本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的疫苗及其制備方法，本發(fā)明還涉及所述疫苗預防乙肝病毒感染和治療慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)感染的用途，以及所述疫苗聯(lián)合HBsAg疫苗治療慢性乙型肝炎的用途。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)為雙鏈DNA病毒，屬于嗜肝性病毒，能夠通過血液和體液接觸進行傳播。在感染肝臟后，HBV能夠引發(fā)多種疾病，包括急性和慢性肝炎，肝纖維化，肝硬化和肝癌。全球范圍內(nèi)大約有2.4億慢性乙型肝炎患者，每年有大約100萬人死于HBV感染所導致的肝硬化和肝癌(1)。但是目前仍舊沒有有效治療慢性乙型肝炎的策略，現(xiàn)有的HBV治療方式主要包括抗病毒藥物(核苷類似物)和干擾素，它們雖然有一定的治療效果療效，但是通常不能誘導有效的免疫應答，從而無法徹底清除HBV感染；而且長期用藥導致的副作用較大，抗病毒藥物也會產(chǎn)生耐藥性。慢性HBV感染是威脅人類身體健康的主要疾病之一，探索慢性乙型肝炎有效的免疫治療策略迫在眉睫，研制慢性乙型肝炎的治療性疫苗具有十分重要的社會意義和經(jīng)濟意義。

HBV疫苗研究主要分為三個發(fā)展階段：第一代疫苗以患者血液提取乙肝病毒抗原HBsAg為疫苗；第二代疫苗由基因工程構(gòu)建酵母表達重組HBsAg疫苗；第三代乙肝疫苗則由真核細胞表達乙肝病毒全長包膜蛋白基因，為含有L-HBsAg，M-HBsAg以及HBsAg的混合疫苗。乙肝病毒有三種包膜蛋白，分別是small HBsAg(S-HBsAg)，簡稱為HBsAg，middle HBsAg(M-HBsAg)和large HBsAg(L-HBsAg)。S-HBsAg由226個氨基酸組成，是目前臨床預防性乙肝疫苗的成分，也是慢性乙型肝炎患者血清中假病毒顆粒(pseudovirus)的主要成分；M-HBsAg是在HBsAg的N端連接 有一個55個氨基酸的preS2區(qū)域，也是假病毒顆粒的重要組成成分；L-HBsAg是在M-HBsAg的N端連接有一個由108個或119個氨基酸(根據(jù)乙肝不同亞型，ay型108個，ad型119個)組成的preS1區(qū)域。

目前preS1疫苗的研究，多集中在融合蛋白疫苗，如含有L-HBsAg的第三代HBV預防性疫苗(2)，以及將preS1表位融合表達在HBV病毒核衣殼蛋白表面等等，以期提高其免疫原性(3)。研究表明第三代疫苗能夠提高HBsAg的抗體應答率，在一些對傳統(tǒng)疫苗沒有應答的接種者體內(nèi)，也能夠誘導很好的抗體反應(4,5)。但是由于缺乏合適的動物模型，目前尚未明確第三代疫苗對慢性乙型肝炎的臨床治療性效果。另外，preS1N端的豆蔻?；揎椖軌?qū)⑵洳迦氲絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，從而限制了L-HBsAg的分泌表達，這也成為限制第三代疫苗生產(chǎn)效率的因素(6,7)。再者，這些研究忽略了慢性乙型肝炎感染過程中，HBsAg，HBcAg蛋白的免疫耐受情況，將preS1同免疫耐受的抗原融合表達，很可能在慢性乙型肝炎中誘導preS1的免疫耐受，因而限制preS1疫苗的治療性效果。

