本發(fā)明涉及一種抗菌羧甲基纖維素鈉敷料，尤其涉及一種含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料，以及所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在處理病人傷口時，需要在傷口上覆蓋敷料，防止細(xì)菌侵入和防止水分損失。傳統(tǒng)的敷料如紗布、繃帶等對創(chuàng)面雖有保護(hù)作用，但保濕吸液能力差，只能吸收自身重量的4-5倍，而且對于一些傷口在移除傳統(tǒng)敷料時，敷料容易粘連傷口組織，造成二次傷口破壞；對于大面積傷口以及復(fù)雜傷口的覆蓋、止血效果欠佳，往往要借助于止血帶控制傷口出血，但不當(dāng)使用止血帶可能造成創(chuàng)傷性截肢甚至死亡。

羧甲基纖維素鈉(羧甲基纖維素的鈉鹽)是以天然纖維素為原料制成的纖維素衍生物，具有良好的生物相容性，無毒，無刺激、可完全降解。羧甲基纖維素鈉敷料吸液量可達(dá)自身重量的10-20倍。羧甲基纖維素鈉具有優(yōu)越的三重止血效果。一為物理性止血，可溶性止血紗布遇血后，強(qiáng)力吸附血液中的水分，使血液黏度與濃度增大，流速減慢；另一方面，本品吸水后膨化，覆蓋創(chuàng)面，最終溶解成為黏性體，封閉出血點(diǎn)，達(dá)到止血的目的。二為化學(xué)性止血，可溶性止血紗布帶有大量的負(fù)離子，能迅速結(jié)合或網(wǎng)絡(luò)黏附血小板、紅血球，繼而釋放凝血相關(guān)因子，發(fā)揮強(qiáng)大的止血作用。三為生理性止血，可溶性止血紗布可迅速激活凝血因子XII，啟動內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，在凝血酶的作用下，加固形成不溶性纖維蛋白多聚體，發(fā)揮更加穩(wěn)定的止血功效。因此，羧甲基纖維素鈉敷料是一類性能非常好的功能型敷料，已被廣泛應(yīng)用于臨床、美容等領(lǐng)域。

在羧甲基纖維素鈉敷料中添加抗菌劑將提高該敷料的抗菌性，更加完善其功能，并且能夠使其易于運(yùn)輸、攜帶和消毒保存。銀有較強(qiáng)的抗菌性能，但是由于銀的不穩(wěn)定性以及對人體細(xì)胞的毒性較大，美國FDA已經(jīng)明 確禁止銀在醫(yī)療方面的使用，我國CFDA在醫(yī)用某些方面限制了含銀醫(yī)用產(chǎn)品的使用。

近年來，穩(wěn)定性更好、對人體細(xì)胞毒性更小的納米金作為抗菌劑的研究逐漸被報道。Zhao yuyun等(Zhao Y,Tian Y,Cui Y,et al.Small molecule-capped gold nanoparticles as potent antibacterial agents that target gram-negative bacteria[J].Journal of the American Chemical Society,2010,132(35):12349-12356；Zhao Y,Chen Z,Chen Y,et al.Synergy of non-antibiotic drugs and pyrimidinethiol on gold nanoparticles against superbugs[J].Journal of the American Chemical Society,2013,135(35):12940-12943.和Zhao Y,Ye C,Liu W,et al.Tuning the composition of AuPt bimetallic nanoparticles for antibacterial application[J].Angewandte Chemie International Edition,2014,53(31):8127-8131.)報道的氨基嘧啶或氨基嘧啶/含氨基小分子的雙組份藥物修飾的納米金抗菌劑和納米金鉑雙金屬抗菌劑有很強(qiáng)的廣譜抗菌性，特別對多藥耐藥菌有很強(qiáng)的殺滅作用，其對人體細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于納米銀，并且不會產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，是一類非常有前途的抗菌劑。Anna Regiel-Futyra(Regiel-Futyra A,M,Sebastian V,et al.Development of Noncytotoxic Chitosan–Gold Nanocomposites as Efficient Antibacterial Materials[J].ACS applied materials&interfaces,2015,7(2):1087-1099.)報道的殼聚糖絡(luò)合的納米金也具有優(yōu)異的抗菌性和對人體細(xì)胞低的毒性。

