本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于增強抗原免疫應(yīng)答的佐劑。
背景技術(shù)：
細菌、病毒及寄生蟲感染廣泛分布于人和動物，由這些感染劑引起的疾病通常對抗微生物藥學(xué)療法具有抗性，從而沒有有效的治療方法。因此，本領(lǐng)域更常使用疫苗學(xué)方法以控制傳染，具體是通過用活的病原體、經(jīng)滅活的病原體或其產(chǎn)物，或經(jīng)基因工程手段將病原體蛋白質(zhì)亞基制備成疫苗，進行疫苗接種來誘導(dǎo)特異性免疫。然而，當(dāng)單獨給予某些抗原時，不能對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生足夠的刺激作用。因此，必須加入能夠使機體免疫應(yīng)答增加的免疫佐劑來獲得足夠量的保護性抗體。
免疫佐劑是疫苗必不可少的組成部分，不僅能影響機體對疫苗免疫應(yīng)答的強度，而且能針對特定病原體誘導(dǎo)最有效的免疫應(yīng)答類型(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,et al.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416)。目前，研究的免疫佐劑類型很多，如鋁膠、油佐劑、弗氏佐劑、微生物及其代謝產(chǎn)物、核酸及其類似物、細胞因子、脂質(zhì)體等(Dey AK,Srivastava IK.Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses induced by immunogens.Expert review of vaccines,2011,10:227-251)，但由于存在不同程度的毒副作用或安全隱患等一些不可避免的缺陷而難以實際應(yīng)用(Mbow ML,De Gregorio E,Valiante NM,Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Current opinion in immunology,2010,22(3):411-416；Batista-Duharte A,Lindblad EB,Oviedo-Orta E.Progress in understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicology letters,2011,203(2):97-105)，導(dǎo)致這些佐劑遠遠不能滿足新型疫苗發(fā)展的需求。特別地，大量的臨床免疫試驗認(rèn)為鋁膠佐劑存在一些問題：(1)對Th2介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)具有很強的激發(fā)作用，而對Th1介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)的作用較弱，只適用于以抗體為主要保護性免疫的疫苗(Exley C,Siesjo P,Eriksson H.The immunobiology of aluminum adjuvants:how do they really work？Trends in immunology,2010,31:103-109)；(2)可促進IgE抗體產(chǎn)生，容易誘導(dǎo)機體產(chǎn)生過敏反應(yīng)；(3)有局部反應(yīng)，會形成肉芽腫，極個別可發(fā)生局部無菌性膿腫；(4)因其理化性質(zhì)，含鋁膠疫苗怕凍，凍后鋁膠疫苗容易變性；(5)對人、畜神經(jīng)系統(tǒng)可能有影響(見中國專利CN101402666A)。因而，尋找安全、有效、新型的免疫佐劑是當(dāng)前疫苗研究領(lǐng)域的一個熱點(Schijins VEJC,Lavelle EC.Teends in vaccine adjuvants.Expert review of vaccines,2011,10(4):539-550)。并且，免疫佐劑研究現(xiàn)已被列為疫苗研究的優(yōu)先領(lǐng)域(Harandi AM,Medaglini D,Shattock RJ.Vaccine adjuvants:A priority for vaccine research.Vaccine,2010,28(12):2363-2366；Harand AM,Brewe J,Schijn V.Conference scene:recent advancements in immunopotentiators for modern vaccines.Immunotherapy,2011,3(11):1297-1301)。