HBV誘導的免疫耐受，是治療慢性乙型肝炎的瓶頸。在HBV感染過程中，HBV病毒粒子能夠抑制pDC分泌一型干擾素(8)，血清中大量游離的HBsAg和HBeAg可以抑制TLR受體活化從而影響pDC的功能(9,10)。這些都限制了天然免疫系統(tǒng)對于HBV感染的清除作用。獲得性免疫對于HBV清除至關(guān)重要(11)。CD8+T細胞能夠通過直接殺傷感染的肝臟細胞而控制HBV感染(12)，CD4+T helper細胞則可以通過分泌IFN-γ，TNF-α等細胞因子，以及輔助特異性CTL應答來清除細胞內(nèi)的HBV病毒(13)。另外，CD4+T helper細胞對于特異性病毒抗體的產(chǎn)生具有重要輔助作用。但是在CHB患者中，HBV特異性適應性免疫呈現(xiàn)耐受狀態(tài)，無法對HBV常規(guī)疫苗產(chǎn)生應答，從而導致慢性持續(xù)性病毒感染。目前對于CHB免疫耐受機制的闡述仍不明確，有觀點認為，CHB感染中持續(xù)的高水平的抗原和病毒滴度是導致免疫耐受的重要原因。高滴度病毒和抗原的持續(xù)，促使HBV特異性T細胞功能逐漸失活，直至最終凋亡而被清除(14,15)。另外由于肝臟的特殊性，高水平的抗原通常在該器官引起免疫耐受(16)。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在CHB感染過程中，HBV特異性T細胞上調(diào)多種免疫抑制分子影響其功能，如Bim，CTLA-4，PD-1，TIM-3等等(17-19)；而且 CHB患者中存在更多的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)(20)。這些都限制了獲得性免疫清除HBV感染的能力，是導致CHB持續(xù)感染的重要原因。

但是也有研究表明慢性HBV感染過程中，不同的病毒抗原存在不同的耐受狀態(tài)。相對于HBeAg抗原誘導的免疫耐受，HBcAg能夠在慢性感染者中誘導特異性IgM反應，但是，由于HBeAg和其序列的同源性，大量游離的HBeAg誘導針對HBcAg的特異性T細胞反應耐受(21,22)。同樣Kazuhiro K.等發(fā)現(xiàn)，以HBV蛋白聚合酶(polymerase，HBp)作為疫苗可以在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中誘發(fā)免疫應答，只是由于CTL數(shù)量以及質(zhì)量的缺陷，HBp疫苗并沒有較好的治療效果(23)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

我們認為抗原滴度以及抗原免疫原性在誘導慢性HBV感染免疫反應中，發(fā)揮了重要作用。preS1的滴度遠遠低于HBV其它的包膜蛋白。而且最新的研究已經(jīng)表明，preS1的N端能夠同人肝臟細胞表面NTCP受體結(jié)合，從而介導HBV的感染(24)。因而preS1特異性抗體能夠中和HBV病毒并且可以保護宿主免受HBV病毒的感染。構(gòu)建基于preS1蛋白的疫苗能引發(fā)相應的抗體應答和T細胞免疫反應。以上特點顯示preS1具有作為HBV疫苗的潛力，特別是具有治療慢性HBV感染的潛力。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種乙肝病毒感染治療策略。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種通過原核表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠用于表達純化preS1蛋白。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種聯(lián)合佐劑促進preS1免疫反應的策略，通過將preS1抗原和佐劑混合，能夠顯著增強preS1免疫原性。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種采用preS1抗原作為疫苗，直接用于預防HBV感染的策略，其同臨床使用的HBsAg疫苗具有相同的保護性效果。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種采用preS1抗原作為疫苗，治療慢性乙型肝炎的策略，直接以preS1作為疫苗能夠在慢性乙型肝炎感染宿主體內(nèi)誘導強將的免疫應答，顯著降低HBV相關(guān)抗原的表達，并且清除血清中HBV病毒，同時阻斷病毒對于肝臟細胞的感染。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種采用preS1抗原作為疫苗，聯(lián)合乙肝包膜蛋白HBsAg蛋白作為慢性乙型肝炎治療的策略，該策略能夠最終誘導慢性乙型肝炎宿主體內(nèi)HBsAg-HBsAb的血清學轉(zhuǎn)化，同時顯著清除肝內(nèi)的HBV病毒，對于慢性乙型肝炎感染具有一定的治愈效果。

具體地，本發(fā)明涉及以下各項：

1.一種用于慢性乙型肝炎病毒感染的治療性疫苗，所述疫苗的活性成分是氨基酸序列與乙型肝炎病毒包膜蛋白的preS1區(qū)域的氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)。