上述報道合成的納米金需要透析處理，工藝較復(fù)雜，工藝有待進(jìn)一步簡化；單純的納米金溶液不易用于臨床的傷口治療與修復(fù)，抗菌性能有待進(jìn)一步提高。

目前，國內(nèi)外尚無公開文獻(xiàn)報道添加有廣譜抗菌性而細(xì)胞毒性小的納米金制作的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣譜抗菌性且對人體細(xì)胞毒性小的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料，還提供了所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的制備方法及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料，所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料為附著有具有抗菌作用 的含金納米顆粒的羧甲基纖維素鈉敷料。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料，其中，所述含金納米顆粒占所述羧甲基纖維素鈉敷料的0.01～3質(zhì)量％(即質(zhì)量百分比)，優(yōu)選為0.01～1質(zhì)量％。優(yōu)選地，所述含金納米顆粒的平均粒徑在50nm以下。優(yōu)選為2～10nm。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料，其中，所述具有抗菌性能的含納米金的納米顆粒選自納米金、由單組份或多組分小分子藥物或大分子修飾的納米金、以及含納米金的雙組份或多組分金屬納米顆粒中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述由單組份或多組分小分子藥物或大分子修飾的納米金為以含氨基嘧啶類小分子作為單組份修飾的納米金顆?；蛞院被奏ゎ愋》肿?氨基類小分子作為雙組份修飾的納米金顆粒，所述含氨基嘧啶類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1，所述氨基類小分子與金元素的摩爾含量比為0.5:1～2:1。最優(yōu)選地，所述含氨基嘧啶類小分子為4,6-2氨基-2-巰基嘧啶，氨基類小分子為二甲雙胍或1-(3-氯酚)雙胍。

或優(yōu)選地，所述含納米金的雙組份或多組分金屬納米顆粒為納米金-鉑雙金屬納米顆粒。最優(yōu)選地，所述納米金-鉑雙金屬納米顆粒由80％原子百分比的金和20％原子百分比的鉑組成。

本發(fā)明還提供了上述的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的制備方法，其中，所述制備方法包括以下步驟：

(1)將納米金溶液與羧甲基纖維素鈉溶液或凝膠液攪拌均勻，靜置消泡獲得混合溶液或混合凝膠液；所述納米金溶液為含有所述具有抗菌作用的含金納米顆粒的分散液；

(2)將步驟(1)中的所述混合溶液或混合凝膠液平鋪于成膜裝置，放入烘箱或冷凍干燥機(jī)中干燥，制得所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料?？梢詫λ龊{米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料進(jìn)行分切、包裝、滅菌等進(jìn)一步操作以按需制得羧甲基纖維素鈉敷料產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的制備方法，其中，步驟(2)中的所述干燥的溫度低于200℃。優(yōu)選地，所述步驟(2)中的所述烘箱的干燥溫度為120～160℃，干燥時間為6～15min；所述冰凍干燥機(jī)的干燥溫度為-20℃，干燥時間為20h或也可以為數(shù)小時。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的制備方法， 其中，步驟(1)中所述納米金溶液濃度為100～8000ppm；所述含金納米顆粒在所述混合溶液或混合凝膠液中濃度為5ppm～300ppm。其中，1ppm通?？蓳Q算為1mg/L。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的制備方法，其中，步驟(1)中，所述羧甲基纖維素鈉在所述混合溶液或混合凝膠液中質(zhì)量百分比為0.5％～10％。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的制備方法，其中，步驟(1)中，所述攪拌時間為20min～2h。優(yōu)選地，所述靜置時間為1h～5h。

根據(jù)本發(fā)明提供的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的制備方法，其中，所述納米金溶液是通過以下步驟制得：

(a)按照配比，將氯金酸溶液與含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液或氯鉑酸鉀溶液混合，得到混合溶液；

(b)在攪拌下向所述混合溶液中快速加入還原劑，充分反應(yīng)后即得到所述納米金溶液；

其中，所述還原劑的加入時間不超過5分鐘，優(yōu)選不超過1分鐘，更優(yōu)選5～15秒。

優(yōu)選地，步驟(a)中所述含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液還可以包括有機(jī)酸或無機(jī)酸。優(yōu)選為乙酸、丙酸或鹽酸。更優(yōu)選地，酸在所述混合溶液中的質(zhì)量百分比為0.005％～10％。