另外，目前商品化的菌苗(如豬肺炎支原體菌苗、副豬嗜血桿菌菌苗)是通過在含血清的培養(yǎng)基上生長所得的生物體制備而成，從而免疫物質(zhì)中存在的血清組分(如免疫復(fù)合物或非免疫原性特異性蛋白)會誘導(dǎo)副反應(yīng)發(fā)生(見中國專利CN104334186A)。而且，臨床應(yīng)用時發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的商品化疫苗免疫豬只后會出現(xiàn)體溫升高的現(xiàn)象，其他現(xiàn)有技術(shù)所涉及的疫苗也有類似報道如中國專利CN103194413A、CN104312964A。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種疫苗用佐劑及含該佐劑的疫苗組合物和其應(yīng)用。
本發(fā)明的第一方面在于提供一種疫苗用佐劑，所述佐劑包括鋁膠、殼聚糖。
本發(fā)明還涉及一種疫苗用佐劑，所述佐劑包括鋁膠、殼聚糖和磷脂。
本發(fā)明所述疫苗用佐劑具有成本低廉、使用方便、免疫活性強等優(yōu)點，含該佐劑的疫苗組合物不僅能使動物機體產(chǎn)生體液免疫、細胞免疫，還不會造成體溫升高、副反應(yīng)發(fā)生。
本發(fā)明的另一方面在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包含本發(fā)明所述疫苗用佐劑和免疫有效量的抗原。
含本發(fā)明佐劑的疫苗組合物在抗原含量較低、單次免疫時也能使動物獲得較好的免疫應(yīng)答水平。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明制備的含豬肺炎支原體抗原和副豬嗜血桿菌抗原以及疫苗用佐劑的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬肺炎支原體和副豬嗜血桿菌感染相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的疫苗用佐劑與抗原共同免疫動物后的免疫應(yīng)答水平與現(xiàn)有商品化疫苗的免疫應(yīng)答水平相當(dāng)甚至較高，抗體持續(xù)時間也較長，無體溫升高、無副反應(yīng)發(fā)生，效果穩(wěn)定；且在抗原含量較低時也能使動物獲得較好的免疫效果，免疫次數(shù)少也可使豬的應(yīng)激反應(yīng)減少甚至消失。
具體實施方式
以下，對本發(fā)明的實施方式進行說明。
本發(fā)明的第一方面在于提供一種疫苗用佐劑，所述佐劑包括鋁膠、殼聚糖。
術(shù)語“佐劑”是指當(dāng)與抗原連同投予時，使受試者對這一抗 原的免疫反應(yīng)增強的化合物。
術(shù)語“鋁膠”，又稱鋁鹽或鋁佐劑，是本領(lǐng)域眾所周知的，并且如在Harlow E.與D.Lane(Antibodies:a laboratory manual gold spring harbor laboratory.1988)和Nicklas W.(Aluminum salts,research in immunology.1992,143:489-493)中描述的，可廣泛應(yīng)用于疫苗制備。鋁膠包括但不限于氫氧化鋁(Aluminium hydroxide或Amphogel，又稱水化氧化鋁、鋁的水合物、三羥基鋁、無定形氧化鋁，包括一水合氧化鋁、三水合氧化鋁ATH)、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬、鉀明礬或硅酸鋁的一種或多種，優(yōu)選為氫氧化鋁或磷酸鋁。所述鋁膠還可以包括以下任一產(chǎn)品如HPA(General Chemical,LLC)、M9400SP(J.M.Huber Corporation)、(Merck)、(Brenntag Biosector)、Aluminum hydroxide(Sigma-aldrich、Watson、Bisely&Company Pty Ltd.、Noah thchnologies corporation或CellMark USA,LLC)、氫氧化鋁凝膠(內(nèi)蒙古新宏生物科技有限公司)、20％氫氧化鋁膠生理鹽水(中牧實業(yè)股份有限公司)。