2.根據(jù)1所述的疫苗，其中所述preS1區(qū)域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示。

3.根據(jù)1所述的疫苗，所述疫苗還包含佐劑。

4.根據(jù)3所述的疫苗，其中所述佐劑選自鋁佐劑(Alum)、Toll樣受體4激活劑配體MPLA、Toll樣受體9配體，寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)和弗氏佐劑。

5.氨基酸序列與乙型肝炎病毒包膜蛋白的preS1區(qū)域的氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)在制備用于慢性乙型肝炎病毒感染的治療性疫苗中的用途。

6.如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列在制備用于慢性乙型肝炎病毒感染的治療性疫苗中的用途。

7.如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核酸序列在制備用于慢性乙型肝炎病毒感染的治療性疫苗中的用途。

8.一種用于慢性乙型肝炎病毒感染的治療性疫苗試劑盒，所述試劑盒包含氨基酸序列與乙型肝炎病毒包膜蛋白的preS1區(qū)域的氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)和乙型肝炎病毒包膜蛋白HBsAg。

9.氨基酸序列與乙型肝炎病毒包膜蛋白的preS1區(qū)域的氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)聯(lián)合乙型肝炎病毒包膜蛋白HBsAg在制備用于慢性乙型肝炎病毒感染的治療性疫苗試劑盒中的用途。

附圖說明

圖1顯示了原核表達系統(tǒng)純化preS1蛋白的流程和結(jié)果。包括純化過程中不同階段蛋白聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳結(jié)果和純化后preS1 蛋白SDS-PAG電泳結(jié)果和蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)的結(jié)果，preS1(ay亞型)為108個氨基酸，蛋白大小約12KD，preS1(ad亞型)為119個氨基酸，蛋白大小約為13KD。

圖2顯示了preS1疫苗免疫野生小鼠(WT)的流程，及preS1疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體應答和特異性T細胞免疫應答。通過以preS1蛋白包被，以ELISA進行抗體檢測，通過Elispot檢測preS1特異性T細胞免疫應答。

圖3顯示了preS1作為疫苗預防HBV感染過程中誘導的免疫應答。通過ELISA檢測抗體特異性B細胞抗體應答，通過Elispot檢測特異性T細胞免疫應答。

圖4顯示了preS1作為疫苗預防HBV感染的能力。通過preS1通過ELISA檢測HBV相關(guān)抗原的維持情況，通過熒光定量PCR(Q-PCR)檢測血清中HBV病毒滴度。

圖5顯示了preS1作為疫苗阻斷HBV感染肝臟細胞的能力。將anti-preS1抗血清同HBV病毒共孵育后，同時加入到感染細胞HepG2-hNTCP中，感染24h。之后用新鮮培養(yǎng)基洗滌三次，進行換液，以后每隔2天收取感染上清，檢測上清中HBsAg，HBeAg抗原的表達水平，同時在感染最后一天收集細胞，提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測HBV相關(guān)基因表達水平。結(jié)果顯示preS1作為疫苗產(chǎn)生的anti-preS1抗體應答能夠顯著降低HepG2-hNTCP培養(yǎng)上清中的HBsAg和HBeAg，同時qPCR也顯示anti-preS1顯著阻斷了HBV對肝臟細胞的感染。

圖6顯示了preS1作為疫苗治療HBV慢性感染的流程以及在慢性HBV感染模型中誘導特異性免疫應答的能力。通過尾靜脈注射AAV-HBV1.3感染小鼠，我們構(gòu)建了慢性HBV感染模型，該模型表現(xiàn)出同臨床CHB一致的病毒學和免疫學表癥，為研究慢性HBV感染提供了研究平臺。實驗結(jié)果表明目前臨床用HBV疫苗(成分為HBsAg)，不能夠在慢性HBV感染中產(chǎn)生免疫應答，不具有治療慢性HBV感染的能力，而preS1疫苗免疫慢性HBV感染能夠誘導強勁的免疫應答，包括誘導preS1到anti-preS1的血清學轉(zhuǎn)化，誘導preS1特異性T細胞免疫應答，而且其強度同preS1疫苗在WT小鼠中誘導的免疫應答強度相同。