優(yōu)選地，步驟(a)中所述含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液中還可以包括非離子表面活性劑。優(yōu)選為吐溫或聚乙二醇。更優(yōu)選地，非離子表面活性劑在所述混合溶液中的質(zhì)量百分比為0.005％～10％。

優(yōu)選地，步驟(b)中所述還原劑可以選自硼氫化鈉、檸檬酸鈉和抗壞血酸鈉中的一種或多種。步驟(b)中所述充分反應(yīng)溫度可以為室溫或室溫以下，例如可以為25℃以下，時間可以為0.5～3小時。

優(yōu)選地，所述還原劑與氯金酸的摩爾比或者所述還原劑與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾比為1:1～10:1。更優(yōu)選為2:1～4:1。

更優(yōu)選地，所述納米金溶液的制備方法不包含純化所述納米金溶液的步驟；進(jìn)一步優(yōu)選地，純化所述納米金溶液的步驟包括用透析袋透析處理或離心過濾處理。換言之，本發(fā)明生產(chǎn)方法不需要用透析袋透析處理或離心過濾處理等方式來純化納米金溶液。作為更進(jìn)一步的限定，上述納米金 溶液的制備方法也可以表述為由步驟(a)和步驟(b)組成。

本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在制備氯金酸溶液時使用的氯金酸原料可以為四水合氯金酸。

本發(fā)明還提供了上述的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料或采用上述制備方法制備的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料在制備用于臨床傷口處理、手術(shù)時防止器官粘連、美容或治療燒傷、燙傷、褥瘡感染的藥物或產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明制得的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料將具有優(yōu)異的廣譜抗菌性，無細(xì)菌耐藥性，對人體細(xì)胞毒性小的抗菌納米金添加到羧甲基纖維素鈉敷料中，具有吸液功能、保濕功能、止血功能、抗菌功能且對人體細(xì)胞毒性小，可用于臨床傷口處理，手術(shù)防止器官粘連，美容，治療燒傷、燙傷、褥瘡感染等各種創(chuàng)傷感染，是一種極為優(yōu)良的醫(yī)用敷料。

現(xiàn)有技術(shù)已報道的抗菌納米金的制備方法中，還原劑是以滴加的方式加入，對于工業(yè)化生產(chǎn)，背景報道的滴加方式耗時太長，不能實(shí)現(xiàn)，而在本發(fā)明提供的納米金溶液的制備方法中，還原劑為一次性快速加入到所述混合溶液，因此更節(jié)約時間，有助于提升生產(chǎn)效率。

背景報道的納米金溶液在反應(yīng)完成后需要用透析袋透析或離心沉淀，對于工業(yè)化生產(chǎn)，背景報道的后處理方法復(fù)雜，設(shè)備昂貴。而在本發(fā)明提供的納米金溶液的制備方法不需要透析或離心沉淀處理，因此工藝更為簡單，降低了生產(chǎn)成本，進(jìn)一步提升了生產(chǎn)效率。

通過試驗(yàn)檢測證明，本發(fā)明提供的制備方法所制備的納米金溶液的抗菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于還原劑滴加和/或經(jīng)過透析處理所制備的納米金溶液。本發(fā)明提供制備方法所制備的納米金溶液的細(xì)胞毒性明顯低于納米銀溶液和硝酸銀溶液。此外，本發(fā)明提供的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料與含同一類型同一質(zhì)量百分比的納米金抗菌溶液相比，抗菌效果更優(yōu)。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1示出了實(shí)施例2的納米金與商購納米銀的透射電鏡(TEM)圖；

圖2示出了實(shí)施例2的納米金溶液、商購納米銀、商購硝酸銀的細(xì)胞毒性比較。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。

本部分對本發(fā)明試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在上下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。

以下實(shí)施例中使用的試劑和儀器如下：

儀器：

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)；型號iCAP 6300；購自：美國Thermo Scientific公司；