術(shù)語“殼聚糖”(Chitosan)包括天然殼聚糖、改性殼聚糖、殼聚糖鹽類、殼聚糖衍生物中的至少一種，可以從多種生產(chǎn)商獲得，所述生產(chǎn)商包括KitoZyme SA、Fluka chemine AG、the NovaMatrix unit of FMC Biopolymer AS、Heppe Medical和Sigma-Aldrich Co.。殼聚糖是由葡萄糖胺單體組成的陽離子聚合物，可以有多種數(shù)均分子量，如約400-2000kDa、約10-500kDa或約10-100kDa，或如低于約50kDa數(shù)均分子量的超低分子量材料、約50-200kDa數(shù)均分子量的低分子量材料、約200-500kDa數(shù)均分子量的中分子量材料、大于約500kDa數(shù)均分子量的高分子量材料，也可通過水解作用經(jīng)過殼多糖(聚-N-乙?；?D-葡萄糖胺)的脫乙酰作用而消除N-乙?；鶊F來合成。其中，所述天然殼聚糖如從蝦殼、蟹殼等海產(chǎn)品廢棄物中提取的天然多糖，是由葡糖胺和N-乙?；咸前?N-acetyl-D-glucosamine)共聚物組成的多糖， 是甲殼素(Chitin)脫乙?；漠a(chǎn)物；所述改性殼聚糖為經(jīng)化學(xué)改性如?；?、酯化、烷基化，或經(jīng)復(fù)合改性如接枝共聚、交聯(lián)、螯合、共混所得的殼聚糖；所述殼聚糖鹽類包括但不限于檸檬酸鹽、硝酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、氯化物和谷氨酸鹽中的一種或多種；所述其衍生物為一個或多個羥基或氨基已經(jīng)被改性用于改變衍生物的溶解度或黏膜粘連特性，包括硫酸醇化殼聚糖衍生物和非硫酸醇化殼聚糖衍生物，如羧甲基、乙酰化、烷基化或磺化殼聚糖(如O-烷基醚、O-?；?、陽離子化三甲基殼聚糖和用聚乙二醇改性的殼聚糖)，可從多種來源獲得，如硫酸醇化殼聚糖可從ThioMatrix Forschungs Beratungs公司和Mucobiomer Biotechnologische forschungs-und entwicklungs公司獲得，或通過殼聚糖與合適的硫醇化試劑反應(yīng)制備如申請?zhí)朠CT WO03/020771A1或Roldo等人(Mucoadhesive thiolated chitosans as platforms for oral controlled drug delivery:synthesis and in vitro evaluation.European Journal of Pharmaceutic and Biopharmaceutics,2004,57:115-121)、Krauland等人(Viscoelastic properties of a new in situ gelling thiolated chitosan conjugate.Drug Development And Industrial Pharmacy.2005,31:885-893)、Bernkop-schnürch等人(Bernkop-Schnürch,Thiomers:A new generation of mucoadhesive polymers.Advanced Drug Delivery Reviews.2005,57:1569-1582；Thiomers:Preparation and in vitro evaluation of a mucoadhesive nanoparticulate drug delivery system.International journal of Pharmaceutics.2006,317:76-81)的文獻中所述方法制備。
作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的所述疫苗用佐劑包括鋁膠、殼聚糖和磷脂。
術(shù)語“磷脂”(phospholipids/phosphatides)又稱磷脂類、磷脂質(zhì)，是含有磷酸的脂類，包括但不限于卵磷脂、腦磷脂即磷脂酰乙醇胺磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲胺酸、磷脂酸、鞘磷脂、心磷脂中的一種或多種，可分離自天然來源或常規(guī)合成。
術(shù)語“卵磷脂”(Lecithin)又稱磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)，是甘油和膽堿與脂肪酸和磷酸的混合酯類及其衍生物，包括但不限于天然卵磷脂、合成卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、合成的二棕櫚酰卵磷脂、部分或完全氫化的卵磷脂及其混合物中的一種或多種，可選自植物來源如大豆、玉米、花生、向日葵籽、油菜籽，動物來源如蛋黃和動物腦組織，或各種生產(chǎn)商如American lecithin Company供應(yīng)的Phospholipon90G。
作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的所述疫苗用佐劑中，鋁膠包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬、鉀明礬、硅酸鋁中的至少一種。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗用佐劑中，鋁膠包括氫氧化鋁、磷酸鋁中的至少一種。