圖7顯示了preS1疫苗治療慢性HBV感染的能力和效果，同時與HBV 傳統(tǒng)疫苗(成分為HBsAg)作用于慢性HBV感染進行了對比。傳統(tǒng)HBV疫苗對于慢性HBV感染沒有任何治療性效果，但是preS1抗原疫苗能夠顯著清除血清中HBV相關(guān)抗原，并且清除血清中HBV DNA。

圖8顯示了在慢性HBV感染過程中，preS1疫苗誘導的抗體應答能夠阻斷HBV對于肝臟細胞的感染。

圖9顯示了preS1聯(lián)合HBsAg作為疫苗，在慢性HBV感染中能夠打破HBV免疫耐受。

圖10顯示了preS1HBsAg作為疫苗，在慢性HBV感染中誘導HBsAg-HBsAb血清學轉(zhuǎn)化，并清除肝內(nèi)HBV病毒感染。達到治愈慢性HBV感染的效果。

具體實施方式

下面的實施例僅用于進一步闡釋本發(fā)明的內(nèi)容，而不意欲在任何方面限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將領(lǐng)會，可對下述具體實施方式進行修飾而仍不偏離所附的權(quán)利要求所要求保護的本發(fā)明的范圍、精神和主旨。

在下面的所有實施例中，如無特別聲明，均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員慣常所用的方法、儀器、試劑和實驗方案等。

實施例1：本疫苗的表達純化

以AAV-HBV1.3(購自北京五加和分子醫(yī)學研究所有限公司)感染的小鼠肝臟cDNA(通過提取耐受小鼠肝臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得)為模板，設計特異性引物，通過PCR反應擴增得到HBV PRES1(ay亞型)DNA片段，其核苷酸序列為：

ATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACAGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGACAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGC C(SEQ ID NO:1)

其氨基酸序列為：

MGQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNPNKDTWPDANKVGAGAFGLGFTPPHGGLLGWSPQAQGILQTLPANPPPASTNRQTGRQPTPLSPPLRNTHPQA(SEQ ID NO:2)

另外，HBV PRES1(ad亞型)DNA序列為：

ATGGGAGGTTGGTCATCAAAACCTCGCAAAGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCATCAAGAACCACTGGCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAGGACTCACCCCTCCACACGGCGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCC(SEQ ID NO:3)

其氨基酸序列為：

MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQA(SEQ ID NO:4)。

所用引物序列如下：

PRES1-F：5’-CGGGATCCATGGGGCAGAATCTTTCCACCA-3’(SEQ ID NO:5)

PRES1-R：5’-CCGCTCGAGCTAGGCCTGAGGATGAGTGTTTCT-3’(SEQ ID NO:6)

通過限制性內(nèi)切酶BamHI以及XhoI(購買自New England Biolabs(UK)公司)處理，將得到的preS1核苷酸序列通過T4DNA連接酶(購買自New England Biolabs(UK)公司)構(gòu)建于sumo-pET-28a(購自Novogen公司)為表達載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Top10感受態(tài)細胞(購買自北京天根生化科技有限公司)，挑取單克隆菌落并進行菌落PCR鑒定與酶切鑒定。鑒定成功后保存菌落，并命名為sumo-pET-28a-preS1。