透射電子顯微鏡(TEM)；型號Tecnai G2 20S-TWIN；購自：美國FEI 公司。

實(shí)施例1

本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料及其制備方法。

(1)將體積為10ml、濃度為800ppm的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/1-(3-氯酚)雙胍作為雙組份小分子修飾的納米金溶液與體積為300ml含0.4g羧甲基纖維素鈉溶液攪拌均勻，攪拌時間為50min，靜置消泡，靜置時間為2h，獲得混合溶液，納米金在混合溶液中的濃度為5ppm，羧甲基纖維素鈉在混合溶液中的質(zhì)量百分比為0.5％；

(2)將步驟(1)中的所述混合溶液平鋪于成膜裝置，放入烘箱干燥，干燥溫度為150℃，干燥10分鐘制得所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料。

(3)對所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料進(jìn)行分切、包裝、滅菌。

上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/1-(3-氯酚)雙胍作為雙組份修飾的納米金的制備方法為：

(a)將0.04g的四水合氯金酸溶于0.01L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶和1-(3-氯酚)雙胍溶于0.01L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助于促進(jìn)氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于0.005L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時10s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.025L的濃度約為800ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/1-(3-氯酚)雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為2:1，1-(3-氯酚)雙胍與金元素的摩爾含量比為0.5:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為3:1，乙酸占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％，表面活性劑吐溫80占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％。

在該含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片 羧甲基纖維素鈉敷料的含金量為0.1％(質(zhì)量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的含金納米顆粒的平均粒徑為6nm。

對比例1

按照與實(shí)施例1相同的制備方法制得對比例1的納米金溶液，再加入一定量去離子水，配制成不同濃度的納米金抗菌溶液，其中，包括與實(shí)施例1中的納米金羧甲基纖維素鈉敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量的納米金溶液。

對比例1.1

按照與對比例1相似的制備方法制得的對比例1.1的納米金溶液，對比例1.1中還原劑溶液以滴加的方式加入到反應(yīng)溶液中，并且采用透析處理24小時的方式得到納米金抗菌溶液，加入純化水，使其與對比例1中的納米金抗菌溶液有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

試驗(yàn)例1

通過試驗(yàn)例1中的抗菌實(shí)驗(yàn)，證明對比例1的納米金抗菌溶液要優(yōu)于對比例1.1的納米金抗菌溶液。抗菌效果見表1。

比較方法如下：采用最小抑菌濃度MIC(mg/L)來衡量，采用微孔稀釋方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methodsfor determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，將100μL不同濃度的對比例1和對比例1.1的納米金溶液分別加入到96微孔板中，10μL相同濃度(10⁴CFU/mL)的細(xì)菌培養(yǎng)液加入每個微孔中，37℃培養(yǎng)24小時后觀察，沒有可看見的細(xì)菌生長的微孔中最少的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

測試結(jié)果見表1。從測試結(jié)果可見，對比例1的納米金抗菌溶液的抗菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于對比例1.1的納米金抗菌溶液的抗菌效果。說明采用與對比例1制備方法相同的納米金溶液制備的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料，其抗菌效果也應(yīng)遠(yuǎn)優(yōu)于采用與對比例1.1制備方法相同的納米金溶液制備的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料。

表1對比例1和對比例1.1的納米金抗菌溶液的抗菌性能比較

實(shí)施例2

本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料及其制備方法。

(1)將體積為10ml、濃度為100ppm的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份小分子修飾的納米金溶液與體積為90ml，含10g羧甲基纖維素鈉凝膠液攪拌均勻，攪拌時間為20min，靜置消泡，靜置時間為1h，獲得混合凝膠液，納米金在混合凝膠液中的濃度為10ppm，羧甲基纖維素鈉在混合凝膠液中的質(zhì)量百分比為10％；

(2)將步驟(1)中的所述混合凝膠液平鋪于成膜裝置，放入烘箱干燥，干燥溫度為120℃，干燥15分鐘，制得所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料。

(3)對所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料進(jìn)行分切、包裝、滅菌。

上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金的制備方法為：

(a)將0.005g的四水合氯金酸溶于0.01L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶和二甲雙胍溶于0.01L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助于促進(jìn)氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于0.005L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時5s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.025L的濃度約為100ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為0.5:1，二甲雙胍與金元素的摩爾含量比為2:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為2:1，乙酸占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％，表面活性劑吐溫80占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.005％。

在該含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片羧甲基纖維素鈉敷料的含金量為0.01％(質(zhì)量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的含金納米顆粒的平均粒徑為4nm。