作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗用佐劑中，鋁膠包括包括HPA、M9400SP、Aluminum hydroxide、氫氧化鋁凝膠、20％氫氧化鋁膠生理鹽水中的至少一種。
作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的所述疫苗用佐劑中，殼聚糖包括天然殼聚糖、改性殼聚糖、殼聚糖其鹽類或殼聚糖其衍生物中的至少一種。
作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的所述疫苗用佐劑中，磷脂包括卵磷脂、腦磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲胺酸、磷脂酸、鞘磷脂、心肌磷脂中的至少一種。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗用佐劑中，所述磷脂為卵磷脂。
作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗用佐劑中，卵磷脂包括天然卵磷脂、合成卵磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、合成的二棕櫚酰卵磷脂、部分或完全氫化的卵磷脂中的至少一種。
本發(fā)明的另一方面在于提供一種疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物包含本發(fā)明所述的佐劑和免疫有效量的抗原。
術(shù)語“免疫有效量”又稱免疫保護量或產(chǎn)生免疫應(yīng)答的有效量，為可在接受者體內(nèi)有效誘導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的量。所述免疫應(yīng)答可能足以用于診斷目的或其它試驗，或可能適合用于預(yù)防疾病的征兆或癥狀，包括由病原體引起的感染所造成的不利的健康結(jié)果或其并發(fā)癥。體液免疫力或由細胞介導(dǎo)的免疫力或此二者均可被誘導(dǎo)。動物對免疫原性組合物的免疫應(yīng)答可通過例如測量抗體效價、淋巴細胞增殖分析而間接評估，或在以野生型毒株攻擊后通過監(jiān)測征兆或癥狀來直接評估，而該由疫苗提供的保護性免疫力可通過測量例如受試者的臨床征兆如死亡率、發(fā)病率的減少、溫度數(shù)值、受試者總體生理狀況及總體健康和表現(xiàn)來評估。所述免疫應(yīng)答可包括但不限于誘導(dǎo)細胞性和/或體液免疫力。
術(shù)語“抗原”又稱免疫原，是指任何刺激免疫應(yīng)答的物質(zhì)，是一種能夠被抗體結(jié)合的分子，還能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生B-和/或T-細胞的體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫應(yīng)答，還具有一個或多個表位(B-和T-表位)。所述抗原包括殺死的、滅活的細菌，或其培養(yǎng)細胞制劑、上清液。其中，所述殺死的、滅活的細菌是指含有不再能夠復(fù)制或生長的感染性生物體或病原體，病原體可通過各種方法包括凍融、化學(xué)處理(如用硫柳汞或福爾馬林處理)、聲處理、照射、熱或任何其它足以阻止生物體復(fù)制或生長的常用方法來實現(xiàn)滅活而維持其免疫原性。
作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物中所述抗原為滅活的抗原。
作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物中，鋁膠含量為5％-30％V/V，殼聚糖濃度為0.1-10mg/ml。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物中，鋁膠含量為5％-30％V/V，殼聚糖濃度為0.1-10mg/ml，卵磷脂濃度為0.2-8mg/ml。
作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物中，鋁膠含量為8％-20％V/V，殼聚糖濃度為1-5mg/ml。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物中，鋁膠為8％-20％V/V，殼聚糖為1-5mg/ml，卵磷脂濃度為0.5-5mg/ml。