將sumo-pET-28a-preS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)表達菌株(購買 自北京天根生化科技有限公司)，通過0.1-1mM IPTG進行誘導表達，將誘導后菌體收集并進行高壓裂解，收集到的細胞上清。通過Ni-NTA進行分離純化，使用Elution Buffer(PBS Binding Buffer+20mM/50mM/100mM/200mM/500mM咪唑)進行分段梯度洗脫，每個梯度5-10個柱體積，洗脫液分管收集，用蛋白指示液(Bio-Rad protein assay)觀察洗脫峰。SDS-PAGE電泳檢測洗脫峰蛋白純度，將純度大于90％蛋白收集管混合(圖1A)。利用Zeba脫鹽離心柱或濃縮離心柱(購自Thermo Fisher公司)將目的蛋白溶液置換到所需要的PBS緩沖液中(注意調(diào)節(jié)緩沖液pH＝8左右)。然后將合并在一起的蛋白上清中加入SUMO protease蛋白酶，4℃，過夜酶切，將preS1蛋白N端的SUMO-tag切掉(圖1B)。切掉的SUMO tag N端含有his-tag，可以再通過Ni-柱分離his-SUMO和preS1。分離得到的preS1中會含有部分SUMO，為了進一步純化preS1，通過陰離子交換柱(GE healthcare，HiTrap Q HP)分離純化。得到的蛋白峰通過SDS-PAGE(圖1C)以及Western Blot(圖1D)進行鑒定，純化的preS1組分通過以購買的preS1為標準進行定量，同時用Nano-drop進行定量。

實施例2：以preS1抗原作為疫苗，檢測其誘導體內(nèi)免疫應答效果。

用10μg由實施例1所得到preS1蛋白(單獨的，或聯(lián)合以下佐劑：鋁佐劑(購自InvivoGen公司，1:1-1:9混合)、10μg TLR-4配體MPLA佐劑(購自InvivoGen公司)、30μg TLR-9配體CpG佐劑(由Invitrogen公司合成)或弗氏佐劑(IFA)(購自Sigma公司)皮下免疫C57BL/6小鼠(6-8周，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。免疫流程如圖2A所示。免疫后通過ELISA檢測血清中抗-preS1抗體應答反應(圖2B)；通過ELISPOT檢測脾臟中preS1特異性T細胞免疫反應(圖2C)。實驗結(jié)果表明preS1蛋白聯(lián)合佐劑后應用能夠誘導強勁的抗體應答和特異性T細胞免疫應答。

實施例3：通過HBV體內(nèi)感染實驗，驗證preS1抗原疫苗預防HBV感染的能力。

通過實施例2中的免疫方法，將10μg實施例1中純化的preS1蛋白聯(lián)合弗氏佐劑皮下免疫C57BL/6小鼠(6-8周，雄性，購自北京維通利華實 驗動物技術(shù)有限公司)。免疫流程如圖3A所示，間隔14天兩次皮下免疫。通過ELISA檢測小鼠的血清中測到高滴度preS1特異性抗體抗-preS1(圖3B)。然后通過尾靜脈感染1x10¹⁰vg(viral genome)AAV-HBV1.3(購自北京五加和分子醫(yī)學研究所有限公司)，感染后每周采血檢測血清中HBV相關(guān)抗原，包括HBsAg抗原、preS1抗原以及HBV-DNA的變化情況。

結(jié)果顯示相較于未進行蛋白免疫組而言，preS1疫苗免疫能夠顯著預防HBV感染，免疫后產(chǎn)生的抗-preS1抗體能夠很快完全清除血清中preS1抗原(圖3C)，而且熒光定量PCR(real-time PCR)檢測血清中HBV-DNA的水平也表明，preS1疫苗免疫能夠清除血清中HBV病毒(圖3D)。相較于傳統(tǒng)HBsAg疫苗對照組而言，preS1表現(xiàn)出來相同的保護性效果(圖3C和圖3D)。以上實驗結(jié)果表明，preS1作為疫苗，能夠有效預防HBV感染。

在HBV感染后，我們通過Elispot實驗表明，相較于傳統(tǒng)HBsAg疫苗(成分為S-HBsAg)對照組而言，preS1疫苗在HBV感染后的小鼠中能夠誘導強勁的針對HBsAg特異性B細胞和T細胞免疫應答(圖4)。

