本發(fā)明涉及一種制備止血海綿的方法，特別涉及一種通過兩步冷凍法制備高效止血海綿的方法，屬于醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著社會的發(fā)展，人們對外傷止血材料的要求越來越高。蛋白類可吸收性止血材料被認為是局部外傷最有效的生物醫(yī)用止血材料之一，具有可吸收、高效、經(jīng)濟和無毒害等優(yōu)點，它主要是通過自身材料特征與優(yōu)勢，吸附血液，凝膠血小板，堵塞血管，促進凝血酶產(chǎn)生，從而達到止血作用。目前生物醫(yī)用材料的止血過程一般包括三個方面，（1）材料自身的吸液性能夠迅速的吸收滲血，溶脹后會貼合在傷口上，堵塞血管并產(chǎn)生一定壓力，對傷口起到壓迫止血作用；（2）材料自身能夠吸附血小板，使其粘附聚集于傷口，堵塞血管；（3）促進凝血酶的產(chǎn)生達到止血的最終目的。

膠原蛋白海綿利用大面積結(jié)構(gòu)破壞血小板促進凝血，膠原蛋白在創(chuàng)面溶解和降解，使創(chuàng)面局部粘著性發(fā)生變化，從而促進凝血作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種外部形貌致密，內(nèi)部孔徑大小均勻，止血速度快且生物相容性良好的醫(yī)用止血海綿的制備方法。

本發(fā)明實現(xiàn)過程如下：

一種止血海綿的制備方法，包括以下步驟：

（1）向質(zhì)量體積比g/mL為1～15%的類人膠原蛋白溶液中加入山梨醇，山梨醇加入量為類人膠原蛋白質(zhì)量的1～10%；

（2）向類人膠原蛋白和山梨醇的混合溶液中加入甘油，甘油加入量為類人膠原蛋白質(zhì)量的1～10%；

（3）向步驟（2）得到的混合溶液中加入類人膠原蛋白質(zhì)量1～10%的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶在4℃交聯(lián)12-36 h；

（4）將交聯(lián)后的溶液轉(zhuǎn)移到底部預(yù)凍冰層的容器中，再置于-80℃冰箱中冷凍2-5小時；

（5）-80℃冷凍后的樣品經(jīng)冷凍干燥后滅菌即可得到止血海綿。

本發(fā)明在容器底部預(yù)凍一層冰，將4℃交聯(lián)的混合液放入底部預(yù)凍一層冰的容器中為第一步冷凍，進一步放入-80℃冰箱中冷凍為第二步冷凍。該兩步冷凍法在保證樣品底部形貌有所改善的同時提高了樣品表面的平整性和內(nèi)部孔徑大小的均勻性，提高了海綿的止血效果。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：（1）本發(fā)明通過兩步冷凍法改變了樣品的形貌，克服了樣品與容器接觸面會產(chǎn)生條紋狀裂痕的缺點；（2）兩步冷凍法制備的止血海綿止血性能更優(yōu)，不會發(fā)生滲血現(xiàn)象，同時縮短了止血時間；（3）本發(fā)明制備的止血海綿具有良好的生物學(xué)相容性，不與體內(nèi)組織產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)；（4）本發(fā)明兩步冷凍方法簡單，易快速實現(xiàn)，應(yīng)用于臨床可實現(xiàn)大批量快速生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為兩步冷凍法所制備的止血材料的表觀和微觀形貌圖；

圖2為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿細胞毒性試驗結(jié)果；

圖3為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿兔子皮下植入效果對比圖；

圖4為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血效果圖；

圖5為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血時間對照圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖具體實施方式對本發(fā)明進行詳細的說明。

本發(fā)明用類人膠原蛋白作為止血海綿的主要原料，其中類人膠原蛋白是將用于指導(dǎo)合成人膠原蛋白的mRNA片段進行特定的酶切，然后經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄形成其互補DNA，然后進行特定合成酶與連接酶的作用后形成完整的DNA片段并轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，從而得到較高的表達，最終經(jīng)過高密度發(fā)酵、分離、復(fù)性以及純化工藝生產(chǎn)得到最終的高分子生物蛋白。其分子也具有三螺旋結(jié)構(gòu)，并且這種類人膠原蛋白還有獨特的水溶性，利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶作為交聯(lián)劑，采用兩步冷凍法制備出了一種外部形貌致密，內(nèi)部孔徑大小均勻，止血速度快且生物相容性良好的醫(yī)用止血海綿。

實施例1

步驟一：將100 mg類人膠原蛋白溶于10 mL超純水中，得到濃度為 10 mg/mL的類人膠原蛋白溶液，將配制好的溶液用紗布過濾；

步驟二：向配制好的蛋白溶液中加入10 mg的山梨醇，攪拌約5 min；

步驟三：接著向類人膠原蛋白和山梨醇的混合溶液中加入10 mg的甘油；

步驟四：向上述混合溶液中加入10 mg的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，攪拌均勻后立即放入4℃冰箱交聯(lián)24 h；

步驟五：將交聯(lián)后的溶液倒入底部預(yù)凍冰層的培養(yǎng)皿中，置于-80℃冰箱中冷凍5小時；

步驟六：將一次性培養(yǎng)皿從-80 ℃冰箱中拿出來后，立即放入真空冷凍干燥箱中72 h凍干；

步驟七：凍干后的樣品滅菌即可得到成品止血海綿。

對比實例1（采用一次冷凍制備止血海綿）：

與上述實例類似，不同的是步驟五中的培養(yǎng)皿底部未預(yù)凍冰。

圖1為兩步冷凍法所制備的止血材料的表觀和微觀形貌圖，其中a，b分別為一步冷凍法制備的樣品的上下表面，e，f 是上下表面所對應(yīng)的掃描電鏡圖，c，d 分別為兩步冷凍法制備的樣品的上下表面，g，h是上下表面所對應(yīng)的掃描電鏡圖，圖中標(biāo)尺均為200μm。