作為本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物中，所述抗原包括豬肺炎支原體抗原、副豬嗜血桿菌抗原、多殺巴斯德桿菌抗原、豬鏈球菌抗原、豬葡萄球菌抗原、支氣管炎博德特菌抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、支氣管敗血波氏桿菌抗原和產(chǎn)毒素多殺巴氏桿菌抗原、豬霍亂沙門氏菌抗原、腸炎沙門氏菌抗原、豬紅斑丹毒絲菌抗原、豬鼻支原體抗原、豬滑液支原體抗原、致病性鉤端螺旋體抗原中的一種或多種。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述抗原包括豬肺炎支原體抗原、副豬嗜血桿菌抗原、多殺巴斯德菌抗原、豬鏈球菌抗原、豬葡萄球菌抗原、支氣管炎博德特菌抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬霍亂沙門氏菌抗原、腸炎沙門氏菌抗原、豬紅斑丹毒絲菌抗原、豬鼻支原體抗原、豬滑液支原體抗原、豬鉤端螺旋體細菌抗原中的一種或多種。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物中，所述抗原為豬肺炎支原體抗原和/或副豬嗜血桿菌抗原。術(shù)語“豬肺炎支原體抗原”是指含有至少一種豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)抗原形式的任何組合物，所述豬肺炎支原體抗原可誘導(dǎo)、刺激或增強抵抗豬肺炎支原體感染的免疫應(yīng)答，所述抗原形式包括但不限于滅活的或亞單位的抗原，或其培養(yǎng)上清液。所述豬肺炎支原體抗原包括HN0613株(保藏號為CCTCC No.M2012230，參見中國專利CN103083655A)、J株(購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC，ATCC編號為25934)、NJ株(保藏號為CCTCC No.M2012286，參見中國專利CN103585622A)、HDZK-Mhp57株(保藏號為CGMCC No.8096， 參見中國專利CN103484414A)、AN306株(保藏號為CCTCC No.M2012431，參見中國專利CN103740625A)、DJ-166株(保藏號為CGMCC No.4545，參見中國專利CN103184171A)和NM04/41259株(保藏號為NM04/41259株，參見中國專利CN102458462A)的一種或多種，還可以包含以下組合物的任一種抗原如哈藥集團公司的瑞倍適Respisure和瑞倍適-旺RespisureOne、英特威公司的安百克M+PAC、勃林格殷格翰公司的M.hyo、美國普泰克公司的MycoGard、美國輝瑞公司的RespiFend MH、碩騰(上海)動物保健品有限公司的瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、梅里亞動物保健公司的豬克喘SprintVac、海博萊公司的喜宜豐Mypravac Suis。
術(shù)語“副豬嗜血桿菌抗原”是指含有至少一種副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)抗原形式的任何組合物，所述副豬嗜血桿菌抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強抵抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應(yīng)答，所述抗原形式包括但不限于滅活的或亞單位的抗原，或其培養(yǎng)上清液。所述副豬嗜血桿菌抗原包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的1-15個血清型或無法測定血清型的副豬嗜血桿菌，包含至少兩個血清型的混合抗原如4型(如JS株，保藏號為CCTCC No.M2011172，參見中國專利CN103083655A)和5型(如ZJ株，保藏號為CCTCC No.M2011173，參見中國專利CN103083655A)的混合抗原的一種或多種，還可以包含以下組合物的任一種抗原如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1、海博萊公司Hipra的Hiprasuis-Glasser、中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗和武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司的科富寧(4型MD0322株+5型SHO165株)。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物中，所述豬肺炎支原體抗原包括HN0613株、J株、NJ株、HDZK-Mhp57株、AN306株、DJ-166株、NM04/41259株抗原， 或瑞倍適Respisure和瑞倍適-旺RespisureOne、安百克M+PAC、M.hyo、MycoGard、RespiFend MH、瑞富特-旺Suvaxyn MH-one、豬克喘SprintVac、喜宜豐Mypravac Suis；以及