對比例2

按照與實(shí)施例2相同的制備方法制得對比例2的納米金抗菌溶液，再加入一定量去離子水，制成納米金質(zhì)量百分比為0.01％的抗菌溶液，使其與實(shí)施例2中的納米金羧甲基纖維素鈉敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例3

本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料及其制備方法。

(1)將體積為10ml、濃度為4000ppm的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份小分子修飾的納米金溶液與體積為123ml,含4g羧甲基纖維素鈉凝膠液攪拌均勻，攪拌時間為1.5h，靜置消泡，靜置時間為4h，獲得混合凝膠液，納米金在混合凝膠液中的濃度為300ppm，羧甲基纖維素鈉在混合凝膠液中的質(zhì)量百分比為3％；

(2)將步驟(1)中的所述混合凝膠液平鋪于成膜裝置，放入烘箱干燥，干燥溫度為160℃，干燥6分鐘，制得所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料。

(3)對所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料進(jìn)行分切、包裝、滅菌。

上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金的制備方 法為：

(a)將0.2g的四水合氯金酸溶于0.01L的去離子水中，得到氯金酸溶液。將一定量的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶和二甲雙胍溶于0.01L的去離子水中，還加入一定量的吐溫80和乙酸，以有助于促進(jìn)氨基嘧啶類小分子與氨基類小分子充分溶解于水中，得到含氨基嘧啶類小分子和/或氨基類小分子的溶液。將兩溶液混合，得到混合溶液。

(b)將一定量的抗壞血酸鈉溶于0.005L的去離子水中，在攪拌下將上述抗壞血酸鈉溶液快速加入(用時15秒)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.025L的濃度約為4000ppm的(按照投料比算出的)含有上述4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，4,6-2氨基-2-巰基嘧啶與金元素的摩爾含量比為1:1，二甲雙胍與金元素的摩爾含量比為1:1，還原劑抗壞血酸鈉與氯金酸的摩爾含量比為4:1，乙酸占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.005％，表面活性劑吐溫80占納米金溶液的質(zhì)量百分比為0.01％。

在該含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片羧甲基纖維素鈉敷料的含金量為1％(質(zhì)量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的含金納米顆粒的平均粒徑為7nm。

對比例3

按照與實(shí)施例3相同的制備方法制得對比例3的納米金抗菌溶液，再加入一定量去離子水，使其與實(shí)施例3中的納米金羧甲基纖維素鈉敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例4

本實(shí)施例用于說明本發(fā)明的含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料及其制備方法。

(1)將體積為10ml、濃度為8000ppm的納米金-鉑(雙金屬納米顆粒Au₈₀Pt₂₀)溶液(即納米金溶液)與體積為257ml、含2.67g的羧甲基纖維素鈉凝膠液攪拌均勻，攪拌時間為2h，靜置消泡，靜置時間為5h，獲得混合凝膠液，納米金在混合凝膠液中的濃度比為300ppm，羧甲基纖維素鈉在混合凝膠液中的質(zhì)量百分比為1％；

(2)將步驟(1)中的所述混合凝膠液平鋪于成膜裝置，放入冷凍干燥機(jī)干燥，干燥溫度為-20℃，干燥20h，制得所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料。

(3)對所述含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料進(jìn)行分切、包裝、滅菌。

上述納米金-鉑雙金屬納米顆粒的制備方法為：

(a)將0.27g的四水合氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)和0.08g氯鉑酸鉀(K₂PtCl₆)溶于0.02L的去離子水中，得到混合溶液。

(b)將一定量的硼氫化鈉溶于0.005L的去離子水中，在攪拌下將上述硼氫化鈉溶液快速加入(用時5s)到上述混合溶液中，在室溫以下攪拌1小時至充分反應(yīng)，不需采用透析等純化工藝，即得到約0.025L的濃度約為8000ppm含有納米金-鉑雙金屬納米顆粒的納米金溶液。

根據(jù)投料比，還原劑硼氫化鈉與氯金酸和氯鉑酸鉀的摩爾含量比為3:1，鉑的原子百分比為20％，因此該金-鉑納米顆粒可表示為Au₈₀Pt₂₀納米顆粒。

在該含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料中，經(jīng)ICP-OES測定，每片羧甲基纖維素鈉敷料的含金量為3％(質(zhì)量百分比)。經(jīng)200KV六硼化鑭透射電子顯微鏡測定，該敷料中的含金納米顆粒的平均粒徑為6nm。

