這也許是由于TEER比螢光黃測(cè)定法更靈敏。實(shí)施例4.銅綠假單胞菌外毒素A的細(xì)胞毒性效應(yīng)的中和

鑒于來(lái)自具有艱難梭菌毒素B的中和的Caco-2細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)了在Caco-2中的類似測(cè)定以測(cè)試銅綠假單胞菌外毒素A。當(dāng)在該模型中評(píng)價(jià)級(jí)分A或級(jí)分B時(shí)，觀察到對(duì)外毒素A的中和(圖4A)。有趣的是，與艱難梭菌毒素B相比，發(fā)現(xiàn)了外毒素A對(duì)于這些級(jí)分的有效性的相反結(jié)果；對(duì)于外毒素A的中和，級(jí)分A比級(jí)分B更有效。另外，使用純化的IgM，我們也觀察到對(duì)銅綠假單胞菌外毒素A細(xì)胞毒性的中和(圖4B)。

實(shí)施例5.破傷風(fēng)梭菌類毒素的中和

破傷風(fēng)毒素是阻斷GABA釋放的高度有效的神經(jīng)毒素。美國(guó)的大部分個(gè)體接種了針對(duì)破傷風(fēng)的疫苗。作為破傷風(fēng)毒素中和的模型，利用破傷風(fēng)毒素的無(wú)毒性類毒素形式來(lái)評(píng)價(jià)估純化的IgM是否能夠中和該蛋白。顯示了IgM與破傷風(fēng)類毒素的抗原性結(jié)合(參見(jiàn)表1)。由于該類毒素未顯示出對(duì)GABA釋放的阻斷，IgM的中和效應(yīng)通過(guò)外周血單核細(xì)胞(PBMC)的增殖來(lái)評(píng)價(jià)。已知TCR抗原的刺激能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖，且破傷風(fēng)是被描述的對(duì)于該增殖的刺激物。因此，測(cè)試了在IgM的存在和不存在下破傷風(fēng)類毒素誘導(dǎo)的PBMC增殖(圖5)。觀察到在單獨(dú)的破傷風(fēng)類毒素的存在下細(xì)胞數(shù)目的3倍增加，而與IgM的共處理在2.5μM下幾乎完全阻斷該效應(yīng)，并且在5μM下顯示出完全抑制。

實(shí)施例6.IgM對(duì)不同的微生物具有抗原性識(shí)別

為了更好地理解多種靶的多樣性，進(jìn)行了多種ELISA。使用多種商購(gòu)可得的ELISA試劑盒檢測(cè)與細(xì)菌性和病毒性病原體兩者的反應(yīng)性。另外，利用基于ELISA的測(cè)定，在所述測(cè)定中將整個(gè)的熱殺死或甲醛處理的完整微生物包被在ELISA板上。該評(píng)價(jià)允許評(píng)價(jià)針對(duì)由微生物產(chǎn)生的“全部(global)”抗原靶抗原的反應(yīng)性。對(duì)于所有ELISA和全細(xì)胞ELISA的數(shù)據(jù)被歸納于表2中，并且從這些數(shù)據(jù)，可得出結(jié)論，IgM具有普遍性的抗原識(shí)別。使用細(xì)菌銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯桿菌的全細(xì)胞ELISA中的IgM反應(yīng)性的示例性ELISA數(shù)據(jù)集被示于圖6中。

表2–已通過(guò)ELISA和全細(xì)胞ELISA評(píng)價(jià)的抗原性靶的歸納。符號(hào)“+”指示基于試劑盒標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的陽(yáng)性IgM反應(yīng)性，且“+弱”指示基于試劑盒標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的弱的IgM反應(yīng)性。