所述副豬嗜血桿菌抗原包括4型JS株和5型ZJ株的混合抗原，或Ingelvac HP-1、Hiprasuis-Glasser、科富寧、中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗中的一種或多種。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物包括1×108CCU/頭份的滅活的豬肺炎支原體HN0613株抗原、1×109CFU/頭份的滅活的副豬嗜血桿菌4型JS株抗原和1×109CFU/頭份的滅活的副豬嗜血桿菌5型ZJ株抗原；以及10％V/V的鋁膠、4mg/ml殼聚糖和2mg/ml卵磷脂。
術(shù)語“豬”是指任何屬于豬科(Suidae)成員的動物，包括小豬、大母豬、小母豬、公豬等豬科的成員。
本發(fā)明第三方面在于提供所述疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療豬肺炎支原體和副豬嗜血桿菌感染相關(guān)疾病的的藥物中的應(yīng)用。
術(shù)語“預(yù)防和/或治療”在涉及細菌感染時是指抑制細菌的復(fù)制、抑制細菌的傳播或防止細菌在其宿主體內(nèi)定居，以及減輕細菌感染所之疾病或病癥的癥狀。若細菌荷載量減少、感染癥狀減輕和/或攝食量和/或生長增加，那么就可以認(rèn)為所述治療達到了治療效果。
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
本發(fā)明實施例中豬肺炎支原體抗原以滅活的豬肺炎支原體 HN0613株，副豬嗜血桿菌抗原以滅活的4型副豬嗜血桿菌JS株和5型副豬嗜血桿菌ZJ株為例進行闡述，但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明實施例中肺病變指數(shù)采用28分法進行評判。所述28分法是根據(jù)豬支原體肺炎的典型肺部眼觀病變，對發(fā)病程度進行量化判定，包括肺尖葉、心葉、膈葉、中間葉出現(xiàn)的實質(zhì)樣病變，如“肉樣變”、“胰樣變”。肺炎病變評分標(biāo)準(zhǔn)為：2個尖葉、2個心葉、2個膈葉、1個中間葉共計7個肺葉，每個肺葉滿分為4分，共計28分。根據(jù)發(fā)生實質(zhì)病變的肺葉面積所占該葉的比例，分別對每個肺葉進行打分。無肺炎病變記為0分；病變面積比例為1％-25％，記為1分；病變面積比例26％-50％，記為2分；病變面積比例為51％-75％，記為3分；病變面積比例為76％-100％，記為4分。如肺葉正反兩面均有病變，以病變面積大的一面進行記分。各個肺葉打分總和即為該發(fā)病株的肺炎病變得分。分別對免疫組豬和對照組豬進行記分后，按照以下公式計算免疫組豬的肺葉病變減少率：
本發(fā)明實施例統(tǒng)計分析方法為：統(tǒng)計7個肺葉的肺病變指數(shù)，確定病變程度。用SPSS計算機軟件進行ANOVA分析，比較各組間差異，確定病變差異的有效性。
本發(fā)明中所用的pH7.4PBS溶液配方為：800ml蒸餾水中加入NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.42g、KH2PO4 0.27g，調(diào)pH值至7.4，定容至1000ml，經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘后使用，但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
本發(fā)明中所用到的化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團，但該實施方式無論在任何情況下均不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡 述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1抗原的制備
1.1豬肺炎支原體抗原的制備
按照中國專利CN103083655A進行制備豬肺炎支原體HN0613株菌液及測定菌液的含量，結(jié)果：豬肺炎支原體HN0613株的含量為1×109CCU/ml；并對菌液進行滅活及檢驗，結(jié)果：培養(yǎng)基著色未發(fā)生變化，培養(yǎng)基pH值不降低，表明豬肺炎支原體HN0613株菌液滅活成功。