實施例4：PreS1抗原疫苗能夠阻斷HBV感染肝臟細胞

我們通過體外感染系統(tǒng)證明preS1疫苗免疫產(chǎn)生的抗體能夠抑制HBV感染肝臟細胞。首先通過將實施例1中純化的preS1抗原聯(lián)合弗氏佐劑皮下免疫小鼠，總共免疫兩次，第一次和第二次免疫間隔14天，得到抗-preS1抗血清。然后分別將preS1抗血清和小鼠IgG對照抗體與HBV病毒共孵育，然后將其加入HepG2-hNTCP細胞(24)中進行感染，24小時之后換液，用DMEM完全培養(yǎng)基洗滌三次，然后加入新鮮PMM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，以后每隔2天換液，分別收集上清，檢測上清中抗原的表達情況。如果HBV病毒能夠感染細胞，那么隨著感染時間的增加，培養(yǎng)上清中HBV相關(guān)的抗原水平會不斷增加，而如果HBV感染被阻斷，那么抗原的水平相較于感染組就會有顯著的降低。

結(jié)果顯示相對于對照小鼠IgG抗體而言，抗-preS1抗血清同HBV共孵育之后，能夠明顯抑制細胞培養(yǎng)上清中HBV相關(guān)抗原HBsAg和HBeAg的表達(圖5A和5B)，表明HBV感染肝臟細胞確實能夠被抗-preS1阻斷。在HBV感染后，細胞培養(yǎng)的最后一天，我們收集細胞并提取了細胞的總 RNA，之后進行逆轉(zhuǎn)錄，通過反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中HBV相關(guān)RNA，包括3.5Kb RNA和總RNA的情況，實驗結(jié)果結(jié)果同樣表明，相對于對照抗體，抗-preS1能夠顯著減少HBV相關(guān)RNA水平(圖5C和5D)，證明了抗-preS1抗體抑制HBV感染肝臟細胞。

實施例5：PreS1蛋白疫苗能夠作為慢性乙型肝炎感染(chronic hepatitis B，HBV)的治療性疫苗

C57BL/6小鼠(6-8周，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，尾靜脈注射1x10¹⁰vg(viral genome)AAV-HBV1.3(購自北京五加和分子醫(yī)學研究所有限公司)。在感染之后4周建立穩(wěn)定的HBV耐受及慢性HBV感染模型。通過該模型，我們驗證preS1蛋白疫苗治療慢性乙型肝炎的能力(圖6A)。

在野生C57BL/6小鼠中，免疫傳統(tǒng)HBsAg疫苗(成分為S-HBsAg，5μg，弗氏佐劑，皮下免疫)能夠產(chǎn)生強勁的免疫應答反應，包括特異性抗體應答和T細胞免疫反應(圖6B和6C)。但是以同樣的免疫方式處理HBV耐受小鼠，我們發(fā)現(xiàn)，HBsAg特異性的抗體應答和T細胞免疫反應都受到了明顯的抑制，表明在慢性乙型肝炎感染的過程中，HBsAg存在著很強的免疫耐受狀態(tài)，直接以HBsAg作為疫苗，無法在HBV耐受小鼠中產(chǎn)生治療性效果(圖6B和6C)。

但是通過preS1蛋白(實施例1純化所得，10μg，弗氏佐劑，皮下免疫)疫苗進行免疫，我們發(fā)現(xiàn)不論在野生小鼠還是耐受小鼠中，其都能夠誘導強勁的抗體應答和T細胞免疫應答(圖6D和6E)。通過采集血清，我們檢測野生小鼠和耐受小鼠抗體應答情況(圖6D)。另外我們分別分離了免疫后的外周組織，包括淋巴結(jié)、脾臟以及肝臟中的淋巴細胞，檢測preS1特異性T細胞免疫應答(圖6E)。不同于HBsAg誘導免疫耐受，免疫preS1能夠在慢性乙型肝炎免疫耐受期產(chǎn)生強勁的B細胞和T細胞免疫應答。

之后我們檢測preS1疫苗免疫后小鼠血清中preS1抗原，以及血清中HBV-DNA的變化情況。結(jié)果顯示，在preS1疫苗免疫之后，血清中preS1抗原能夠被完全清除(圖7A)，而且血清中的HBV-DNA最終能夠被完全清除(7B)，而未處理對照組以及HBsAg疫苗免疫組都沒有治療效果(圖7A 和7B)。另外，我們通過體外感染實驗也驗證了preS1疫苗在HBV耐受模型中產(chǎn)生的抗體能夠預防HBV再次感染肝臟細胞(圖8)。