圖2為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿細胞毒性試驗結(jié)果。

圖3為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿兔子皮下植入效果對比圖。其中，a，c和e分別是一步冷凍法制備止血海綿植入兔子皮下一周、兩周和四周后材料與周圍組織的變化圖，b，d和f分別是兩步冷凍法制備止血海綿植入兔子皮下一周、兩周和四周后材料與周圍組織的變化圖；

圖4為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血效果圖。其中a和d分別為兔耳動脈和兔子肝臟的創(chuàng)傷模型組，b和e是一步冷凍法制備的止血海綿分別對兔耳動脈和兔子肝臟的止血效果圖，c和f是兩步冷凍法制備的止血海綿分別對兔耳動脈和兔子肝臟的止血效果圖；

圖5為一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血時間對照圖。

對以上實施例1制備的海綿的外觀、內(nèi)部形貌，體外細胞毒性、體內(nèi)生物相容性和止血性能以及止血時間進行了分析，其分析結(jié)果如下：

1.本發(fā)明制得的止血海綿的外觀及內(nèi)部形貌如圖1所示，可以明顯的看到與一步冷凍法制備的止血海綿相比，兩步冷凍法制備的止血海綿的底部形貌有很大的改善，底部形貌比之前致密且均勻。為了進一步驗證這個結(jié)果，我們通過掃描電鏡對其內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)進行了觀察，掃描電鏡結(jié)果顯示，海綿底部由之前的條狀裂痕變成致密的孔結(jié)構(gòu)，而且上表面的內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)較一步冷凍法均勻。均勻的孔結(jié)構(gòu)有利于提高材料的機械性能和吸水性能，吸水性能的提高有助于血小板在傷口處的聚集，從而提高止血效果。

2.圖2是一步冷凍法和兩步冷凍法制備的兩種止血海綿的細胞毒性。從圖2我們可知，兩種海綿的浸提液與細胞共培養(yǎng)3天后，兩組細胞的相對增殖率都可以達到100%，這表明兩組材料都具有良好的細胞相容性，這說明本發(fā)明制備的凝膠細胞相容性良好，兩組細胞的活性在1天時之所以較低，可能是因為細胞對海綿的浸提液有一個適應(yīng)的過程，一旦適應(yīng)了之后，細胞就可實現(xiàn)快速的生長增殖。

3. 一步冷凍法和兩步冷凍法制備的止血海綿滅菌后植入兔子皮下進行體內(nèi)相容性實驗。實驗結(jié)果如圖3所示，一步冷凍組海綿植入兔子皮下2周后，海綿周圍有輕微的炎癥反應(yīng)，4周后，我們發(fā)現(xiàn)材料周圍炎癥反應(yīng)基本已經(jīng)消失，而兩步冷凍法制備的止血海綿，植入皮下1周后，我們發(fā)現(xiàn)材料周圍已經(jīng)有新血管生成，這表明皮下植入材料不同的形貌對其生物相容性有一定的影響，這是因為不同的形貌可能會影響海綿的降解性能，從而會影響材料的生物相容性，通過比較我們發(fā)現(xiàn)，與一步冷凍海綿相比，兩步冷凍海綿具有更好的生物相容性，植入皮下后不會與組織產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

4. 圖4展示了對本發(fā)明制得的止血凝膠對兔耳止血（a-c）和肝臟止血(d-f)的效果，由圖可以明顯的看到兩步冷凍海綿止血后未發(fā)生滲血現(xiàn)象，而一步冷凍海綿有輕微的滲血現(xiàn)象，這是因為兩步冷凍海綿結(jié)構(gòu)更致密，孔結(jié)構(gòu)更均勻。

5. 圖5記錄了一步冷凍海綿和兩步冷凍海綿對兔耳動脈和兔子肝臟的止血時間，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩步冷凍海綿縮短了止血時間，這是因為均勻的孔結(jié)構(gòu)可以增加海綿的表面積，從而提高其止血效率，這充分體現(xiàn)了兩步冷凍海綿在止血方面的優(yōu)勢。

實施例2

步驟一：將1g類人膠原蛋白溶于10 mL超純水中，得到濃度為 100 mg/mL的類人膠原蛋白溶液，將配制好的溶液用紗布過濾；

步驟二：向配制好的蛋白溶液中加入50 mg的山梨醇，攪拌約5 min；

步驟三：接著向類人膠原蛋白和山梨醇的混合溶液中加入100 mg的甘油；

步驟四：向上述混合溶液中加入50 mg的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，攪拌均勻后立即放入4℃冰箱交聯(lián)24 h；

步驟五：將交聯(lián)后的溶液倒入底部預(yù)凍冰層的培養(yǎng)皿中，置于-80℃冰箱中冷凍5小時；

步驟六：將一次性培養(yǎng)皿從-80 ℃冰箱中拿出來后，立即放入真空冷凍干燥箱中72 h凍干；

步驟七：凍干后的樣品滅菌即可得到成品海綿。

其他實施案例

包括：（1）不改變原料，僅改變相關(guān)參數(shù)的操作，如濃度、體積和溫度等；或引入少量其他物質(zhì)，但并未改變反應(yīng)的基本原理；（2）工藝方法上的簡并、變換和調(diào)整。如將本實驗中的保濕劑山梨醇和甘油換做其他保濕劑等。

本發(fā)明的內(nèi)容不限于上述實施案例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，不改變基本原理的調(diào)整均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。