對比例4

按照與實(shí)施例4相同的制備方法制得對比例4的納米金抗菌溶液，再加入一定量去離子水，使其與實(shí)施例4中的納米金羧甲基纖維素鈉敷料有相同的納米金質(zhì)量百分含量。

試驗(yàn)例2

將實(shí)施例2采用的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金抗菌溶液與商購含納米銀的抗菌溶液(購自張家港耐爾納米科技公司)的抗菌性能相比較，說明本發(fā)明的含該納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料也應(yīng)具有良好的抗菌性能。

比較方法如下：采用最小抑菌濃度MIC(mg/L)來衡量，采用微孔稀釋方法(National Committee for Clinical Laboratory Standards.，Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents,M26-A,1999.)，將100 μL不同濃度的納米金或納米銀加入到96微孔板中，10μL相同濃度(10⁴CFU/mL)的細(xì)菌培養(yǎng)液加入每個微孔中，37℃培養(yǎng)24小時后觀察，沒有可看見的細(xì)菌生長的微孔中最小的納米金或納米銀的濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。測試結(jié)果見表2。

從測試結(jié)果可見，實(shí)施例2的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份修飾的納米金抗菌溶液的大腸桿菌和綠膿桿菌的MIC都小于商購含納米銀的抗菌溶液的MIC，由此說明，實(shí)施例2對大腸桿菌和綠膿桿菌的抗菌性能優(yōu)于商購含納米銀的抗菌溶液。

表2實(shí)施例2納米金抗菌溶液與商購含納米銀的抗菌溶液的抗菌性能比較結(jié)果

試驗(yàn)例3

通過不同納米金含量的敷料抑菌圈實(shí)驗(yàn)，來說明含納米金的抗菌羧甲基纖維素鈉敷料的抑菌活性。

按照《藥品微生物檢驗(yàn)手冊》第18章第1節(jié)管碟法進(jìn)行試驗(yàn)，對實(shí)施例1-4和對比例1-4進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表3。空白羧甲基纖維素鈉的抑菌圈為10mm，抑菌圈大小為羧甲基纖維素鈉樣品的原始大小，沒有抑菌效果。

測試結(jié)果可見，盡管各實(shí)施例的納米金質(zhì)量百分比和類型不同，但均可觀察到明顯的抑菌圈，說明含納米金的羧甲基纖維素鈉敷料對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均有良好的抑菌效果。且同一濃度同一類型的含納米金的羧甲基纖維素鈉敷料的抑菌圈均大于納米金抗菌溶液，說明含納米 金的羧甲基纖維素鈉敷料的抑菌效果要優(yōu)于有相同納米金含量相同納米金類型的納米金抗菌溶液。

表3不同納米金含量的羧甲基纖維素鈉敷料和溶液抑菌圈測試結(jié)果(單位：mm)

試驗(yàn)例4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞毒性試驗(yàn)操作過程：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在含有10％牛胎血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。在96微孔板的每個孔中加入10⁴個HUVEC細(xì)胞，每個孔中分別加入含不同濃度的不透析處理、快速加入還原劑生產(chǎn)出的4,6-2氨基-2-巰基嘧啶/二甲雙胍作為雙組份小分子修飾的納米金溶液、商購納米銀、商購硝酸銀溶液200微升。以微孔介質(zhì)中37℃下培養(yǎng)48小時，沒有加入抗菌劑的HUVEC細(xì)胞作為對照。培養(yǎng)完后，微孔中的溶液用磷酸緩沖溶液(PBS，0.01mol/L，pH 7.4)洗一次，加入10％(v/v)的CCK-8溶液在微孔介質(zhì)中，在37℃下培養(yǎng)2小時。在酶聯(lián)免疫檢測儀450nm處測量各樣品孔以及對照孔的吸光值。計算各個樣品孔細(xì)胞相對活力。各樣品孔細(xì)胞相對活力定義為：各個孔吸光值/對照孔的吸光值×100％。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

從圖2所示的試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明采用的納米金溶液在不同濃度下的細(xì)胞毒性均明顯低于商購納米銀和商購硝酸銀溶液。

盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各個條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。