通過以上實驗，preS1在慢性乙型肝炎中不耐受，以其作為疫苗能夠清除HBV耐受模型血清中HBV，并且阻斷HBV再次感染肝臟細胞，對于慢性乙型肝炎具有很好的治療性效果。

實施例6：PreS1疫苗聯(lián)合HBsAg疫苗應用，能夠誘導慢性乙型肝炎感染的HBsAg-HBsAb血清學轉(zhuǎn)化，達到清除肝細胞中HBV病毒感染的目的

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，preS1疫苗免疫后能夠在感染小鼠中誘導HBsAg特異性免疫應答(圖4)。受此啟發(fā)，我們采用了聯(lián)合preS1和HBsAg免疫的方式對preS1疫苗誘導的針對HBsAg的免疫反應進行放大。在尾靜脈感染AAV-HBV1.3(購買自北京五加和分子醫(yī)學研究所有限公司)建立的耐受小鼠中(C57BL/6小鼠，6-8周，雄性，購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，我們首先通過連續(xù)兩次的preS1(實施例1純化所得，10μg，弗氏佐劑，皮下免疫)疫苗免疫，然后采用5ug HBsAg疫苗聯(lián)合30ug CpG佐劑進行免疫的方式放大HBsAg免疫應答。

我們發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合preS1和HBsAg作為治療慢性乙型肝炎的策略，最終能夠打破HBsAg耐受，同時在外周淋巴組織和肝臟中誘導特異性HBsAg免疫反應(圖9)。HBV耐受小鼠中產(chǎn)生的免疫反應能夠完全清除血清中HBsAg，同時誘導了部分的血清學HBsAb的轉(zhuǎn)化(圖10A和10B)，這在臨床上被認為是HBV治愈的關(guān)鍵指標。另外我們分別通過熒光定量PCR(real-time PCR)的方法檢測了肝臟組織中HBV相關(guān)的DNA的表達水平，結(jié)果顯示，相對于單獨只免疫HBsAg疫苗對照組而言，preS1聯(lián)合HBsAg的免疫方式能夠最終降低肝臟中HBV相關(guān)基因的水平(圖10C)。我們還通過免疫組化的方式檢測肝臟中HBcAg陽性的細胞，同樣表明preS1聯(lián)合HBsAg能夠最終降低肝臟組織中HBV感染水平(圖10D)。

通過以上結(jié)果，我們發(fā)明了聯(lián)合preS1和HBsAg治療慢性乙型肝炎的疫苗策略。

文獻列表：

1.Organization WH.2015.Hepatitis B.Fact sheet.

2.Akbar SM,Furukawa S,Horiike N,Onji M.2004.Vaccine therapy for hepatitis B virus carrier.Curr Drug Targets Infect Disord 4:93-101

3.Malik IR,Chen A,Brass A,Ahlen G,Rahman M,Sallberg M,Qureshi JA,Frelin L.2012.A bi-functional hepatitis B virus core antigen(HBcAg)chimera activates HBcAg-specific T cells and preS1-specific antibodies.Scand J Infect Dis 44:55-9

4.McDermott AB,Cohen SB,Zuckerman JN,Madrigal JA.1998.Hepatitis B third-generation vaccines:improved response and conventional vaccine non-response--evidence for genetic basis in humans.J Viral Hepat 5Suppl 2:9-11

5.Schumann A,Fiedler M,Dahmen U,Grosse-Wilde H,Roggendorf M,Lindemann M.2007.Cellular and humoral immune response to a third generation hepatitis B vaccine.J Viral Hepat 14:592-8

6.Gallina A,De Koning A,Rossi F,Milanesi G.1994.Intracellular retention of hepatitis B virus surface protein mutants devoid of amino-terminal pre-S1sequences.J Gen Virol 75(Pt 2):449-55

7.Prange R,Clemen A,Streeck RE.1991.Myristylation is involved in intracellular retention of hepatitis B virus envelope proteins.J Virol 65:3919-23