1.2副豬嗜血桿菌抗原的制備
按照中國專利CN103083655A分別制備副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株菌液及測定菌液含量，結(jié)果：副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株的含量均為5×109CFU/ml；并對菌液進行滅活及檢驗，結(jié)果：平皿中無任何細菌生長，表明副豬嗜血桿菌4型JS株和5型ZJ株菌液滅活均成功。
實施例2佐劑的制備
鋁膠：購自美國General Chemical,LLC的HPA佐劑。
殼聚糖母液：將購自青島海匯生物工程有限公司的殼聚糖(分子量為145kD，脫乙酰度為50％)完全溶解于含1％V/V醋酸水溶液中配制成濃度為15mg/ml的殼聚糖醋酸溶液，用NaOH調(diào)節(jié)溶液至pH7.4，并進行過濾除菌，即得15mg/ml殼聚糖母液。
卵磷脂母液：將購自北京源華美磷脂科技有限公司的1g卵磷脂用乙醇溶解，加入PBS溶液混合均勻后進行減壓蒸餾，待乙醇揮發(fā)盡后置于組織搗碎機攪拌10分鐘，于115-125℃蒸汽滅菌30分鐘，用超聲波超聲攪拌兩次，10分鐘/次，加入PBS溶液至100ml， 并進行過濾除菌，即得10mg/ml卵磷脂母液。
實施例3滅活疫苗組合物的制備及動物試驗
3.1滅活疫苗組合物的制備
將實施例1制備的抗原、實施例2制備的佐劑使用PBS溶液稀釋，使稀釋后的各抗原溶液與佐劑終濃度按表1中滅活的疫苗組合物所含組分混合，以500-800轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速攪拌10-15分鐘，在終止攪拌前加入1％V/V的硫柳汞(購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司)溶液，使其終濃度不超過萬分之一，充分振蕩混勻、分裝，分裝后2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
表1滅活疫苗組合物所含組分
3.2滅活疫苗組合物之豬肺炎支原體抗原的動物試驗
將實施例3.1所制備的疫苗組合物A1、A2、A3、A5、B1、B2、B3、B5，分別頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)2型和豬瘟)，5頭/組，2ml/頭，同時設(shè)置參考疫苗對照組、攻毒對照組，共10組(共50頭仔豬)。免疫接種后測量體溫、觀察副反應(yīng)至28日，并于28日按照豬肺 炎支原體抗體檢測試劑盒(購自IDEXX)說明書進行抗體檢測，結(jié)果見表2；同時對所有豬氣管注射豬肺炎支原體濟南系強毒CVCC354株(購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CVCC354)，100MID50/頭，觀察28天后解剖，并觀察肺部病變，按照28分法對肺部病變進行評分。攻毒前后，分別對試驗組仔豬進行稱重，并計算平均日增重。
攻毒后大約10天左右，攻毒對照組其中5頭豬陸續(xù)出現(xiàn)咳嗽、氣喘等癥狀，皮毛不光滑；參考疫苗對照組有2頭豬出現(xiàn)了咳嗽的癥狀、并發(fā)生了副反應(yīng)；其他免疫組的豬未出現(xiàn)氣喘病的類似癥狀。攻毒前后，各試驗組豬的肺炎病變平均得分和平均日增重結(jié)果見表2。
表2滅活疫苗組合物之豬肺炎支原體抗原的動物試驗結(jié)果
注1：參考疫苗對照組所選用的疫苗為現(xiàn)有產(chǎn)品中的豬支原體肺炎滅活疫苗(J株)，即安百克(M+PAC)，按廠家說明書進行免疫。
注2：體溫“無”表明未發(fā)生一過性體溫升高，“有”表明發(fā)生一過性體溫升高，其中一過性體溫升高是指于二免疫后第1-2天體溫會短暫呈現(xiàn)40.5度，并于第3天恢復(fù)正常體溫。
注3：副反應(yīng)“無”表明未發(fā)生過副反應(yīng)，“有”表明發(fā)生過 副反應(yīng)，其中副反應(yīng)是指出現(xiàn)過短暫性精神沉郁、食欲減退、過敏反應(yīng)中的至少一種。
注4：差異性統(tǒng)計分析中，組間比較，字母相同者表示差異不顯著，字母不同者表示差異顯著(p＜0.05)。
由表2可知：1-4組、5-8組分別使用同樣含量豬肺炎支原體抗原和不同含量、成分佐劑的單苗或聯(lián)苗進行免疫，免疫后的血清抗體表明含鋁膠、殼聚糖佐劑的疫苗組合物及含鋁膠、殼聚糖、卵磷脂佐劑的疫苗組合物的抗體水平均高于參考疫苗的抗體水平，且含鋁膠、殼聚糖、卵磷脂佐劑的疫苗組合物的抗體水平高于含鋁膠、殼聚糖佐劑的疫苗組合物的抗體水平；之后進行攻毒，結(jié)果顯示1-4組、5-8組免疫豬均未發(fā)生一過性體溫升高，也未出現(xiàn)副反應(yīng)，并且肺炎病變減少率分別均＞67％、＞80％，平均日增重分別為0.0399-0.04016kg、0.0412-0.0414kg，雖1-4組各小組、5-8各小組之間差異不顯著(p＞0.05)，但1-4組與5-8組相比差異均顯著(p＜0.05)；與參考疫苗對照組相比，差異也均顯著(p＜0.05)；與攻毒對照組相比，差異也均顯著(p＜0.05)。表明疫苗組合物中佐劑含鋁膠、殼聚糖、卵磷脂的免疫效果顯著優(yōu)于含鋁膠、殼聚糖的。