8.Shi B,Ren G,Hu Y,Wang S,Zhang Z,Yuan Z.2012.HBsAg inhibits IFN-alpha production in plasmacytoid dendritic cells through TNF-alpha and IL-10induction in monocytes.PLoS One 7:e44900

9.Isogawa M,Robek MD,Furuichi Y,Chisari FV.2005.Toll-like receptor signaling inhibits hepatitis B virus replication in vivo.J Virol 79:7269-72

10.Jiang M,Broering R,Trippler M,Poggenpohl L,Fiedler M,Gerken G,Lu M,Schlaak JF.2014.Toll-like receptor-mediated immune responses are attenuated in the presence of high levels of hepatitis B virus surface antigen.J Viral Hepat 21:860-72

11.Schmidt J,Blum HE,Thimme R.2013.T-cell responses in hepatitis B and C virus infection:similarities and differences.Emerg Microbes Infect 2:e15

12.Thimme R,Wieland S,Steiger C,Ghrayeb J,Reimann KA,Purcell RH,Chisari FV.2003.CD8(+)T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection.J Virol 77:68-76

13.Guidotti LG,Rochford R,Chung J,Shapiro M,Purcell R,Chisari FV.1999.Viral clearance without destruction of infected cells during acute HBV infection.Science 284:825-9

14.Wherry EJ.2011.T cell exhaustion.Nat Immunol 12:492-9

15.Mueller SN,Ahmed R.2009.High antigen levels are the cause of T cell exhaustion during chronic viral infection.Proc Natl Acad Sci U S A 106:8623-8

16.Tay SS,Wong YC,McDonald DM,Wood NA,Roediger B,Sierro F,McGuffog C,Alexander IE,Bishop GA,Gamble JR,Weninger W,McCaughan GW,Bertolino P,Bowen DG.2014.Antigen expression level threshold tunes the fate of CD8 T cells during primary hepatic immune responses.Proc Natl Acad Sci U S A 111:E2540-9

17.Lopes AR,Kellam P,Das A,Dunn C,Kwan A,Turner J,Peppa D,Gilson RJ,Gehring A,Bertoletti A,Maini MK.2008.Bim-mediated deletion of antigen-specific CD8 T cells in patients unable to control HBV infection.J Clin Invest 118:1835-45

18.Boni C,Fisicaro P,Valdatta C,Amadei B,Di Vincenzo P,Giuberti T,Laccabue D,Zerbini A,Cavalli A,Missale G,Bertoletti A,Ferrari C.2007.Characterization of hepatitis B virus(HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection.J Virol 81:4215-25

19.Nebbia G,Peppa D,Schurich A,Khanna P,Singh HD,Cheng Y,Rosenberg W,Dusheiko G,Gilson R,ChinAleong J,Kennedy P,Maini MK.2012.Upregulation of the Tim-3/galectin-9 pathway of T cell exhaustion in chronic hepatitis B virus infection.PLoS One 7:e47648

20.Stoop JN,Claassen MA,Woltman AM,Binda RS,Kuipers EJ,Janssen HL,van der Molen RG,Boonstra A.2008.Intrahepatic regulatory T cells are phenotypically distinct from their peripheral counterparts in chronic HBV patients.Clin Immunol 129:419-27

21.Chen M,Sallberg M,Hughes J,Jones J,Guidotti LG,Chisari FV,Billaud JN,Milich DR.2005.Immune tolerance split between hepatitis B virus precore and core proteins.J Virol 79:3016-27

22.Milich DR,Chen MK,Hughes JL,Jones JE.1998.The secreted hepatitis B precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid:a mechanism for persistence.J Immunol 160:2013-21

23.Kakimi K,Isogawa M,Chung J,Sette A,Chisari FV.2002.Immunogenicity and tolerogenicity of hepatitis B virus structural and nonstructural proteins:implications for immunotherapy of persistent viral infections.J Virol 76:8609-20

24.Yan H,Zhong G,Xu G,He W,Jing Z,Gao Z,Huang Y,Qi Y,Peng B,Wang H,Fu L,Song M,Chen P,Gao W,Ren B,Sun Y,Cai T,Feng X,Sui J,Li W.2012.Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.Elife 1:e00049 。