3.3滅活疫苗組合物之副豬嗜血桿菌抗原的動物試驗
將實施例3.1所制備的疫苗組合物A4、A5、B4、B5，分別頸部肌肉注射免疫14-21日齡仔豬(排除豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)2型和豬瘟)，5頭/組，2ml/頭，同時設(shè)置參考疫苗對照組、攻毒對照組，共6組(依次命名為1、2、3、4、參考疫苗對照組1、攻毒對照組1)；同時做重復(fù)試驗，共6組(命名為11、12、13、14、參考疫苗對照組2、攻毒對照組2)，詳見表3。
免疫接種后測量體溫、觀察副反應(yīng)至28日，結(jié)果見表3；并于免疫接種后28日按照副豬嗜血桿菌抗體檢測試劑盒(購自Biovet)進行抗體檢測，結(jié)果見表3。同時進行攻毒，前6組用副豬嗜血桿菌4型JS株腹腔注射3ml進行攻毒，攻毒劑量為9.0× 109CFU/頭；后6組用副豬嗜血桿菌5型ZJ株腹腔注射3ml進行攻毒，攻毒劑量為6.0×109CFU/頭，攻毒后觀察各組豬臨床表現(xiàn)，觀察14天后剖殺進行病理觀察。攻毒前后分別對試驗組仔豬進行稱重，以計算平均日增重，結(jié)果見表3。
表3滅活疫苗組合物之副豬嗜血桿菌抗原的動物試驗結(jié)果
注1：參考疫苗對照組所用副豬嗜血桿菌病滅活疫苗為中牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠生產(chǎn)的，抗原含量為4.0×109CFU/頭份，按照廠家說明書進行兩次免疫。
注2：體溫“無”表明豬只均未發(fā)生一過性體溫升高，“有”表明至少1只豬出現(xiàn)過一過性體溫升高，其中一過性體溫升高是指于二免疫后出現(xiàn)1-3天體溫會短暫呈現(xiàn)40.5度及以上，并于第4天恢復(fù)正常體溫。
注3：副反應(yīng)“無”表明豬只均未發(fā)生過副反應(yīng)，“有”表明至少1只豬發(fā)生過副反應(yīng)，其中副反應(yīng)是指出現(xiàn)過短暫性精神萎靡、 咳嗽、呼吸困難、食欲減退、過敏反應(yīng)中的至少一種。
注4：差異性統(tǒng)計分析中，組間比較，字母相同者表示差異不顯著，字母不同者表示差異顯著(p＜0.05)。
由表3可知：1-2、3-4、5-6、7-8組分別使用含副豬嗜血桿菌抗原和同樣含量佐劑的單苗或聯(lián)苗進行免疫，免疫后均未出現(xiàn)體溫升高、也未發(fā)生副反應(yīng)，所產(chǎn)生的血清抗體表明含鋁膠、殼聚糖佐劑的自制疫苗及含鋁膠、殼聚糖、卵磷脂佐劑的疫苗組合物的抗體水平高于參考疫苗的抗體水平，且含鋁膠、殼聚糖、卵磷脂佐劑的疫苗組合物的抗體水平高于含鋁膠、殼聚糖佐劑的疫苗組合物的抗體水平；之后進行攻毒，結(jié)果顯示1-2、3-4、5-6、7-8組免疫豬只均獲得完全保護，平均日增重分別為0.0324-0.0325kg、0.0336-0.0337kg、0.0324-0.0327kg、0.0338-0.0339kg。雖1-2組各小組、3-4各小組、5-6組各小組、7-8組各小組之間差異不顯著(p＞0.05)，但1-2組與3-4組差異均顯著(p＜0.05)、5-6組與7-8組差異均顯著(p＜0.05)；與參考疫苗對照組相比，抗原含量低時免疫保護效率也較高，且平均日增重差異均顯著(p＜0.05)；與攻毒對照組相比，平均日增重差異均顯著(p＜0.05)。表明含鋁膠、殼聚糖、卵磷脂佐劑的疫苗組合物的免疫效果顯著優(yōu)于含鋁膠、殼聚糖佐劑的疫苗組合物的免疫效果。
綜上所述，含鋁膠、殼聚糖、卵磷脂佐劑的疫苗組合物的免疫效果顯著優(yōu)于含鋁膠、殼聚糖佐劑的疫苗組合物的免疫效果，這些疫苗組合物(1)免疫動物后的免疫應(yīng)答水平隨佐劑含量的增加而有所升高，且與現(xiàn)有商品化疫苗的免疫應(yīng)答水平相當(dāng)甚至較高，抗體持續(xù)時間也較長，無體溫升高、無副反應(yīng)發(fā)生，效果確實；(2)在抗原含量較低時也能使動物獲得較好的免疫效果，免疫次數(shù)少也可使豬的應(yīng)激反應(yīng)減少甚至消失。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并非對本發(fā)明做任 何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。